使用不同來(lái)源精子行卵胞漿內(nèi)單精子注射對(duì)受精、胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響▲

張小慧 黃悅悅 王世凱 譚衛(wèi)紅 毛獻(xiàn)寶 李政達(dá) 周亭亭 韋娉嬪 劉慶友 薛林濤

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心，南寧市 530021，電子郵箱：zhangxhscu@163.com)

卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)是通過(guò)顯微操作手段將精子直接注射入卵子胞漿內(nèi)，從而輔助其完成受精的治療手段，其在臨床上的成功應(yīng)用有效地解決了因男方精子質(zhì)量差、精卵結(jié)合障礙、無(wú)精子癥等因素導(dǎo)致的不育問(wèn)題。目前由于男方病因不同，ICSI治療周期中用于顯微注射的精子來(lái)源有所差異，而不同來(lái)源精子對(duì)ICSI治療的正常受精率、胚胎發(fā)育參數(shù)及臨床妊娠結(jié)局的影響，仍然存在爭(zhēng)議[1-2]，且其機(jī)制仍不清楚。近年來(lái)有研究顯示，精子功能參數(shù)異常是輔助生殖治療正常受精率及臨床治療結(jié)局的一個(gè)重要影響因素[3]；同時(shí)不同來(lái)源精子由于其所處階段及生理微環(huán)境的差異，精子功能參數(shù)可能存在差異[4]。本研究通過(guò)比較使用不同來(lái)源精子行ICSI對(duì)受精、胚胎發(fā)育及臨床妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2010年1月至2016年11月在本中心接受ICSI技術(shù)治療的703對(duì)不育夫婦臨床資料。納入病例均滿足ICSI技術(shù)治療的臨床指征：(1)嚴(yán)重少弱精子癥(精液濃度<5×106/mL或前向運(yùn)動(dòng)百分率<10%)；(2)前次體外受精失敗或正常受精率<30%；(3)采卵當(dāng)日精液經(jīng)密度梯度離心處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)<1×106條；(4)男方為梗阻性無(wú)精子癥。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡≤37歲；(2)女方經(jīng)過(guò)體格檢查、病史詢問(wèn)、婦科B超及內(nèi)分泌、血液生化檢查，除單純輸卵管因素外，未發(fā)現(xiàn)其他可能影響生育的疾病；(3)夫婦雙方染色體核型分析未見(jiàn)異常。將體外射精采集精子的病例分為正常精液組(A組)56例，少弱精子癥組(B組)364例；將手術(shù)從睪丸或附睪取得精子的病例分為附睪精子組(C組)187例，睪丸精子組(D組)96例。

1.2 方法

1.2.1 精液采集：男方禁欲2～7 d，在女方取卵當(dāng)日上午采用手淫法采集精液，收集于清潔廣口的塑料無(wú)菌杯中，用非連續(xù)密度梯度離心法結(jié)合上游法[5]行優(yōu)化處理，37℃培養(yǎng)箱孵育備用。梗阻性無(wú)精男性于女方取卵當(dāng)日，采用經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)或經(jīng)皮睪丸精子抽吸術(shù)[6]采集精液，采用直接離心法[5]1 640 r/min離心5 min進(jìn)行優(yōu)化處理，去上清后37℃培養(yǎng)箱孵育備用。

1.2.2 精子DNA碎片率檢測(cè)：使用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法[7]檢測(cè)優(yōu)化后精子DNA碎片率，按照西班牙Halotech DNA S.L.公司的Halosperm?試劑盒(批號(hào)：4078105)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。精子DNA碎片化判定標(biāo)準(zhǔn)：精子頭部產(chǎn)生光暈寬度小于精子核直徑的1/3，或精子頭部無(wú)光暈，或精子頭部不著色或核形態(tài)不規(guī)則。精子DNA碎片率=DNA碎片化的精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.2.3 精子頂體完整率：采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的豌豆凝集素法[5]評(píng)估精子頂體功能。使用磷酸鹽緩沖液將優(yōu)化后精液濃度調(diào)整至5×106/mL，取10 μL均勻涂抹于干凈載玻片上，自然干燥；將精子涂片置于95%的無(wú)水乙醇中固定30 min，自然干燥后置于25 μg/mL的熒光染料中4℃避光染色8～12 h；取出玻片，用去離子水輕微洗滌沖洗10 s后封片；450～490 nm激發(fā)光下使用400倍油鏡觀察精子涂片，至少計(jì)數(shù)400個(gè)精子。精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻則判定為頂體完整精子，精子僅在赤道帶出現(xiàn)熒光帶或者頂體區(qū)無(wú)熒光染色則判定為自發(fā)頂體反應(yīng)精子。頂體完整率=頂體完整精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.2.4 ICSI受精：所有女方根據(jù)年齡、激素水平和卵巢儲(chǔ)備功能行促排卵方案，當(dāng)直徑達(dá)18 mm及以上的卵泡數(shù)量≥2枚時(shí)，進(jìn)行扳機(jī)，扳機(jī)36 h后行卵泡穿刺。取卵4～6 h后挑選形態(tài)好、活力正常的精子對(duì)每個(gè)成熟卵母細(xì)胞行ICSI。取卵后72 h參考卵裂期胚胎評(píng)分系統(tǒng)[8]，對(duì)卵裂期胚胎進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。卵母細(xì)胞受精后第5天、第6天，觀察囊胚形成情況，參照人類囊胚評(píng)分系統(tǒng)[9]進(jìn)行囊胚分級(jí)。根據(jù)子宮內(nèi)膜情況行新鮮胚胎移植。胚胎移植后，第14天檢測(cè)尿或血人絨毛膜促性腺激素，第4～5周B超檢測(cè)孕囊和胎心，電話隨訪妊娠情況及產(chǎn)科結(jié)局。

1.3 觀察指標(biāo) 比較4組的精子DNA碎片率、精子頂體完整率、正常受精率、正常卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可凍囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、移植周期數(shù)、移植胚胎數(shù)、每周期移植胚胎數(shù)、胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率和男女?huà)胄詣e比。其中正常受精率=2個(gè)原核受精卵數(shù)/注射成熟卵母細(xì)胞數(shù)×100%；正常卵裂率=2個(gè)原核卵裂胚胎數(shù)/2個(gè)原核受精卵總數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2個(gè)原核卵裂胚胎數(shù)×100%；囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)總數(shù)×100%；可凍囊胚形成率=可凍囊胚數(shù)/囊胚培養(yǎng)總數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/囊胚培養(yǎng)總數(shù)×100%；胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=B超觀察到妊娠的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；男女?huà)胄詣e比=出生男嬰數(shù)/出生女?huà)霐?shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料以[M(Q1,Q3)]表示，比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組患者基本情況及精子參數(shù)比較 B組的男方年齡大于C組與D組，A組與B組的女方年齡均大于C組與D組(均P<0.05)。A組與B組精子DNA碎片率低于C組與D組，而精子頂體完整率高于C組與D組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同分組患者基本情況及精子參數(shù)比較(x±s)

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

2.2 4組正常受精率與胚胎質(zhì)量比較 A組的正常受精率高于B組、C組與D組，且B組的正常受精率高于C組(P<0.05)。B組的優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和可凍囊胚形成率低于D組(P<0.05)。4組的正常卵裂率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同來(lái)源精子正常受精率與胚胎質(zhì)量對(duì)比

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

2.3 4組臨床結(jié)局比較 4組每周期移植的胚胎個(gè)數(shù)、胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率和男女?huà)胄詣e比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組分臨床結(jié)局對(duì)比

3 討 論

精子在睪丸中生成時(shí)已經(jīng)具有完整的父源遺傳物質(zhì)和功能活性的頂體蛋白酶，進(jìn)入附睪并經(jīng)頭、體、尾運(yùn)行后，精子核進(jìn)一步成熟，同時(shí)頂體外膜抗原分布改變，最后精子通過(guò)生殖管道獲得受精能力。不同來(lái)源的精子，精子核組裝程度和頂體的成熟度不同，因此受精結(jié)局有所差異[10]。當(dāng)精子核DNA損傷時(shí)，其進(jìn)入卵子后精子核染色質(zhì)解聚受到影響，進(jìn)而影響受精，而高DNA碎片率與ICSI治療的正常受精率呈負(fù)相關(guān)[3]。頂體內(nèi)生物活性蛋白酶促進(jìn)卵子激活和精子核染色質(zhì)的解凝縮，從而促進(jìn)受精[11]。本研究結(jié)果顯示，4組的正常受精率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中A組、B組的正常受精率均高于C組，提示不同來(lái)源精子用于ICSI治療，正常受精率存在差異；同時(shí)，A組、B組的DNA碎片率低于C組，而頂體完整率高于C組(P<0.05)，這提示由于不同來(lái)源精子的DNA碎片率和頂體完整率不同，可能導(dǎo)致ICSI的正常受精率存在差異。

胚胎發(fā)育到 4～8 細(xì)胞階段時(shí)，合子基因組開(kāi)始激活，父源基因?qū)ε咛グl(fā)育的影響開(kāi)始顯現(xiàn)。盡管有研究結(jié)果顯示射出精子和睪丸精子的囊胚形成率和囊胚質(zhì)量無(wú)明顯差異[12-13]，但本研究結(jié)果顯示B組的優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和可凍囊胚率低于D組(P<0.05)。其原因可能有3個(gè)方面：首先，未成熟的精子生成后從生精小管向附睪遷移的過(guò)程中產(chǎn)生活性氧，引起精子氧化應(yīng)激損傷，致使精子的結(jié)構(gòu)和功能受損[14]，同時(shí)由于環(huán)境、生活習(xí)慣、肥胖、感染或者其他疾病等原因，少弱精子癥患者精子的微環(huán)境變差，產(chǎn)生的超氧化物濃度高，精子氧化應(yīng)激損傷更嚴(yán)重[15]，而睪丸中的精子中心粒等受損傷小[16]，使其所形成的胚胎發(fā)育潛能好；其次，本研究中睪丸精子來(lái)源于梗阻性無(wú)精子癥患者，而大多數(shù)此類患者睪丸的生精功能正常，但少弱精子癥患者多數(shù)生精功能受損，表觀遺傳異常，表觀遺傳通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞的功能，最終影響胚胎的質(zhì)量[17]；最后，射出精子的濃度和前向運(yùn)動(dòng)率與精子染色體的非整倍性呈負(fù)相關(guān)[18]，少弱精子癥的染色體精子非整倍性升高[19]，非整倍性的精子導(dǎo)致胚胎染色體異常，少弱精子癥患者的胚胎發(fā)育潛能比正常精液者差。因此，少弱精子癥患者行ICSI治療時(shí)所獲胚胎的發(fā)育潛能差，臨床上應(yīng)予以重視。

本研究結(jié)果還顯示，4組的胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、男女?huà)胄詣e比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與趙杰等[20]的研究結(jié)果相同。這可能是由于用于ICSI的精子數(shù)量非常有限，故優(yōu)先選擇活力和形態(tài)最好的精子，以減小精子異常對(duì)ICSI結(jié)局的影響。精子進(jìn)入胞質(zhì)后可進(jìn)一步進(jìn)行生理選擇，以順利完成受精，并促進(jìn)受精卵發(fā)育成優(yōu)質(zhì)胚胎。而臨床胚胎移植時(shí)需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的胚胎質(zhì)量篩選，挑選質(zhì)量最佳的胚胎移植入宮腔，也從一定程度上淘汰染色體異常的胚胎，并減少精子缺陷對(duì)臨床結(jié)局的影響。

綜上所述，ICSI周期使用不同來(lái)源精子會(huì)導(dǎo)致精子DNA碎片率和頂體完整率存在差異，從而影響正常受精率。少弱精子癥來(lái)源的精子可影響ICSI治療周期的胚胎發(fā)育結(jié)局，因此少弱精子癥患者進(jìn)行ICSI治療前，有必要進(jìn)行精子功能檢查評(píng)估，加強(qiáng)男科臨床治療，改善精子質(zhì)量和功能，以提高臨床治療結(jié)局。