不同暫養(yǎng)添加物對(duì)Cd2+脅迫的紫貽貝機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用

邱愚蘅,孫孟輝,王 欣,張 賓

(浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022)

紫貽貝(Mytilusedulis)俗稱(chēng)淡菜、海虹,是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類(lèi),具有味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn),而深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎。近年來(lái),貽貝等雙殼貝類(lèi)水產(chǎn)動(dòng)物的暫養(yǎng),已由原先的大水體、低密度的粗放型暫養(yǎng),轉(zhuǎn)變?yōu)樾∷w、高密度的集約化暫養(yǎng),由此而帶來(lái)的是水產(chǎn)動(dòng)物免疫機(jī)能下降較快和感染各種疾病、病毒的危險(xiǎn)性增加[1]。在雙殼貝類(lèi)水產(chǎn)動(dòng)物暫養(yǎng)(或養(yǎng)殖)過(guò)程中,使用抗生素進(jìn)行病害防治,會(huì)導(dǎo)致大量抗藥性細(xì)菌產(chǎn)生,并對(duì)環(huán)境造成殘留污染,給人類(lèi)食品安全性帶來(lái)隱患[2]。使用綠色免疫調(diào)節(jié)劑,可有效改善水產(chǎn)動(dòng)物的免疫機(jī)能和對(duì)外界惡劣環(huán)境的抗逆性。但是,目前貽貝類(lèi)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)劑研究,還面臨諸多問(wèn)題待解決,如免疫調(diào)節(jié)劑種類(lèi)較少、使用劑量差別較大、作用效果較為有限等。

重金屬鎘(Cd2+)作為環(huán)境中常見(jiàn)的污染物,是已知生物體內(nèi)最易積累的毒物之一,已被美國(guó)毒理管理委員會(huì)列為第6位危及人體健康的有毒物質(zhì)。近年來(lái),工業(yè)“三廢”的排放、含重金屬農(nóng)藥和化肥的不合理使用,使得大量金屬元素特別是人體非必需的重金屬,通過(guò)各種途徑進(jìn)入地表水。甲殼類(lèi)水產(chǎn)動(dòng)物是對(duì)重金屬富集能力最強(qiáng)的水生動(dòng)物類(lèi)群之一。從單次污染指數(shù)及污染物負(fù)荷比來(lái)看,Cd2+對(duì)貽貝類(lèi)的生理機(jī)能影響最大。低劑量的Cd2+在貽貝機(jī)體內(nèi)不斷富集,對(duì)其免疫防御系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損害,導(dǎo)致其抗病力下降,甚至大批量的死亡[3]。目前,關(guān)于Cd2+在貽貝類(lèi)機(jī)體組織中的生物富集、毒害作用及對(duì)相關(guān)保護(hù)酶活性變化情況等,國(guó)內(nèi)外已有不少研究及報(bào)道[4-6],而有關(guān)Cd2+污染脅迫后紫貽貝機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)及恢復(fù)作用研究,國(guó)內(nèi)外還鮮見(jiàn)報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),采用60和120 mg/L硒化卡拉膠、160 mg/L EDTA-CaNa2和500 mg/Lβ-葡聚糖添加物飼喂,對(duì)暫養(yǎng)紫貽貝體內(nèi)Cd2+具有良好的脫除效果,其脫除率分別為43.6%、37.2%、41.6%和44.6%。課題組前期僅對(duì)不同添加物對(duì)紫貽貝體內(nèi)Cd2+脫除效果進(jìn)行了探索,而對(duì)飼喂紫貽貝機(jī)體狀態(tài)及非特異性免疫情況,沒(méi)有進(jìn)行深入分析。本研究在前期研究基礎(chǔ)上,重點(diǎn)探索不同的暫養(yǎng)添加物對(duì)紫貽貝不同組織中抗氧化保護(hù)酶活力的影響情況,旨在找出一種有效的紫貽貝機(jī)體免疫調(diào)節(jié)劑及其應(yīng)用方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活體紫貽貝(Mytilusedulis) 殼長(zhǎng)為(9.0±0.5) cm,殼寬為(4.0±0.3) cm,殼高為(7.0±0.4) cm和體重為(56.0±3.4) g,購(gòu)于舟山市東河鮮活水產(chǎn)品市場(chǎng);養(yǎng)殖海水 取自舟山市附近海域,經(jīng)沉淀、砂濾處理后,進(jìn)行暫養(yǎng)紫貽貝試驗(yàn)。經(jīng)前期檢測(cè)分析,暫養(yǎng)海水中本底Cd2+濃度<0.04 μg/L,pH為7.8～8.0,鹽度為29‰～31‰;氯化鎘、亞硒酸鈉 上海沃凱化學(xué)試劑有限公司;硒化卡拉膠(DP 2～20,κ型) 上海甄準(zhǔn)試劑有限公司;卡拉膠寡糖(DP 2～10,κ型) 博智匯力生物科技有限公司;螺旋藻藻粉(飼料級(jí)) 上海光語(yǔ)生物科技有限公司;肝素鈉(MAS) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、酸性磷酸酶(ACP)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和酚氧化酶(PO)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Direct-Q3U型超純水制備機(jī) 美國(guó)Millipore公司;MDF-U53V型超低溫冰箱 日本SANYO公司;Tube Mill 100 Control型研磨機(jī) 德國(guó)IKA集團(tuán);CF16RN型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;751UVGD型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫貽貝暫養(yǎng) 挑選體格健壯、殼色正常及活力旺盛的紫貽貝樣品,經(jīng)海水清洗去除表面附著物后,置于直徑100 cm、高60 cm圓柱形聚乙烯桶中,進(jìn)行適應(yīng)性暫養(yǎng)。每個(gè)養(yǎng)殖桶中添加40 L海水。暫養(yǎng)期間投喂貝類(lèi)飼料用螺旋藻粉,隔日更換新鮮海水1次,每次換水量為總體積的3/4,24 h持續(xù)通氧,水體溫度17～18 ℃。每日剔除死亡及活力不強(qiáng)的紫貽貝個(gè)體。

1.2.2 Cd2+脅迫紫貽貝 經(jīng)適應(yīng)性暫養(yǎng)7 d后,挑選反應(yīng)靈敏、著絲正常的紫貽貝樣品,隨機(jī)放入養(yǎng)殖桶(30只/桶),添加40 L含0.40 mg/L CdCl2養(yǎng)殖海水,24 h持續(xù)通氧,隔日更換含0.40 mg/L CdCl2海水,更換量為海水總體積的3/4。Cd2+脅迫養(yǎng)殖為期7 d,期間仍然投喂螺旋藻粉(為保持貽貝機(jī)體活力),每天定期剔除死亡及活力不強(qiáng)的紫貽貝個(gè)體。

1.2.3 添加物飼喂處理 經(jīng)Cd2+脅迫養(yǎng)殖后,將紫貽貝樣品隨機(jī)分為以下各組:正常紫貽貝組(未經(jīng)Cd2+脅迫的紫貽貝)，Cd2+脅迫紫貽貝組，1.5、3 mg/L亞硒酸鈉飼喂組，60、120 mg/L硒化卡拉膠飼喂組，60、120 mg/L卡拉膠寡糖飼喂組。以上各組中,除去正常組外,均為Cd2+暴露脅迫養(yǎng)殖后的紫貽貝樣品。

不同添加物飼喂養(yǎng)殖為期15 d,每個(gè)養(yǎng)殖桶中添加海水40 L,隔日更換含有相同質(zhì)量濃度添加物的海水,更換量為海水總體積的3/4。為保持紫貽貝機(jī)體的生物活力,添加物飼喂期間仍然投喂螺旋藻粉,每隔5 d取樣1次,每次取樣5只紫貽貝,用超純水沖洗干凈,解剖后進(jìn)行組織樣品制備及抗氧化酶活力測(cè)定。

1.2.4 試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)勻漿液的制備 將紫貽貝撬開(kāi)貝殼后,解剖獲得完整貽貝肉,分離完整的紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)組織,濾紙吸干表面水分后,進(jìn)行稱(chēng)重,精確到0.001 g。將分離的內(nèi)臟團(tuán)加入到無(wú)菌生理鹽水(4 ℃),調(diào)節(jié)使其終濃度為0.3 g/mL后(便于酶活性測(cè)定),低溫高速勻漿后,在4 ℃條件下,10000 r/min離心20 min,上清液即為制備的紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)勻漿液樣品。

1.2.4.2 紫貽貝血淋巴的制備 將紫貽貝撬開(kāi)貝殼后,解剖獲得完整貽貝肉,采用濾紙吸干表面水分后,用經(jīng)MAS抗凝劑預(yù)洗過(guò)的注射器,于紫貽貝閉殼肌處抽取血淋巴液,立即注入低溫離心管中,同時(shí)加入等量MAS溶液作為抗凝緩沖液,然后在4 ℃條件下,8000 r/min離心10 min,上清液即為制備的紫貽貝血淋巴樣品。

1.2.4.3 酶活性指標(biāo)測(cè)定 采用試劑盒法測(cè)定紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)、血淋巴勻漿液樣品中,總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、酸性磷酸酶(ACP)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和酚氧化酶(PO)的活力,測(cè)定過(guò)程依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上試驗(yàn)及分析測(cè)定,至少3個(gè)平行樣品,結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同添加物對(duì)紫貽貝中T-SOD活力的影響

不同添加物對(duì)紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)、血淋巴中T-SOD活力影響,如表1所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨暫養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),各組紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)中T-SOD活力均呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05),其原因主要是由于Cd2+暴露脅迫及相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間暫養(yǎng)而導(dǎo)致。暫養(yǎng)15 d后,正常紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)中T-SOD活力下降28%,Cd2+脅迫紫貽貝組則下降47%,二者差異顯著(P<0.05),表明Cd2+的生物富集對(duì)貽貝生理功能產(chǎn)生了較大影響。與Cd2+脅迫組相比,亞硒酸鈉和低濃度硒化卡拉膠對(duì)內(nèi)臟團(tuán)中T-SOD活力未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。相比于Cd2+脅迫和正常紫貽組,卡拉膠寡糖和較高濃度硒化卡拉膠對(duì)內(nèi)臟團(tuán)中T-SOD活力,具有顯著恢復(fù)作用(P<0.05),其效果顯著優(yōu)于其它各添加物處理組。對(duì)血淋巴中T-SOD活力,正常紫貽貝組隨暫養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),未發(fā)生顯著性變化(P>0.05)。對(duì)于Cd2+脅迫紫貽貝組,血淋巴中T-SOD活力顯著下降(P<0.05),主要是機(jī)體內(nèi)富集的Cd2+對(duì)貽貝機(jī)體產(chǎn)生較大的氧化脅迫作用,致使機(jī)體發(fā)生持續(xù)性的氧化損傷。亞硒酸鈉、硒化卡拉膠和卡拉膠寡糖,對(duì)氧化損傷的紫貽貝血淋巴中T-SOD活力具有顯著的恢復(fù)效果(P<0.05)。

表1 不同添加物對(duì)紫貽貝中T-SOD活力的影響(U/mg)Table 1 Effect of different additives on the activity of T-SOD in Mytilus edulis(U/mg)

SOD是廣泛存在于需氧生物體內(nèi)的一種金屬酶,其在機(jī)體抗氧化酶類(lèi)中處于核心地位,具體通過(guò)催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng),從而在預(yù)防疾病、提高機(jī)體免疫力等方面發(fā)揮重要作用[7]。對(duì)于多數(shù)生物體,重金屬Cd2+進(jìn)入機(jī)體后,會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化脅迫作用,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量自由基,生物體為清除這些自由基,會(huì)表現(xiàn)出“毒物興奮效應(yīng)”,即刺激SOD活性的短暫升高;但隨暴露時(shí)間延長(zhǎng),生物體內(nèi)活性氧超過(guò)SOD清除能力時(shí),就會(huì)產(chǎn)生“毒物抑制效應(yīng)”,總體表現(xiàn)為SOD活力先升高后下降的趨勢(shì),因此機(jī)體中SOD活力大小在一定程度上可反應(yīng)機(jī)體的健康狀況[8]。本研究中,卡拉膠寡糖對(duì)Cd2+脅迫產(chǎn)生的氧化損傷具有較好的修復(fù)作用,其可能與卡拉膠寡糖分子在體內(nèi)清除自由基活性有關(guān)。Yuan等[9]研究表明,由卡拉膠降解制備的卡拉膠寡糖及其衍生物,能顯著保護(hù)胸腺淋巴細(xì)胞免受長(zhǎng)波紫外線以及H2O2的損傷,即表現(xiàn)出良好抗氧化作用。此外,卡拉膠寡糖分子上具有多個(gè)活性羥基及硫酸基團(tuán),其可與Cd2+離子發(fā)生螯合作用,而形成較為穩(wěn)定的配合物。此外,較高濃度硒化卡拉膠也表現(xiàn)出較好的氧化損傷修復(fù)作用,其可能來(lái)自Se4+離子及卡拉膠的雙重作用。研究表明,Se4+在生物體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物學(xué)活性,其也是生物體內(nèi)重金屬元素拮抗劑,能有效降低金屬元素在機(jī)體內(nèi)的積累作用[10]。另一方面,卡拉膠雖具有一定氧化調(diào)節(jié)作用,但相比于卡拉膠寡糖分子,由于其聚合度較高、分子量相對(duì)較大,因此在生物體內(nèi)吸收利用及抗氧化活性(氧化損傷修復(fù))也會(huì)有所降低。綜上,采用硒化卡拉膠、卡拉膠寡糖飼喂處理,對(duì)于Cd2+脅迫的紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)和血淋巴中SOD酶活性,具有較好的調(diào)節(jié)恢復(fù)作用。

2.2 不同添加物對(duì)紫貽貝中CAT活力的影響

由表2發(fā)現(xiàn),在正常紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)中,CAT活力隨暫養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。飼喂第0 d,相比于正常貽貝,Cd2+脅迫貽貝內(nèi)臟團(tuán)中CAT活力顯著升高(P<0.05),主要是由于Cd2+暴露誘導(dǎo)紫貽貝產(chǎn)生大量活性氧(ROS),誘導(dǎo)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài),從而使CAT等抗氧化酶被激活以抵抗氧化損傷所致;隨暫養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),其內(nèi)臟團(tuán)中CAT活力顯著下降,可能是由于富集Cd2+對(duì)貽貝機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的損傷作用及抑制了CAT活性。相比于Cd2+脅迫紫貽貝組,亞硒酸鈉、硒化卡拉膠及卡拉膠寡糖飼喂處理組,均對(duì)CAT活性起到顯著提升作用(P<0.05);暫養(yǎng)第15 d,硒化卡拉膠和卡拉膠寡糖對(duì)紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)中CAT活性改善作用明顯,顯著高于亞硒酸鈉處理組(P<0.05)。對(duì)于血淋巴中,各紫貽貝處理組CAT活性均呈不斷下降趨勢(shì),尤其正常紫貽貝經(jīng)15 d暫養(yǎng)后,CAT活性降低到最低水平,可能是由于紫貽貝經(jīng)馴化暫養(yǎng)后,逐漸適應(yīng)了新的外界環(huán)境,從而體內(nèi)的應(yīng)激水平也逐漸降低。對(duì)于飼喂處理組中,以卡拉膠寡糖對(duì)紫貽貝血淋巴中CAT活性的維持效果較好,暫養(yǎng)15 d后仍顯著優(yōu)于亞硒酸鈉和硒化卡拉膠處理組(P<0.05)。

表2 不同添加物對(duì)紫貽貝中CAT活力的影響(U/mg)Table 2 Effect of different additives on the activity of CAT in Mytilus edulis(U/mg)

CAT是一類(lèi)廣泛分布于生物體內(nèi)的末端氧化酶,功能是催化細(xì)胞內(nèi)H2O2分解為O2和H2O,清除活性氧并減少羥基自由基的形成,其活力高低能反映機(jī)體抗氧化系統(tǒng)對(duì)外界刺激的總應(yīng)激能力[11]。研究表明,雙殼貝類(lèi)在不同濃度Cd2+溶液中,不同組織器官中抗氧化酶(如CAT、SOD等)活性變化呈現(xiàn)“誘導(dǎo)-抑制”的變化規(guī)律[12]。鄧思平等[13]以0.005 mg/L Cd2+暴露養(yǎng)殖尖子蛤發(fā)現(xiàn),Cd2+對(duì)蛤鰓中SOD、CAT及GSH-Px活性并無(wú)明顯影響;當(dāng)濃度增加至0.5 mg/L時(shí),蛤組織中抗氧化酶活性呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系,且呈先升高后下降的規(guī)律。本試驗(yàn)結(jié)果與以上報(bào)道結(jié)果基本一致。此外,對(duì)比CAT和SOD分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),紫貽貝組織中CAT被激活或抑制程度整體略低于SOD變化情況,說(shuō)明SOD較CAT更加敏感些,其與SOD為機(jī)體內(nèi)首先與ROS發(fā)生作用的抗氧化酶的報(bào)道相吻合[14]。王宏偉等[15]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加亞硒酸鈉和富硒酵母,可明顯提高對(duì)硫磷脅迫下中華米蝦體內(nèi)CAT活性,這與本研究中結(jié)果相似。綜上發(fā)現(xiàn),硒化卡拉膠和卡拉膠寡糖對(duì)紫貽貝組織中CAT活性具有相對(duì)較好的修復(fù)作用。

2.3 不同添加物對(duì)紫貽貝中PO活力的影響

不同添加物對(duì)紫貽貝中PO活力影響,如表3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在整個(gè)暫養(yǎng)時(shí)間內(nèi),正常紫貽貝的內(nèi)臟團(tuán)和血淋巴中PO活力,并未呈現(xiàn)出顯著變化(P>0.05)。在暫養(yǎng)第5 d后,Cd2+脅迫紫貽貝、亞硒酸鈉和硒化卡拉膠處理組紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)中PO活力均大幅降低(P<0.05),而在隨后的5～15 d暫養(yǎng)期內(nèi)PO活力變化幅度相對(duì)較小。暫養(yǎng)15 d,相比于Cd2+脅迫和正常紫貽貝組,卡拉膠寡糖對(duì)機(jī)體內(nèi)臟團(tuán)中PO活力的恢復(fù)作用更明顯,具有較好提升PO酶活力的作用。對(duì)于血淋巴中PO活力變化情況,在0～15 d暫養(yǎng)期內(nèi),Cd2+脅迫紫貽貝組呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。亞硒酸鈉處理組在暫養(yǎng)第5 d時(shí)血淋巴中PO活力出現(xiàn)一定的提高,隨后PO活力逐漸降低。對(duì)于硒化卡拉膠和卡拉膠寡糖組,在15 d暫養(yǎng)期內(nèi)血淋巴中PO活力均維持在較高水平,可能是由于硒元素及糖分子可更好地與血細(xì)胞上的識(shí)別蛋白結(jié)合,激活proPO而釋放出更多PO,從而起到較好的機(jī)體抗氧化作用。

表3 不同添加物對(duì)紫貽貝中PO活力的影響(U/mg)Table 3 Effect of different additives on the activity of PO in Mytilus edulis(U/mg)

PO作為一種含銅的抗氧化酶,能夠催化單酚羥化成二酚,并把二酚氧化成醌。一般情況下,PO以無(wú)活性酚氧化酶原形式,存在于雙殼貝類(lèi)動(dòng)物的大顆粒血細(xì)胞中,機(jī)體通過(guò)PO原激活系統(tǒng)(proPO)直接參與免疫反應(yīng),因此生物體內(nèi)PO活力變化能較準(zhǔn)確地反映機(jī)體的免疫能力[5]。Asokan等[16]研究發(fā)現(xiàn),proPO主要存在于紫貽貝血淋巴中,而血細(xì)胞中含量要遠(yuǎn)大于血漿中含量,該結(jié)果與本試驗(yàn)中測(cè)定結(jié)果相一致(血淋巴中PO活力遠(yuǎn)高于內(nèi)臟團(tuán)中)。本研究中,卡拉膠寡糖對(duì)于紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)和血淋巴中PO活性均具有一定的提升作用,其原因可能主要來(lái)自于卡拉膠寡糖分子本身良好的抗氧化活性,同時(shí)寡糖分子可能對(duì)機(jī)體PO激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中某些關(guān)鍵因子的激活或信號(hào)傳導(dǎo)起到了輔助促進(jìn)作用,該結(jié)果對(duì)于判斷紫貽貝機(jī)體免疫機(jī)能的變化具有一定參考價(jià)值。

2.4 不同添加物對(duì)紫貽貝中ACP活力的影響

不同組紫貽貝中ACP活力變化情況,如表4所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在15 d暫養(yǎng)期內(nèi),正常紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)和血淋巴中ACP活力保持相對(duì)穩(wěn)定,未出現(xiàn)顯著變化(P>0.05)。對(duì)于Cd2+脅迫紫貽貝組,相比于正常組ACP活力顯著增加(P<0.05),且在暫養(yǎng)過(guò)程中ACP活力整體也保持較為穩(wěn)定的狀態(tài)。在飼養(yǎng)10～15 d,亞硒酸鈉、硒化卡拉膠和卡拉膠寡糖組相比于正常紫貽貝組,顯著提升了內(nèi)臟團(tuán)和血淋巴中ACP活性(P<0.05)。此外,三種添加物的飼喂處理,對(duì)紫貽貝組織中ACP活力達(dá)到較高誘導(dǎo)值的時(shí)間及劑量也有所不同,可能與各添加物對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能的影響途徑有所不同所致,其影響機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)中,亞硒酸鈉雖表現(xiàn)出一定的機(jī)體T-SOD活力調(diào)劑作用,但考慮其高濃度應(yīng)用具有副作用,低濃度飼喂控制難度偏大,因此其在紫貽貝暫養(yǎng)過(guò)程中用于抵抗重金屬脅迫仍具有一定的局限性。

表4 不同添加物對(duì)紫貽貝中ACP活力的影響(U/mg)Table 4 Effect of different additives on the activity of ACP in Mytilus edulis(U/mg)

ACP在生物體內(nèi)作為機(jī)體巨噬細(xì)胞的標(biāo)識(shí)酶,活性高低反應(yīng)了巨噬細(xì)胞被激活的程度。同時(shí)，ACP作為溶酶體的標(biāo)志性水解酶,其與溶酶體生理功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)密切相關(guān)。在軟體動(dòng)物體內(nèi),溶酶體酶一般具有防御和消化的雙重作用,能夠清除體內(nèi)氧自由基,其水解作用是生物體攻擊異物的主要機(jī)制之一[17]。牟海津等[18]研究發(fā)現(xiàn),櫛孔扇貝體內(nèi)ACP的分布,以肝臟中活力最高,血細(xì)胞次之。本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果與牟海津等研究報(bào)道相一致。研究表明,Se4+具有較好拮抗Cd2+毒性作用,在機(jī)體內(nèi)具有顯著的清除自由基,并提高相關(guān)內(nèi)源保護(hù)酶活性,并已在多種水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)得以證實(shí),如羅非魚(yú)[19]、凡納濱對(duì)蝦[20]等。本試驗(yàn)中,Se4+可能通過(guò)其抗氧化機(jī)制,降低Cd2+對(duì)紫貽貝機(jī)體的氧化損傷作用。對(duì)于硒化卡拉膠的生物活性,孫虎山等[21]研究發(fā)現(xiàn)硒化卡拉膠可促進(jìn)櫛孔扇貝血細(xì)胞中ACP和溶菌酶的形成,還可促進(jìn)血細(xì)胞中的ACP和溶菌酶向血清中釋放,從而提高機(jī)體血細(xì)胞中的ACP活力。由卡拉膠降解制備的卡拉膠寡糖聚合度和分子量均較低,其對(duì)多種自由基的清除能力明顯優(yōu)于大分子的卡拉膠,其優(yōu)良的抗氧化活性已獲得證實(shí)。

2.5 不同添加物對(duì)紫貽貝體內(nèi)中GSH-PX活力的影響

由表5可知,經(jīng)過(guò)15 d暫養(yǎng),正常組紫貽貝內(nèi)臟團(tuán)和血淋巴中GSH-PX活力基本保持穩(wěn)定,未表現(xiàn)出顯著變化(P>0.05),而Cd2+脅迫紫貽貝組GSH-PX活力隨暫養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低(P<0.05)。此外,亞硒酸鈉、硒化卡拉膠和卡拉膠寡糖組,均表現(xiàn)出較明顯的GSH-PX活力增強(qiáng)作用。經(jīng)各處理組紫貽貝體內(nèi)GSH-PX活力表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì),尤其在暫養(yǎng)10～15 d期間,機(jī)體內(nèi)GSH-PX活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。在暫養(yǎng)10～15 d期間,對(duì)于硒化卡拉膠和卡拉膠寡糖組,高濃度處理組GPx活力增強(qiáng)作用與低濃度組沒(méi)有顯著差異(P>0.05),這可能是由于所選添加物的機(jī)體調(diào)節(jié)效應(yīng)已達(dá)飽和所致。而暫養(yǎng)10 d時(shí)高濃度的亞硒酸鈉對(duì)于提高紫貽貝GSH-PX活力,顯著高于低濃度組(P<0.05),其原因可能是由于較高的亞硒酸鈉對(duì)紫貽貝機(jī)體已產(chǎn)生了一定的脅迫刺激效應(yīng),而引起了紫貽貝的氧化應(yīng)激反應(yīng),因此較高濃度的亞硒酸鈉對(duì)于機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)可能產(chǎn)生一定的副作用。

表5 不同添加物對(duì)紫貽貝中GSH-PX活力的影響(U/mg)Table 5 Effect of different additives on the activity of GSH-PX in Mytilus edulis(U/mg)

GSH-PX廣泛存在于生物體內(nèi),是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的第一道屏障。GSH-PX與CAT、SOD以及小分子抗氧化物質(zhì)(如VC)一起構(gòu)成抗氧化系統(tǒng),起到清除體內(nèi)氧自由基,防止細(xì)胞膜與遺傳物質(zhì)損傷的作用[22]。當(dāng)紫貽貝遭受短時(shí)間高濃度或者長(zhǎng)時(shí)間低濃度重金屬污染物脅迫時(shí),體內(nèi)ROS不斷累積超過(guò)機(jī)體的最大承受量,此時(shí)機(jī)體生物膜和酶系統(tǒng)被嚴(yán)重破壞。本試驗(yàn)中,硒化卡拉膠和卡拉膠寡糖對(duì)紫貽貝具有較好的GSH-PX酶活力提升作用,可輔助機(jī)體抵抗或修復(fù)Cd2+脅迫造成的細(xì)胞膜氧化損傷作用[23]。從整體來(lái)看,硒化卡拉膠和卡拉膠寡糖飼喂紫貽貝后,機(jī)體內(nèi)CAT與GSH-PX活性變化趨勢(shì)較為相似,其原因可能與CAT、GSH-PX兩者具有相同的非特異性免疫調(diào)控作用有關(guān)。此外,機(jī)體SOD、ACP、CAT及GSH-PX活性變化情況,與機(jī)體對(duì)外界污染物的脅迫響應(yīng)、添加物類(lèi)型、濃度及處理時(shí)間等密切相關(guān),各抗氧化酶之間對(duì)清除機(jī)體氧化損傷也可能存在一定的協(xié)同作用。

3 結(jié)論

重金屬Cd2+在雙殼貝類(lèi)機(jī)體內(nèi)的生物蓄積,誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基物質(zhì),從而造成機(jī)體內(nèi)細(xì)胞膜與遺傳物質(zhì)的氧化損傷作用。因此,研究雙殼貝類(lèi)在重金屬脅迫環(huán)境下的免疫功能變化及其調(diào)控方法,具有重要的實(shí)踐意義。本文以正常紫貽貝和Cd2+脅迫紫貽貝為對(duì)照,分析比較亞硒酸鈉、硒化卡拉膠及卡拉膠寡糖對(duì)紫貽貝機(jī)體內(nèi)T-SOD、GSH-PX、ACP、CAT和PO活力的影響情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在15 d的暫養(yǎng)過(guò)程中,60和120 mg/L硒化卡拉膠及卡拉膠寡糖組,對(duì)紫貽貝體內(nèi)以上多種抗氧化酶活力的恢復(fù)作用良好,其改善作用明顯優(yōu)于Cd2+脅迫紫貽貝自身恢復(fù)效果,有望作為一種新型雙殼貝類(lèi)免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于貝類(lèi)的凈化暫養(yǎng)過(guò)程中。