響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶輔助超聲波提取柚子皮總黃酮工藝

劉媛潔1,張 良

(1.江西醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校,江西上饒 334000; 2.江西省食品發(fā)酵研究所,江西宜春 336000)

柚子(Citrusgrandis)為蕓香科柑橘屬的植物果實(shí)[1],主要產(chǎn)區(qū)是南方地域[2-3]。柚子屬于藥食兩用水果,性寒,味清香、酸爽,含有黃酮、多酚、果膠、膳食纖維、多糖、有機(jī)酸、維生素和微量礦物元素等多種有益成分[4-6],其中,柚子皮中含有以柚皮苷和橙皮苷為主要物質(zhì)的黃酮類(lèi)化合物[7-9],具有理氣消痰、健胃消食、預(yù)防動(dòng)脈硬化、降血脂、抗氧化等功效[10-12]。我國(guó)柚子產(chǎn)量高,資源豐富[13],而柚子皮的重量占整個(gè)果實(shí)的30%～50%[14-15],可見(jiàn),對(duì)柚子皮的綜合利用與開(kāi)發(fā)是十分必要的。

目前,柚子皮中總黃酮的提取方法多采用溶劑浸提取法、堿提酸沉法、超聲波提取法、微波提取法等[16],例如:何穎[17]采用50%乙醇溶液提取總黃酮得率為0.625%;鄭培君等[18]采用80%乙醇溶液結(jié)合三因素三水平的響應(yīng)面分析方法提取總黃酮的得率為0.864%;李敏等[19]采用乙醇浸提超聲波輔助提取總黃酮的得率為0.6225%。超聲波提取法是利用其產(chǎn)生的空化作用有效地破壞組織的細(xì)胞壁,使胞內(nèi)的活性成分更好地流出到溶劑中,從而達(dá)到提高提取率的效果[20]。酶解提取法是利用具有專(zhuān)一性和高效性的酶來(lái)分解破壞植物細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)等組織結(jié)構(gòu),使細(xì)胞內(nèi)活性成分更易溶出與擴(kuò)散,從而提高提取效率[21]。酶法超聲波輔助提取法能有效結(jié)合酶解提取法和超聲提取法的優(yōu)點(diǎn),能協(xié)同有效地提高提取效率,用時(shí)短,應(yīng)用性強(qiáng)[22],但以酶法結(jié)合超聲波輔助提取柚子皮中總黃酮的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以酶法超聲波輔助提取柚子皮中總黃酮,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ),運(yùn)用Plackett-Burnman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析篩選出顯著性影響要素因子,進(jìn)一步采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了柚子皮中的總黃酮提取條件,可為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柚子 產(chǎn)自江西廣豐的馬家柚;纖維素酶(2萬(wàn)U/g)、果膠酶(3萬(wàn)U/g) 北京索萊寶科技有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%) 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;Al(NO3)3、NaOH、NaNO2、乙醇 均為分析純,北京索萊寶科技有限公司;去離子水 實(shí)驗(yàn)室自制;其他試劑 均為分析純。

XA-1型固體樣品粉碎機(jī) 常州市金壇區(qū)環(huán)宇科學(xué)儀器廠(chǎng);HWS-24型恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DSA300-XN2型超聲波儀 福州德森精工有限公司;FA6103C型電子天平 上海精科天美有限公司;3K15型冷凍離心機(jī) Sigma;DZF6020型電熱鼓風(fēng)干燥箱 無(wú)錫萊蒲儀器設(shè)備有限公司;PHSJ-4F型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;TU-1900型分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柚子皮的預(yù)處理 將新鮮廣豐馬家柚剝下的皮切成5 cm2碎塊,在60 ℃下干燥24 h,粉碎后過(guò)60目篩,將制備好的柚子粉末放入干燥器中密封備用。

1.2.2 柚子皮中總黃酮提取工藝 稱(chēng)取5 g處理好的柚子皮粉末置于500 mL錐形瓶中,以一定的料液比添加濃度為80%的乙醇溶液浸泡12 h,根據(jù)柚子皮的質(zhì)量比例加入一定量的復(fù)合酶(纖維素酶和果膠酶),在一定的pH和溫度下進(jìn)行水浴酶解(30 min混勻一次)后,100 ℃水浴滅酶活5 min。然后,再加入100 mL濃度為80%的乙醇溶液,在一定的超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間下對(duì)上述酶解液進(jìn)行超聲處理,最后對(duì)超聲處理的樣品溶液離心后取上清液。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以復(fù)合酶的配比、復(fù)合酶的用量、pH、料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲功率、超聲時(shí)間為要素因子,研究各要素因子對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.1 復(fù)合酶的配比 按照“1.2.2”的方法,固定料液比為1∶20,復(fù)合酶的用量為1.0%，pH4.0,酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間為90 min,超聲功率為220 W,超聲時(shí)間為60 min,考察纖維素酶與果膠酶的配比(1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1 g/g)對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 復(fù)合酶的用量 在上述優(yōu)化復(fù)合酶的配比的基礎(chǔ)上,固定料液比為1∶20,pH4.0,酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間為90 min,超聲功率220 W,超聲時(shí)間為60 min,考察復(fù)合酶的用量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.3 pH 在上述優(yōu)化的復(fù)合酶的配比和復(fù)合酶的用量的基礎(chǔ)上,固定料液比為1∶20,酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間為90 min,超聲功率220 W,超聲時(shí)間為60 min,考察pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.4 料液比 在上述優(yōu)化的復(fù)合酶的配比、復(fù)合酶的用量和pH的基礎(chǔ)上,固定酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間為90 min,超聲功率220 W,超聲時(shí)間為60 min,考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.5 酶解溫度 在上述優(yōu)化的復(fù)合酶的配比、復(fù)合酶的用量、pH和料液比的基礎(chǔ)上,固定酶解時(shí)間為90 min,超聲功率為220 W,超聲時(shí)間為60 min,考察酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.6 酶解時(shí)間 在上述優(yōu)化的復(fù)合酶的配比、復(fù)合酶的用量、pH、料液比和酶解溫度的基礎(chǔ)上,固定超聲功率為220 W,超聲時(shí)間為60 min,考察酶解時(shí)間(30、45、60、75、90 min)對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.7 超聲功率 在上述優(yōu)化的復(fù)合酶的配比、復(fù)合酶的用量、pH、料液比、酶解溫度和酶解時(shí)間的基礎(chǔ)上,固定超聲時(shí)間為60 min,考察超聲功率(100、140、180、220、260 W)對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.3.8 超聲時(shí)間 在上述優(yōu)化的復(fù)合酶的配比、復(fù)合酶的用量、pH、料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間和超聲功率的基礎(chǔ)上,考察超聲時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響。

1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 當(dāng)實(shí)驗(yàn)中要素因子較多時(shí),可選用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì),可通過(guò)分析比較各因素效應(yīng)值及其顯著性,篩選出有顯著影響的因素[23-24]。以柚子皮中的總黃酮得率為響應(yīng)值,單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),選取復(fù)合酶的配比(纖維素酶∶果膠酶)、復(fù)合酶的用量、pH、料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲功率、超聲時(shí)間共8個(gè)因素的水平值,選用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)確定顯著性影響因素,為進(jìn)一步的Box-Behnken試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在Plackett-Burman試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以復(fù)合酶的用量、酶解溫度、超聲功率和超聲時(shí)間為自變量,以柚子皮中總黃酮得率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.6 總黃酮得率的測(cè)定

1.2.6.1 吸收波長(zhǎng)的選擇 分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和柚子皮提取液,以乙醇溶液為空白對(duì)照,紫外分光光度計(jì)在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果表明,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和柚子皮提取液在510 nm波長(zhǎng)下均有最大吸收,由此確定510 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.6.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的的繪制 參考趙國(guó)超、鄭麗等的方法[25-26],稍加修改。精確稱(chēng)取20 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品放于10 mL容量瓶中,濃度為80%的乙醇定容后搖勻,獲得質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。六支10 mL具塞管中分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,各管中再分別加入80%的乙醇3.0 mL和5% 的NaNO2溶液0.5 mL,搖勻后靜置10 min;然后各管中分別加入14% Al(NO3)3溶液0.5 mL,搖勻后靜置10 min;各管中再加入4% NaOH溶液3.0 mL;最后用80%乙醇定容至10.0 mL,搖勻后靜置8 min。510 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值,同時(shí)做空白對(duì)照,經(jīng)計(jì)算線(xiàn)性回歸方程為:y=0.8058x+0.0224,R2=0.9992,其中y為吸光度,x為蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL),根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,蘆丁在0.1～0.6 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

1.2.6.3 總黃酮得率的計(jì)算 將1.2.2獲得的上清液液定容到200 mL,取1 mL置于10 mL具塞管中,按“1.2.6.2”方法測(cè)得吸光度值,將其代入“1.2.6.2”回歸方程中計(jì)算柚子皮總黃酮提取液的質(zhì)量濃度?？傸S酮得率的計(jì)算公式如下:

式中:C為柚子皮總黃酮提取液的質(zhì)量濃度(mg/mL);V為樣品定容體積(mL);N為測(cè)定時(shí)樣液的稀釋倍數(shù);M為浸提用的柚子皮粉末的質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差,運(yùn)用Excel軟件繪制趨勢(shì)曲線(xiàn)圖。采用JMP Trial 14軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理,用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 復(fù)合酶的配比對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖1可知,柚子皮中總黃酮得率隨著纖維素酶添加比例的增加,呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)纖維素酶和果膠酶的配比為3∶2時(shí),總黃酮得率達(dá)最大值為0.86%,纖維素酶添加比例繼續(xù)增加時(shí),總黃酮得率呈下降趨勢(shì)?？赡苁请S著纖維素酶的比例增加,能更好地破壞柚子皮的細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì),使得細(xì)胞中的總黃酮等活性成分更好地溶出,但隨著纖維素酶比例的增加,底物濃度不能對(duì)復(fù)合酶達(dá)到飽和,復(fù)合酶的作用受到抑制,導(dǎo)致柚子皮總黃酮得率并沒(méi)有增加。所以,選擇纖維素酶和果膠酶的配比為3∶2。

圖1 復(fù)合酶的配比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of complex enzyme ratio on the yield of total flavonoids

2.1.2 復(fù)合酶的用量對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖2可知,柚子皮中總黃酮得率隨著復(fù)合酶的用量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)復(fù)合酶的用量達(dá)到1.5%時(shí),總黃酮得率為最大值為1.02%。當(dāng)復(fù)合酶的用量大于1.5%時(shí),總黃酮得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)?？赡苁请S著復(fù)合酶用量的增加能更好地破壞細(xì)胞壁,有助于總黃酮的溶出,總黃酮得率逐漸增加;當(dāng)復(fù)合酶的用量超過(guò)1.5%后,隨著復(fù)合酶的用量的增加,底物濃度不能使酶達(dá)到飽和,導(dǎo)致了酶的作用受到抑制,總黃酮得率不再增加[27]。所以,選擇復(fù)合酶的用量為1.5%。

圖2 復(fù)合酶的用量對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of complex enzyme dosage on the yield of total flavonoids

2.1.3 pH對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響 實(shí)驗(yàn)用纖維素酶的最適pH在4.0～6.5,果膠酶的最適pH在3.0～6.0之間。由圖3可知,在pH在3.0～5.0時(shí),柚子皮中總黃酮得率隨著pH的增大,呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)pH為4.5時(shí),柚子皮中總黃酮得率達(dá)最大值為1.29%。pH為4.5時(shí),纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶活力為最佳值,使得細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)破壞率高,總黃酮等活性成分能更好地溶出,總黃酮得率相對(duì)較大[28]。所以,選擇酶解時(shí)的pH為4.5。

圖3 pH對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of pH on the yield of total flavonoids

2.1.4 料液比對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖4可知,隨著料液比的增大,柚子皮中總黃酮得率呈現(xiàn)先增加而后平緩略有下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶20 g/mL時(shí),柚子皮中總黃酮得率達(dá)最大值為1.24%?？赡苁请S著料液比的增大,一方面溶劑量逐漸增加,總黃酮溶出逐漸增加,另一方面酶與底物反應(yīng)更充分,酶解效果較好,總黃酮得率逐漸增加;當(dāng)料液比超過(guò)1∶20 g/mL后,繼續(xù)增加料液比,相對(duì)于稀釋了酶與底物的濃度,酶解的效果變差,導(dǎo)致總黃酮得率略有下降[29]。所以,選擇料液比為1∶20 g/mL。

圖4 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on the yield of total flavonoids

2.1.5 酶解溫度對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖5可知,隨酶解溫度的升高,柚子皮中總黃酮得率呈現(xiàn)先增加后明顯減少的趨勢(shì)。當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí),總黃酮得率達(dá)最大值為1.25%?？赡苁请S著溫度的增加,復(fù)合酶的活性逐漸升高,酶與底物反應(yīng)速率逐漸增加,總黃酮得率逐漸增加;當(dāng)酶解溫度超過(guò)50 ℃后,纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶活力有所降低,酶解效率降低,導(dǎo)致總黃酮得率有明顯減少的趨勢(shì)。所以,選擇酶解溫度為50 ℃。

圖5 酶解溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of total flavonoids

2.1.6 酶解時(shí)間對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖6可知,柚子皮中總黃酮得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),呈現(xiàn)先增加后緩慢減少的趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間為60 min時(shí),總黃酮得率達(dá)最大值為1.46%。分析原因,可能是隨著酶解時(shí)間的增加,酶活力得到充分的利用,酶解反應(yīng)更完全,總黃酮溶出增加,總黃酮得率逐漸增加;當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)60 min后繼續(xù)酶解,不但不會(huì)提高提取效率,可能還會(huì)導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)遭到破壞[30]。所以,選擇酶解時(shí)間為60 min。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of total flavonoids

2.1.7 超聲功率對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖7可知,柚子皮中總黃酮得率隨著超聲功率的增大,呈現(xiàn)先增加而后減少的趨勢(shì)。當(dāng)超聲功率為180 W時(shí),柚子皮中總黃酮得率達(dá)最大值為1.62%?？赡苁请S著超聲功率逐漸增加,物料底物能充分地受到超聲波的作用,總黃酮得率逐漸增加;當(dāng)超聲功率超過(guò)180 W后,繼續(xù)增大超聲功率,會(huì)顯著破壞總黃酮的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致總黃酮得率的減少[31]。所以,選擇超聲功率為180 W。

圖7 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids

2.1.8 超聲時(shí)間對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響 由圖8可知,柚子皮中總黃酮得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí),柚子皮中總黃酮得率達(dá)最大值為2.07%?？赡苁请S著超聲時(shí)間的增加,能更好地破壞細(xì)胞壁,使得細(xì)胞內(nèi)容物總黃酮溶出增加,總黃酮得率逐漸增加;當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到一定值后繼續(xù)增加,超聲會(huì)破壞總黃酮等物質(zhì)的結(jié)構(gòu),選用JMP軟件對(duì)表3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表4和表5。由表4可知,該模型(P<0.01)極顯著。由表5可知,因素X2(復(fù)合酶的用量)、X5(酶解溫度)、X8(超聲時(shí)間)對(duì)柚子皮中總黃酮得率影響極顯著(P<0.01);因素X7(超聲功率)對(duì)柚子皮中總黃酮得率影響顯著(P<0.05),所以選擇X2、X5、X8、X7共4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。因素X3(pH)、X4(料液比)、X1(復(fù)合酶的配比)和X6(酶解時(shí)間)對(duì)柚子皮中總黃酮得率影響不顯著,所以在后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)中X3、X4、X1和X6共4個(gè)因素的條件固定為:pH4.5、料液比1∶20 g/mL、復(fù)合酶的配比3∶2、酶解時(shí)間60 min。

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的各因素水平及響應(yīng)值Table 3 Levels of various factors and response results of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的方差分析表Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman design

表5 偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 5 Partial regression coefficients and their significance test

圖8 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見(jiàn)表3,方差分析結(jié)果見(jiàn)表4,偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表5。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。表6中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Design-Expert 7.0軟件處理,得到回歸模型的方差分析,結(jié)果見(jiàn)表7。經(jīng)非線(xiàn)性回歸的二次多項(xiàng)式擬合,得到預(yù)測(cè)模型如下:

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results for response surface experiment

Y=-10.3584+2.6902A+0.2420B+0.0182C+0.0931D-1.0003A2-0.0025B2-0.0001C2-0.0013D2+0.0095AB+0.0031AC-0.0080A D-0.00002BC+0.0004BD+0.00005CD

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

響應(yīng)面可以反映因素之間的影響程度,其中影響越大,曲面越陡峭[33]。圖9反映了四個(gè)因素的交互作用對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響?？梢?jiàn),復(fù)合酶的用量與超聲功率的交互作用對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響顯著(P<0.05);復(fù)合酶的用量與酶解溫度、復(fù)合酶的用量與超聲時(shí)間、酶解溫度與超聲功率、酶解溫度與超聲時(shí)間和超聲功率與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)柚子皮中總黃酮得率的影響不顯著(P>0.05)。根據(jù)對(duì)柚子皮中總黃酮得率的二次多項(xiàng)回歸方程求解,得到最佳提取工藝條件為:復(fù)合酶的用量1.73%、酶解溫度54.98 ℃、超聲功率183.43 W,超聲時(shí)間41.37 min,在此最佳條件下,總黃酮得率理論上可達(dá)2.22%。

圖9 交互項(xiàng)對(duì)總黃酮得率影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface showing the effect of interaction terms on the yield of total flavonoids

考慮實(shí)驗(yàn)可操作性,修正最佳的提取工藝條件為:復(fù)合酶的用量1.70%、酶解溫度55.0 ℃、超聲功率183.00 W,超聲時(shí)間41.00 min,在此條件下,3次平行試驗(yàn)后,實(shí)測(cè)總黃酮得率的平均值為 2.19%,與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為 1.4%,表明該模型擬合程度較好,驗(yàn)證了該模型的可靠性。

3 結(jié)論

本研究首次采用酶法結(jié)合超聲波輔助提取方法,應(yīng)用于柚子皮中總黃酮的提取工藝中。首先,基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,運(yùn)用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出了具有顯著影響的因素,再進(jìn)一步用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了具有顯著性影響的因素,最終確定最佳的提取工藝條件為:復(fù)合酶的配比(纖維素酶∶果膠酶)為3∶2、復(fù)合酶的用量1.70%、pH4.5、料液比1∶20 g/mL、酶解溫度55.0 ℃、酶解時(shí)間60 min、超聲功率183.00 W、超聲時(shí)間41.00 min。在此條件下,進(jìn)行3次平行試驗(yàn)后實(shí)測(cè)柚子皮中總黃酮得率的平均值為2.19%。本實(shí)驗(yàn)得到的總黃酮得率與何穎[24]、鄭培君等[11]和李敏等[29]相比分別提高了2.5倍、1.53倍和2.51倍,本方法提取效率相對(duì)較高?？梢?jiàn),酶法-超聲波輔助提取方法應(yīng)用于柚子皮中總黃酮的提取中效果較好,工藝簡(jiǎn)單,復(fù)制性強(qiáng),可為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。