非洲豬瘟研究進(jìn)展

郗永義，林艷麗，王友亮

軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASF virus，ASFV）感染家豬或野豬引發(fā)的一種急性、烈性傳染病，蜱是ASFV的自然宿主和傳播媒介。感染后癥狀一般表現(xiàn)為全身出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀等，病程時(shí)間短，病死率高，最急性和急性型感染死亡率高達(dá)100%。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，也是我國(guó)重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疫病。ASF發(fā)病癥狀與普通豬瘟相似，臨床上很難鑒別診斷，只能依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診，目前還沒有有效疫苗和防治藥物。ASF只對(duì)豬高度感染，還未發(fā)現(xiàn)ASFV感染人現(xiàn)象。

ASFV是直徑為200 nm的正二十面體雙鏈DNA病毒,DNA核心直徑為70～100 nm，外周是直徑為170～190 nm的衣殼和含類脂的囊膜。該病毒對(duì)生存環(huán)境非常耐受，在糞便內(nèi)可存活11 d（室溫），熏肉和腌肉中可存活1～6個(gè)月，干肉中可存活10個(gè)月，凍肉中可存活3年以上。ASFV主要通過巨胞飲和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞方式進(jìn)入宿主細(xì)胞[1]，主要感染豬網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重影響宿主免疫系統(tǒng)。

1 流行病學(xué)及診斷

1921年，東非國(guó)家肯尼亞首次確認(rèn)非洲豬瘟疫情，隨后，ASF在非洲流行。1957年首次傳入歐洲（葡萄牙），1971年傳入美洲（古巴），2007年，首次傳播至歐亞接壤的格魯吉亞，隨后傳入亞美尼亞、阿塞拜疆和俄羅斯，并在高加索地區(qū)定殖。2012年傳入烏克蘭，2013年傳入白俄羅斯，2014年傳入拉脫維亞、愛沙尼亞。2017年，非洲豬瘟疫情以地中海和高加索山脈為基地，繼續(xù)西進(jìn)和東擴(kuò)，向西傳入捷克、羅馬尼亞，向東到達(dá)俄羅斯的秋明州、額爾斯克等西伯利亞地區(qū)[2-3]。2018年8月，我國(guó)遼寧確診首例疫情，之后我國(guó)多地檢出非洲豬瘟疫情，截至2019年2月，已有24個(gè)省份發(fā)生過家豬和野豬非洲豬瘟疫情。

ASFV傳播有多種途徑：一是直接接觸傳播，包括家豬-家豬、家豬-野豬、野豬-野豬之間的直接接觸傳播；二是經(jīng)環(huán)境間接傳播，ASFV對(duì)外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，在糞便中可存活11 d，在受污染豬圈內(nèi)可存活1個(gè)月，在腐爛血液中可存活15周，污染環(huán)境（豬舍、車輛、衣服、工具等）處理不徹底常是ASF反復(fù)暴發(fā)的重要原因；三是經(jīng)軟蜱傳播，軟蜱是ASFV的儲(chǔ)存宿主，軟蜱的交配和產(chǎn)卵也是病毒傳播的途徑，且病毒可在軟蜱組織內(nèi)存活數(shù)年時(shí)間。ASFV是一種蜱傳的大型DNA病毒，在豬、野豬和軟蜱之間具有復(fù)雜的傳播周期，并編碼150多種且一半功能未知的病毒蛋白。該病毒顯示出高遺傳和抗原多樣性，全球已鑒定出24種基因型和8種血清群。

ASF癥狀復(fù)雜，難以和普通豬瘟區(qū)別診斷，存活豬也常成為病毒攜帶者，繼續(xù)感染其他健康豬。豬感染ASFV后雖可產(chǎn)生特異性抗體，但目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)這些抗體具有中和作用和保護(hù)效果。根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理解剖可對(duì)ASF做出初步診斷，但確診需要通過病原檢測(cè)（包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、免疫熒光技術(shù)和血吸附試驗(yàn)等）、血清學(xué)檢測(cè)（間接免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光抗體法等）和分子生物學(xué)檢測(cè)（DNA原位雜交、常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等）[4]。

2 致病機(jī)理

ASFV主要經(jīng)呼吸道和消化道進(jìn)入豬體內(nèi)，病毒感染機(jī)體后，首先在扁桃體中進(jìn)行增殖，而后伴隨血液和淋巴系統(tǒng)侵入全身，引發(fā)病毒血癥，并在血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，侵襲血管和淋巴管，造成相應(yīng)器官組織出現(xiàn)漿液性滲出、出血、血栓和壞死等病理變化。病死豬經(jīng)常表現(xiàn)出全身組織器官出血、免疫系統(tǒng)受損、淋巴細(xì)胞減少等癥狀[5]。

ASFV感染的靶細(xì)胞主要是豬單核-巨噬細(xì)胞，此外也感染樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞等。病毒入侵細(xì)胞須受體-配體介導(dǎo)，但ASFV的受體和配體還不明確，病毒在受體介導(dǎo)下，通過巨細(xì)胞飲和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞飲兩種方式進(jìn)入細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒的復(fù)制和包裝等[1]。

3 基因組研究

ASFV基因組為末端共價(jià)閉合的單分子線狀雙鏈DNA，長(zhǎng)度為170～190 kb，基因組中央?yún)^(qū)是長(zhǎng)約125 kb的保守區(qū)，兩端序列長(zhǎng)度變化較大（左側(cè)約48 kb，右側(cè)約22 kb），兩端基因區(qū)含有數(shù)個(gè)多拷貝基因家族。由于兩端基因拷貝數(shù)不同，導(dǎo)致不同毒株間的基因長(zhǎng)度差異較大。ASFV整個(gè)基因組含有150多個(gè)開放讀框（ORF），可以編碼150～200種蛋白質(zhì)[6]。

ASFV編碼的蛋白質(zhì)眾多，按其功能可分為5類，即執(zhí)行DNA復(fù)制、修復(fù)和RNA轉(zhuǎn)錄功能的蛋白，病毒組裝和結(jié)構(gòu)蛋白，機(jī)體免疫調(diào)控蛋白，多拷貝基因家族和其他未分類蛋白[7]。

3.1 執(zhí)行DNA復(fù)制、修復(fù)和RNA轉(zhuǎn)錄功能的蛋白

參與DNA復(fù)制的ASFV基因有G1211R（編碼DNA聚合酶B）、E301R（編碼PCNA樣蛋白）、C962R（編碼核苷三磷酸酶）、F1055L（參與起始點(diǎn)復(fù)制）等[8-9]。ASFV入侵巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞會(huì)激發(fā)活性氧反應(yīng)機(jī)制破壞病毒基因組，ASFV可啟動(dòng)一系列基因表達(dá)修復(fù)DNA破損[10-11]，如由O174L（編碼DNA聚合酶X）、NP419L（編碼ATP依賴的DNA連接酶）和E296R（編碼脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶）組成的最小DNA修復(fù)機(jī)制。不同于其他病毒，ASFV的復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄大多依靠自身基因表達(dá)完成[8]，如 由EP1242L、C147L、NP1450L、H359L、D205R和CP80R編碼蛋白組成的病毒RNA聚合酶Ⅱ，G1340L、I243L等編碼的階段性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，以及參與轉(zhuǎn)錄本頭尾端修飾的NP868R編碼蛋白等[12]。

3.2 病毒組裝和結(jié)構(gòu)蛋白

參與ASFV組裝的蛋白有20多種[13-15]。pp220多聚體蛋白（CP2475L）酶切后的p150、p37、p34、p14蛋白，pp60（CP530R）酶切后的p35和 p15蛋白，以及SUMO樣蛋白（S273R）共同組成病毒核心殼，核心殼外包裹有源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的單層脂膜形成的正20面體莢膜。ASFV莢膜上含有p72蛋白（B646L）及其伴侶蛋白（B602L）和 p49蛋 白（B438L）。ASFV 內(nèi)膜上含有 p17（D117L）、p54（E183L）、j18L（E199L）和j5R（H108R）等膜蛋白。E120R編碼蛋白位于細(xì)胞內(nèi)病毒粒子的表面，可將病毒從裝配點(diǎn)傳送至膜表面。

3.3 機(jī)體免疫調(diào)控蛋白

ASFV之所以引發(fā)極高的感染率和致死率，其原因在于表達(dá)多種宿主免疫調(diào)控蛋白，操控巨噬細(xì)胞，對(duì)抗先天免疫和獲得性免疫，促進(jìn)病毒復(fù)制、增殖和感染[16-18]。如A238L編碼蛋白可抑制宿主NF-κB等免疫調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，I329L編碼蛋白可抑制Toll樣受體3信號(hào)通路，MGF360和MGF530多拷貝基因可抑制Ⅰ型干擾素反應(yīng)，DP71L編碼蛋白可阻止PKR或PERK等激酶磷酸化誘導(dǎo)的蛋白合成。此外，ASFV也編碼一些黏附蛋白來促進(jìn)受感染細(xì)胞和病毒顆粒與細(xì)胞外環(huán)境基質(zhì)的連接[19]，如CD2v蛋白胞外區(qū)序列與人CD2具有較高的同源性，其可以介導(dǎo)紅細(xì)胞與受感染細(xì)胞或病毒顆粒的結(jié)合，同時(shí)，CD2v也會(huì)抑制機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖。EP153R編碼的蛋白是Ⅱ型跨膜蛋白，含有一個(gè)和NK細(xì)胞受體相似的結(jié)構(gòu)域（C型凝集素），借助該結(jié)構(gòu)域，EP153R可抑制細(xì)胞MHCⅠ類抗原上調(diào)和受感染細(xì)胞凋亡，促進(jìn)病毒增殖。

3.4 多拷貝基因家族

ASFV基因組兩端含有一些重復(fù)可變區(qū)序列以及一些編碼基因，如MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505/530和p22。每個(gè)基因都有多個(gè)拷貝，基因頭尾方向一致且緊密排列，執(zhí)行特定的生理學(xué)功能[20]。

4 疫苗研究

鑒于ASFV對(duì)養(yǎng)豬業(yè)和國(guó)家經(jīng)濟(jì)及食品安全造成的巨大影響，疫苗研制成為許多科學(xué)家的研究主題，研究疫苗包括滅活疫苗、減毒疫苗、基因工程疫苗、亞單位疫苗和核酸疫苗等[21]。但迄今所有針對(duì)ASF的疫苗研發(fā)生產(chǎn)都告以失敗，主要原因是ASFV有一套完整的抗宿主疫苗應(yīng)對(duì)機(jī)制。ASFV基因組可編碼多種蛋白質(zhì)，用于干擾宿主的天然免疫系統(tǒng)，從而抑制和逃避免疫應(yīng)答反應(yīng)，為自身增殖和擴(kuò)散創(chuàng)造有力條件。

4.1 滅活疫苗

滅活疫苗通過物理或化學(xué)手段將病原體滅活，使其失去感染能力，但保留其抗原性?？茖W(xué)家們嘗試通過各種方法研制滅活A(yù)SF疫苗，包括經(jīng)加熱和甲醛等方法滅活的ASFV、用ASFV接種的肺泡巨噬細(xì)胞懸浮液制備的滅活疫苗、ASFV感染豬脾組織勻漿并經(jīng)弗氏佐劑乳化制備的滅活疫苗等，均未能提供有效的免疫保護(hù)[22]，即使借助Polygen或Emulsigen-D等免疫增強(qiáng)劑，ASF疫苗仍然沒有產(chǎn)生有效的保護(hù)[23]。

4.2 減毒疫苗

減毒疫苗是指致病力減弱但仍具有活力的完整病原疫苗。依據(jù)制備工藝，減毒疫苗可分為天然減毒株、傳代減毒株和基因工程重組減毒株3類。和滅活疫苗相比，減毒疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈持久的免疫應(yīng)答，但安全性是重點(diǎn)考慮的因素。目前報(bào)道的ASF減毒疫苗包括OURT88/3、NH/P68等天然弱毒株和豬骨髓源細(xì)胞，Vero細(xì)胞和COS-1細(xì)胞等傳代致弱毒株，但這些減毒疫苗均沒有產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，而一些疫苗在使用時(shí)還釀成嚴(yán)重的生物安全事故。如1963年，Manso等證實(shí)通過豬骨髓細(xì)胞傳代的ASF減毒疫苗可抵抗強(qiáng)毒株攻擊，隨后該疫苗在西班牙和葡萄牙進(jìn)行了田間試驗(yàn)，卻造成了災(zāi)難性后果，免疫后的豬均出現(xiàn)肺炎、流產(chǎn)和死亡等免疫副作用，且出現(xiàn)大量病毒攜帶者，后續(xù)隨訪觀察證實(shí)這些免疫動(dòng)物即使沒有ASF強(qiáng)毒株攻擊，很多仍會(huì)出現(xiàn)慢性感染，死亡率為10%～50%。很多病毒攜帶者雖能長(zhǎng)時(shí)間保持健康，但大多數(shù)最終發(fā)展為慢性肺炎或因急性發(fā)作而死亡。

基因工程減毒疫苗是指采用分子生物學(xué)方法，敲除病毒毒力基因或免疫抑制基因，降低病毒毒力或增加機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答，生產(chǎn)出比傳統(tǒng)減毒疫苗安全且效力更高的減毒活疫苗。已有研究表明，刪除ASFV的某些毒力基因，如TK、B119L[24]、DP71L[25]、MGF360/505[26]，減毒疫苗接種宿主后毒力減弱且呈現(xiàn)出一定的免疫保護(hù)效果。ASFV表達(dá)多種蛋白用于調(diào)控和逃避機(jī)體免疫，通過基因工程手段失活病毒的免疫調(diào)控基因如A238L[27]、CD2v編碼基因[19]、C 型凝集素編碼基因[28]等，也有助于增強(qiáng)減毒疫苗的免疫反應(yīng)。

4.3 亞單位疫苗

將含有中和表位的病毒保護(hù)性抗原基因通過原核和真核細(xì)胞表達(dá)，純化收獲的蛋白亞單位疫苗是新一代疫苗發(fā)展趨勢(shì)。與傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒疫苗相比，亞單位疫苗在不降低保護(hù)效率的前提下，其安全性也會(huì)有較大的提升。p72、p30和p54是ASFV感染后引發(fā)機(jī)體體液免疫的3個(gè)主要抗原，目前ASF亞單位疫苗研究也主要集中在這3種靶標(biāo)上[29-30]，但研究結(jié)果均不理想。如同時(shí)免疫含有p30和p54的亞單位疫苗，雖然在豬體內(nèi)檢測(cè)到高滴度的相應(yīng)抗體，但病毒感染結(jié)果顯示該疫苗只能提供50%的生存保護(hù)率，且存活宿主體內(nèi)仍然含有較高的ASFV[31]；另一研究顯示用桿狀病毒表達(dá)的p30、p54、p72和p22聯(lián)合疫苗雖然能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和性抗體，但ASFV感染試驗(yàn)卻完全沒有顯示出保護(hù)效能[32]。

CD2v是另一個(gè)ASFV亞單位疫苗研究的熱點(diǎn)靶標(biāo)，CD2v（EP402R編碼）蛋白位于病毒外膜，是與細(xì)胞CD2分子同源的蛋白，具有紅細(xì)胞吸附功能。研究顯示CD2v免疫豬可產(chǎn)生抗血紅素吸附抗體和抗單核細(xì)胞感染抗體，且對(duì)同型毒株產(chǎn)生部分保護(hù)作用[19]。此外，將CD2v和EP153R組成的嵌合疫苗也只能提供部分免疫保護(hù)[33]，提示除了CD2v等抗原外，還需要其他更多抗原的介入。研制ASF亞單位疫苗，需要對(duì)ASFV蛋白有更進(jìn)一步的了解。

4.4 核酸疫苗

核酸疫苗制備簡(jiǎn)單、成本低廉，可同時(shí)表達(dá)多種抗原且無毒力逆轉(zhuǎn)的危險(xiǎn)，被稱為繼減毒疫苗、亞單位蛋白疫苗之后的第三代疫苗。ASF核酸疫苗大多是將ASFV保護(hù)性抗原基因構(gòu)建成真核表達(dá)載體進(jìn)行制備免疫，不過其免疫療效相比于蛋白疫苗也未獲得明顯提高，仍然不能提供有效保護(hù)。如用CD2v、p30和p54等3種蛋白胞外區(qū)編碼基因組成的三聯(lián)DNA疫苗免疫動(dòng)物，也只有25%的保護(hù)效果[34]。Lacasta等通過表達(dá)文庫(kù)構(gòu)建了4029個(gè)表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行了免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，其保護(hù)率只能達(dá)到60%，不過免疫攻毒后存活的豬無排毒現(xiàn)象[35]。

4.5 基于ASFV受體和保護(hù)性抗原的疫苗研究

目前介導(dǎo)ASFV入侵細(xì)胞的受體和關(guān)鍵抗原還不明確。細(xì)胞攻毒保護(hù)試驗(yàn)曾發(fā)現(xiàn)CD163是ASFV的受體，CD163表達(dá)強(qiáng)弱與ASFV感染程度具有正相關(guān)性，但利用CRISPR/Cas9敲除CD163基因的轉(zhuǎn)基因豬并沒有顯示出對(duì)ASFV的有效抵抗力，證明CD163不是ASFV的受體[36]。研究表明p12蛋白可能是介導(dǎo)病毒入侵的關(guān)鍵抗原，但在ASFV感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，加入過量p12抗體并沒有有效阻斷病毒結(jié)合和感染，提示p12并不是介導(dǎo)病毒吸附的惟一抗原。研究顯示p32、p72和p54在病毒吸附細(xì)胞過程中也具有重要作用[32,37]，p72和p54可促進(jìn)病毒和巨噬細(xì)胞的結(jié)合，而p32有助于病毒內(nèi)化。ASFV的受體是哪些，有待進(jìn)一步深入探討。

5 結(jié)語

非洲豬瘟作為一種重要的動(dòng)物疫病，具有傳染性強(qiáng)、死亡率高、缺少有效的疫苗預(yù)防等特征。開展對(duì)ASFV的相關(guān)研究，尤其是病原學(xué)和病毒免疫逃逸研究尤為重要。ASFV具有復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)，編碼表達(dá)大量病毒復(fù)制非必需蛋白，弄清這些蛋白的功能，分析病毒免疫逃逸的機(jī)理和致病機(jī)制，尋找病毒入侵細(xì)胞的關(guān)鍵抗原和細(xì)胞受體，將為ASF的防控奠定理論基礎(chǔ)，并對(duì)疫苗開發(fā)和疾病防控提供指導(dǎo)作用。