壯藥透骨香對(duì)膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制▲

賴克道 王 麗 鄧聿胤 呂紀(jì)華 劉 瑛 覃 良

(廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院中藥藥理所/廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧市 530022，電子郵箱：215544910@qq.com)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以炎性滑膜炎為主要特征的慢性系統(tǒng)性疾病，病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥和血管翳形成，其可引起關(guān)節(jié)的軟骨和骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1-2]。目前，我國(guó)RA的發(fā)病率為0.32%～0.36%[3]，女性居多，臨床主要表現(xiàn)為對(duì)稱性的多關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降，病程長(zhǎng)且易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。透骨香為夾竹桃科植物筋藤的干燥根和莖，是廣西民族藥“五松腫痛酊”中的原料藥材[4]，用于治療RA引起的關(guān)節(jié)疼痛，療效甚佳[5]。本文通過建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎 (collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，探討壯藥透骨香的干預(yù)治療作用及相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年無(wú)特定病原體級(jí)SD雌性大鼠70只，體重180～220 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SCXK桂2009-0002。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后用于實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20℃～25℃、相對(duì)濕度(60±10)%，自由飲食。

1.2 主要藥品與試劑 (1)透骨香水溶部位：透骨香藥材采自廣西玉林市，經(jīng)本研究院饒偉源主任藥師鑒定為夾竹桃科植物筋藤后使用。透骨香藥材采用60%乙醇加熱回流提取，提取液回收乙醇后，藥液進(jìn)行梯度提取分離，得到水溶部位浸膏，每克浸膏含21.96 g生藥，實(shí)驗(yàn)時(shí)以蒸餾水稀釋成所需濃度使用。(2)牛源Ⅱ型膠原、不完全弗氏佐劑均購(gòu)自Sigma公司(貨號(hào)：C7806、F5506)，使用時(shí)將牛源Ⅱ型膠原溶于0.1M乙酸溶液中配制成2 mg/ml膠原溶液，4℃過夜后將等量的膠原溶液與不完全佛氏佐劑乳化制成混合乳劑。(3)雷公藤多苷片購(gòu)自湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司(批號(hào)20171202)，水合氯醛購(gòu)自成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)(批號(hào)：2016092901)，大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、大鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：569180611、370180611)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 超聲波處理器(上海生析超聲儀器有限公司)，TDL-5-A型低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，Multiskan GO型全波長(zhǎng)全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)，F(xiàn)SH-2A型可調(diào)高速勻漿機(jī)(金壇國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型制備與分組：將70只大鼠按照數(shù)字隨機(jī)表法分為空白組10只及CIA模型組60只。參照文獻(xiàn)[6-7]，采用牛源Ⅱ型膠原與不完全佛氏佐劑(1 ∶1)乳化制成的混合乳劑在模型組大鼠右后足趾、背部和尾根部分別進(jìn)行皮下注射致炎，每個(gè)部位注射0.2 ml，空白組注射相同體積0.1M乙酸，造模14 d后繼續(xù)加強(qiáng)免疫1次，各部位注射量0.1 ml。造模前后采用千分游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠下肢足趾厚度，根據(jù)足趾腫脹度評(píng)價(jià)模型制備情況。造模21 d后將10只足趾腫脹度較輕(<0.5%)的模型組大鼠剔除，剩余50只按照數(shù)字隨機(jī)表法分為模型組、雷公藤多苷組以及高、中、低劑量透骨香組，每組10只。

1.4.2 給藥方法：各組大鼠于造模后21 d開始灌胃給藥，雷公藤多苷劑量為0.01 g/kg，透骨香水溶部位高、中、低劑量分別為73.79 g生藥/kg、36.89 g生藥/kg、18.45 g生藥/kg，灌胃量為1 ml/kg，空白組與模型組分別予以等體積蒸餾水灌胃，共給藥28 d。

1.5 觀測(cè)指標(biāo)

1.5.1 足趾腫脹度：各組大鼠于造模前、造模21 d后及給藥28 d后分別應(yīng)用千分游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠右下肢足趾厚度，按下列公式計(jì)算足趾腫脹度：腫脹度=(造模后足趾厚度—造模前足趾厚度)/造模前足趾厚度×100%。

1.5.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)：末次給藥后，各組大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分，采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)積分法評(píng)定。關(guān)節(jié)病變按5 級(jí)分法評(píng)價(jià)[8]：無(wú)紅斑腫脹為0分，踝關(guān)節(jié)和小趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑及輕微腫脹為1分，踝關(guān)節(jié)和足趾出現(xiàn)紅斑及輕微腫脹為2分，踝關(guān)節(jié)與足爪出現(xiàn)紅斑及中度腫脹為3分，踝關(guān)節(jié)與足爪有紅斑及重度腫脹為4分。將四肢評(píng)分累加得到每只大鼠的AI，AI越高，關(guān)節(jié)癥狀越嚴(yán)重。

1.5.3 血清TNF-α、IL-1β水平：末次給藥后，采用3.5%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉各組大鼠，腹主動(dòng)脈采血，離心(3 000 r/min，10 min)后取血清，按照試劑盒說明采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平。

1.5.4 關(guān)節(jié)組織勻漿TNF-α、IL-1β水平：各組大鼠處死后，取部分踝關(guān)節(jié)韌帶及關(guān)節(jié)囊組織，稱重剪碎與生理鹽水以1 ∶9比例制備10%關(guān)節(jié)組織勻漿，離心(3 000 r/min，10 min)后取上清液，按照試劑盒說明采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造模21 d后空白組及CIA模型組大鼠的足趾腫脹度比較 造模21 d后，CIA模型組的足趾腫脹度為(0.841±0.154)%，高于空白組的(0.070±0.052)%(t=6.733，P=0.012)。

2.2 給藥28 d后6組大鼠的足趾腫脹度比較 給藥28 d后，與空白組比較，模型組和各用藥組大鼠足趾腫脹度升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷組和高、中、低劑量透骨香組大鼠足趾腫脹度降低(P<0.05)；與雷公藤多苷組比較，低劑量透骨香組大鼠足趾腫脹度升高(P<0.05)，中、高劑量透骨香組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；各劑量透骨香組之間比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 給藥28 d后6組大鼠足趾腫脹度比較(x±s，%)

注：與空白組相比，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與雷公藤多苷組比較，*P<0.05。

2.3 6組大鼠的AI比較 與空白組比較，模型組大鼠AI升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷組和高劑量透骨香組大鼠AI降低(均P<0.05)；與雷公藤多苷組比較，低、中劑量透骨香組大鼠AI升高(均P<0.05)，高劑量透骨香組AI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高劑量透骨香組AI低于低劑量透骨香組(P<0.05)。見表2。

表2 6組大鼠的AI比較(x±s，分)

注：與空白組相比，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與雷公藤多苷組比較，*P<0.05；與低劑量透骨香組比較，#P<0.05。

2.4 6組大鼠的血清TNF-α及IL-1β水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均升高(均P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷組和中、高劑量透骨香組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均降低(均P<0.05)。見表3。

表3 6組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較(x±s，pg/ml)

注：與空白組相比，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

2.5 6組大鼠關(guān)節(jié)組織勻漿中TNF-α、IL-1β水平比較 與空白組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)組織勻漿中TNF-α、IL-1β水平均升高(均P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組和透骨香高劑量組大鼠關(guān)節(jié)組織勻漿中TNF-α、IL-1β水平均降低(均P<0.05)，透骨香中劑量組大鼠關(guān)節(jié)組織勻漿中TNF-α水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 6組大鼠關(guān)節(jié)組織勻漿TNF-α、IL-1β水平比較(x±s，pg/ml)

注：與空白組相比，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

3 討 論

壯醫(yī)藥是我國(guó)中醫(yī)藥和民族傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，在防治RA方面具有獨(dú)特療效。RA屬中醫(yī)“痹證”范疇，壯醫(yī)名為“滾克”，壯醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA發(fā)病多由外受濕邪，阻滯脈絡(luò)繼而入骨，病久正氣虛衰，氣滯血瘀，從而引起谷道、水道、氣道及龍路、火路阻滯，使天地人三氣不能同步而致病[9-10]。RA的治療應(yīng)祛風(fēng)除濕，消腫止痛，益氣活血通絡(luò)。透骨香為夾竹桃科植物筋藤的干燥根和莖，主要產(chǎn)于廣西和廣東，為廣西民間壯藥，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛、祛腐生肌之功效，用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛、跌打腫痛等療效確切。本研究結(jié)果顯示，造模21 d后，CIA模型大鼠足趾腫脹度顯著升高，提示造模成功；灌胃給藥28 d后，與模型組比較，高、中、低劑量透骨香組大鼠足趾腫脹度降低(P<0.05)，且高劑量透骨香組大鼠AI降低(P<0.05)，即不同劑量的透骨香水溶部位均可緩解CIA模型大鼠的關(guān)節(jié)癥狀，提示透骨香水溶部位對(duì)膠原誘導(dǎo)的RA大鼠具有干預(yù)治療作用。此外，與雷公藤多苷組比較，低、中劑量透骨香組大鼠AI均升高(均P<0.05)，但高劑量透骨香組大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且高劑量透骨香組大鼠AI低于低劑量透骨香組(P<0.05)，提示高劑量的透骨香水溶部位緩解關(guān)節(jié)癥狀效果最佳。

RA的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，滑膜組織增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、骨及軟骨降解與破壞及自身免疫等病理生理過程貫穿整個(gè)病程，它們之間相互作用、相互關(guān)聯(lián)，形成一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其中炎癥細(xì)胞因子紊亂在RA發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的作用[11]。TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌[12]，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。TNF-α參與了RA滑膜組織增生、炎癥和自身免疫反應(yīng)3個(gè)病理生理過程，是RA發(fā)病機(jī)制中處于中心地位的促炎癥因子[13-14]。IL-1是參與RA進(jìn)展期關(guān)節(jié)破壞的典型炎癥細(xì)胞因子，主要來(lái)源于活化的巨噬細(xì)胞，可以由TNF-α產(chǎn)生或自身刺激產(chǎn)生，IL-1分為IL-1α和IL-1β兩型，其中IL-1β為分泌型興奮因子，能夠促進(jìn)自我分泌，從而將炎癥信號(hào)迅速放大，影響RA 炎癥過程[15]。研究表明，活動(dòng)期RA患者血漿TNF-α、IL-1β水平明顯升高，是RA炎癥活動(dòng)的重要衡量指標(biāo)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清與關(guān)節(jié)組織勻漿中TNF-α、IL-1β水平均升高(P<0.05)，符合RA的炎性改變；與模型組比較，中劑量透骨香組大鼠的血清TNF-α、IL-1β水平及關(guān)節(jié)組織勻漿中TNF-α水平均降低，高劑量透骨香組大鼠血清及關(guān)節(jié)組織勻漿中TNF-α、IL-1β水平均降低(均P<0.05)，即中、高劑量透骨香水溶部位均能降低CIA模型大鼠血清及關(guān)節(jié)組織勻漿TNF-α、IL-1β含量，提示透骨香水溶部位干預(yù)作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，壯藥透骨香水溶部位對(duì)CIA大鼠具有干預(yù)治療作用，且高劑量(73.79 g生藥/kg)的透骨香水溶部位效果最佳，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)有關(guān)。而透骨香水溶部位對(duì)其他炎癥因子及免疫功能是否有影響，具體途徑如何有待進(jìn)一步深入研究。本研究為壯藥透骨香抗RA作用提供了實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)，為民族藥五松腫痛酊的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。