紫花苜蓿的皂苷研究

羅 雯，王 丹，邊佳輝，孫占敏，唐益雄，吳燕民

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種優(yōu)質(zhì)多年生豆科牧草，其草產(chǎn)量高、適口性好，為家畜所喜食，且具有廣泛的適應(yīng)性。在我國的種植面積約450萬hm2，主要分布于東北、華北和西北地區(qū)[1]。紫花苜蓿營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量居牧草首位，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和畜牧業(yè)中扮演著重要的角色[2]。苜蓿不僅是優(yōu)質(zhì)的青貯飼料，同時也可直接放牧，而且還能有效提高土壤肥力常被用于土壤的生物修復(fù)等諸多方面。

紫花苜蓿富含多種植物次生代謝產(chǎn)物，包括皂苷、黃酮、葉蛋白、多糖等[3]。其中苜蓿皂苷是一種重要的活性物質(zhì)，不僅能調(diào)節(jié)脂類代謝，降低膽固醇，還具有抗氧化、抗腫瘤等功能[3]。20世紀(jì)50年代，國外一些研究者對苜蓿皂苷進(jìn)行了提取及分離，并進(jìn)一步分析了其結(jié)構(gòu)及生物功能。對于苜蓿皂苷合成途徑的研究已經(jīng)很多，但分子水平的研究依然不是很清楚。苜蓿皂苷為五環(huán)三萜烯類化合物，其合成途徑是以2個法尼基焦磷酸(FPP)縮合生成鯊烯通過甲羥戊酸途徑和甲基赤蘚糖醇磷酸途徑合成[4]。目前已經(jīng)從紫花苜蓿中克隆出了皂苷合成控制基因法尼基二磷酸合成酶基 因 FPPS (farnesyl diphosphate synthase)、GGPPS(geranylgeranyl diphosphate synthase)、IPI (isopentenyl diphosphate isomerase)[5]。紫花苜蓿皂苷的研究目前處于起步階段，通過對其基本性質(zhì)和提取、分離的研究，可以對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療等行業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 苜蓿皂苷的理化性質(zhì)

皂苷(saponin)又名皂甙、皂角苷。皂苷是存在于多種植物物種中結(jié)構(gòu)多樣化的一類化合物，其特征為具有結(jié)合了糖配基的前體氧化角鯊烯衍生的C30骨架[6]。由皂苷元與糖基、糖醛酸或其他有機(jī)酸組成，通常被分為三萜類皂苷和甾體皂苷，也可以分為三萜類皂苷、螺甾醇皂苷和呋喃甾醇皂苷[7]。主要分布于陸地高等植物中，也少量存在于海星和海參等海洋生物中。許多中草藥如人參(Panax ginseng)、 遠(yuǎn) 志 (Polygala tenuifolia)、 桔 梗(Platycodon grandiflorus)、甘草 (Glycyrrhiza uralensis)、知母(Anemarrhena asphodeloides)和柴胡(Radix bupleuri)等的主要有效成分都含有皂苷。

苜蓿皂苷(alfalfa saponin)是從紫花苜蓿中提取的一種多功能生物活性物質(zhì)，其水溶液振蕩時容易產(chǎn)生與肥皂相似蜂窩狀的泡沫，因此被稱作皂苷。苜蓿皂苷結(jié)構(gòu)可分解為皂苷元與糖配基，其中皂苷元具有親脂性，糖配基具有親水性[8]。因其同時具有兩性，多為無定形白色粉末，少數(shù)呈結(jié)晶狀，如常春藤(Hedera nepalensis)皂苷為針狀結(jié)晶；多具有吸濕性，味苦，皂苷的溶解度根據(jù)其分子中結(jié)合糖基的數(shù)目而有不同。一般可溶于水，易溶于熱水、熱甲醇及熱乙醇，不溶于極性小的有機(jī)溶劑(如乙醚等)。苜蓿皂苷結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，主要由糖中羥基或非糖類化合物的羥基以縮醛鏈脫水縮合而成的環(huán)狀縮醛物[9]，均為齊墩果烷(oleanane)型五環(huán)三萜烯類化合物(圖1)。第3位均為β構(gòu)型的羥基或苷化，第28位多連接羧基并且常苷化，第23、24位多羥基化或羧基化，糖部分主要為葡萄糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、芹菜糖、半乳糖等[10]。Bialy等[11]從苜蓿根中分離鑒定出24種皂苷，分別為13種苜蓿酸(medicagenic acid)、2 種 Zanhic acid、4 種常春藤皂苷元(hederagenin)、1種大豆皂醇A(soyasapogenol A)、2 種大豆皂醇 B(soyasapogenol B)、1 種大豆皂醇 C(soyasapogenol C)和1 種 貝 萼 皂 苷(bayogenin glycoside)。

圖1 三萜皂苷結(jié)構(gòu)Figure 1 Structure of triterpenoid saponins

2 苜蓿皂苷的分布及含量

苜蓿皂苷在苜蓿植物體內(nèi)各個組織均有分布，包括根、莖、葉等，種子中也含有皂苷。張俏燕等[12]以中苜1號為研究對象測定各個組織中總皂苷的含量，發(fā)現(xiàn)中苜1號中皂苷含量表現(xiàn)為根 ＞ 葉 ＞莖，種子中總皂苷含量與莖接近。Nowacka和Oleszek[13]利用液相色譜技術(shù)分析苜蓿中皂苷含量時發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿地下部分皂苷含量顯著高于地上部分。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[14]顯示，紫花苜蓿不同組織中皂苷含量大致趨勢為根 ＞ 葉 ＞ 莖。也有報道指出，苜蓿各個組織中葉的皂苷含量極顯著高于根和莖部，而根部的皂苷含量高于莖[15]。紫花苜蓿不同品種間總皂苷含量不同，同一品種各個組織中皂苷含量也存在差異，有報道[16]證實同一苜蓿品種相同組織在不同生長階段中的苜蓿皂苷含量并非穩(wěn)定不變。張吉明等[17]比較不同苜蓿品種、刈割時期及不同青貯添加劑處理紫花苜蓿時總皂苷的含量，發(fā)現(xiàn)不同苜蓿品種間總皂苷含量差異極顯著(P＜0.01)，總皂苷含量范圍為0.69%～0.98%；第2茬不同生育期比第1茬相應(yīng)時期皂苷含量都有增加趨勢，不同生育期以現(xiàn)蕾期含量最高；青貯苜蓿中添加蔗糖和綠汁能夠極顯著(P ＜0.01)提高苜蓿中皂苷含量；青貯苜蓿皂苷含量也顯著 (P＜0.01)高于鮮草。Jin[15]通過比較黃花苜蓿(M. falcate)、天藍(lán)苜蓿(M. lupulina)和紫花苜蓿間皂苷含量及分布狀況，發(fā)現(xiàn)根部皂苷含量高于莖葉，紫花苜蓿皂苷含量高于其他兩種。皂苷在不同屬間和品種間的動態(tài)變化各不相同，在不同組織中的分布也不同，在9種豆科牧草整個生育時期，均表現(xiàn)為葉片中的含量高于莖稈中的；紫花苜蓿的總皂苷含量高于小冠花(Coronilla varia)和百脈根(Lotus corniculatus)，是提取皂苷的優(yōu)質(zhì)材料[18]。沈靜等[19]通過丙酮沉淀法提取了7種豆科牧草中的皂苷，研究發(fā)現(xiàn)小冠花的皂苷含量最高，紫花苜蓿甘農(nóng)3號次之，百脈根皂苷含量最低。

紫花苜蓿中含有豐富的皂苷，測定其含量的方法包括比色法、溶血法、薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)等[20-21]。

比色法：由于苜蓿皂苷的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，一般對其含量進(jìn)行檢測時需要先進(jìn)行水解處理，以消除可溶性糖和酚類化合物對測定結(jié)果的影響。吳芳等[22]發(fā)現(xiàn)，香草醛-高氯酸顯色法抗干擾能力較香草醛-濃硫酸顯色法及Libemann-Bruchard顯色法強(qiáng)。

溶血法：苜蓿皂苷具有溶血性，根據(jù)其導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂的能力來測定苜蓿皂苷的含量。Oleszek[23]使用不同方法(溶血指數(shù)測試和溶血微量測定法)檢測了幾種不同的苜蓿皂苷溶血活性，結(jié)果表明，皂苷結(jié)構(gòu)及檢測方法不同都會導(dǎo)致所得結(jié)果的不同。

薄層色譜法(TLC)：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品，在測定之前需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在薄層上通過多次吸附-解吸附的方法來達(dá)到分離的目的，進(jìn)而對待檢測物質(zhì)進(jìn)行定量分析。許舒雯等[24]利用快速薄層掃描法對苜?？傇碥蘸窟M(jìn)行了測定。測定過程簡單快捷，結(jié)果也相對較準(zhǔn)確。

高效液相色譜法(HPLC)：Huhman和Sumner[25]通過優(yōu)化后的HPLC耦合電噴霧離子阱質(zhì)譜方法從紫花苜蓿和蒺藜苜蓿葉片中分離鑒定出了三萜皂苷，其中從紫花苜蓿中鑒定出15種。

以上為4種常見的苜蓿皂苷含量檢測方法，各有特點(表1)，目前應(yīng)用較廣泛的方法為高效液相色譜法。

表1 4種苜蓿皂苷定量檢測方法的對比Table 1 Comparison of four quantitative detection methods for alfalfa saponins

3 苜蓿皂苷的提取及分離技術(shù)

3.1 苜蓿皂苷的提取

較為常用的苜蓿皂苷提取方法有有機(jī)溶劑沉淀法、正丁醇提取法、物理輔助提取法和微生物酵解法[28-29]。

有機(jī)溶劑沉淀法：利用皂苷在甲醇、乙醇中的溶解度大，在丙酮、乙醚中的溶解度小這一化學(xué)性質(zhì)，首先用乙醇提取，緊接著在醇溶液中加入丙酮，可以使皂苷析出沉淀[28-31]。

正丁醇提取法：適用于提取各類植物的皂苷。該方法利用皂苷在含水丁醇或戊醇中溶解度較大，且能與水分成兩相的性質(zhì)，將皂苷從水飽和的丁醇或戊醇提取出來，從而與親水性大的糖和蛋白質(zhì)等分離開來[32]。

物理輔助提取法：利用了超聲波的強(qiáng)烈振動和空化效應(yīng)的提取方法可以得到更理想的提取物[33]。

微生物酵解法：由于苜蓿皂苷在植物細(xì)胞壁木質(zhì)素的包裹下難以降解，所以極大的影響了皂苷的提取。通過微生物法篩選出了分解木質(zhì)素能力較強(qiáng)的雜色云芝，漆酶作為雜色云芝的分泌物，可分解人參提取人參皂甙[34]。

苜蓿皂苷的提取工藝發(fā)展迅速，方法非常豐富，不同需求選擇的方法不同，列舉出應(yīng)用較多的4種提取方法的優(yōu)缺點(表2)。

表2 4種苜蓿皂苷提取方法的對比Table 2 Comparison of four methods of extracting saponins from alfalfa

3.2 苜蓿皂苷的分離

常用的苜蓿皂苷分離的方法有大孔吸附樹脂法、高速逆流色譜法、分段沉淀法、泡沫分離法[35]。

大孔吸附樹脂法：其原理是由其本身多孔性結(jié)構(gòu)所決定的，是一種吸附性與篩選性原理相結(jié)合的分離材料[36]。

高速逆流色譜法：竇德強(qiáng)等[37]用展開劑對分離組進(jìn)行了薄層色譜(TLC)鑒定，結(jié)果表明，分離得到了純度較好且重現(xiàn)性好的人參皂苷Re及Rg1。該方法是一種不用任何固體載體或支撐體的液液分配色譜技術(shù)，其分離效率高，得到的提取純度大，不存在對樣品的吸附和污染。也就是說在試驗過程中樣品幾乎無損失，適用于制備性提取[36]。

分段沉淀法：利用皂苷難溶于乙醚、丙酮的特性。蘇永昌等[38]采取了將粗皂苷溶于少量甲醇或乙醇中，然后逐滴加入乙醚、丙酮或乙醚-丙酮的混合溶劑，開始析出含雜質(zhì)較多的沉淀物質(zhì)，再繼續(xù)加入乙醚可得到純度較高的皂苷。

泡沫分離法：用正丁醇與乙酸乙酯作浮選溶劑，動態(tài)泡沫浮選法對二醇型人參皂苷具有很好的富集效果，所以采用泡沫分離法中的動態(tài)泡沫浮選法，其回收率均大于90%[39]。操作過程中將原料液加入分離塔中，塔底通氣；富集得到的泡沫由塔頂排入貯槽，貯槽中的泡沫自然破裂后收集，經(jīng)泡沫分離得到的殘留液由塔頂?shù)钩?，從而得到泡沫液中竹?jié)參總皂苷[40]。

苜蓿皂苷分離技術(shù)的研究已經(jīng)相當(dāng)成熟，列舉了4種分離技術(shù)的優(yōu)缺點(表3)。

4 苜蓿皂苷的應(yīng)用

4.1 調(diào)節(jié)脂類代謝，降低膽固醇

動物體內(nèi)膽固醇來源分為兩個部分：一部分是來源于日常攝入的食物中，另一部分(也是最主要的部分)由肝臟合成[41]。Oleszek[42]認(rèn)為苜蓿皂苷通過減低飼料適口性或降低消化吸收能力的途徑對單胃動物產(chǎn)生有害作用。苜蓿皂苷可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)脂類代謝從而降低膽固醇的含量。大量試驗證明，適量在單胃動物日糧中添加苜蓿皂苷是有益于動物生長的。雒愛玲[43]在肉雞仔日糧中添加苜蓿皂苷，0.08%的添加量效果最好，能有效改善肉仔雞脂質(zhì)代謝，有效地減少肝臟膽固醇的合成，能影響或阻斷膽汁酸的腸肝循環(huán)。給健康的Hailanhe蛋雞日糧中添加苜蓿皂苷，發(fā)現(xiàn)雞蛋中蛋黃膽固醇和蛋白膽固醇無顯著變化[44]。邴飛虹等[45]在給大鼠飼喂高脂飼料后在其飼料中添加苜蓿皂苷，證明了苜蓿皂苷能夠明顯降低低密度脂蛋白(LDL-C)從而降低血清中總膽固醇(TC)含量。苜蓿皂苷還可有效降低高血脂白鼠血管中低密度脂蛋白的含量[46]。對靈長類動物也同樣有降低膽固醇的作用，Malinow等[47]對8只食蟹猴(Macaca fascicularis)進(jìn)行膽固醇的測定，發(fā)現(xiàn)在飼喂了苜蓿皂苷后雖然其體內(nèi)高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)含量沒有變化，但總膽固醇含量降低了，因此得出苜蓿皂苷在食蟹猴體內(nèi)降低了膽固醇的腸吸收，增加了內(nèi)源性和外源性中性類固醇和膽汁酸隨糞便排出的量，并降低了糞便中脫氧膽酸和石膽酸的百分比。雖然苜蓿皂苷在臨床上的研究與應(yīng)用不多，但在一些國家苜蓿已經(jīng)被做成蔬菜沙拉、藥片或果汁的形式，用于降低血清膽固醇。

表3 4種苜蓿皂苷分離方法的對比Table 3 Comparison of four methods for the separation of alfalfa saponins

4.2 具有抗氧化、抗腫瘤的功能

人體衰老、癌癥的發(fā)生或其他病變都與氧化作用有密切的聯(lián)系，氧化產(chǎn)生的自由基是衰老的“罪魁禍?zhǔn)住?。苜蓿皂苷具有抗氧化的功效，其作用機(jī)理包括減少自由基合成的原料及增加分解自由基的酶類物質(zhì)[48]。張勇[49]在研究中發(fā)現(xiàn)，肉仔雞日糧中添加苜蓿皂苷，血清和肝臟谷胱甘肽過氧化物酶(GSH- Px)都有不同水平的提高，丙二醛(MDA)水平降低，在一定程度上保護(hù)了機(jī)體免受脂質(zhì)過氧化物的損傷，增強(qiáng)了機(jī)體抗氧化能力。近期有研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿皂苷純化物有潛力作為消除人體宮頸細(xì)胞(HeLa)和乳腺腺癌細(xì)胞(MCF-7)的抗癌劑或抗癌劑的引導(dǎo)劑，將苜蓿皂苷與抗癌金屬順氯氨鉑結(jié)合，發(fā)現(xiàn)其對人類結(jié)腸癌的抑制效果明顯增強(qiáng)[50]。苜蓿中提取的皂苷在試驗中用來驗證其抗癌特性的研究并不多，但其他植物中三萜皂苷的抗癌功能已經(jīng)通過多方面的驗證。

4.3 具有抑菌、殺蟲的作用

皂苷需要與膽固醇相結(jié)合才能發(fā)揮其抑菌作用，通過與細(xì)胞膜上的麥角固醇結(jié)合破壞細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu)，增大細(xì)胞膜滲透性，從而抑制菌類生長[51]。Jurzysta和Waller[52]以模式真菌—綠色木霉菌(Trichoderma viride)為研究對象證明了在培養(yǎng)基中添加極低濃度的苜蓿皂苷即可完全抑制其生長。在培養(yǎng)基中加入不同濃度從紫花苜蓿中提取的苜蓿皂苷研究7種真菌的生長速度，結(jié)果表明添加濃度為 1 mg·mL-1時對真菌生長抑制效果最明顯[53]。李波等[54]通過測定7種菌(包括細(xì)菌和真菌)在苜蓿皂苷提取液中的活性，發(fā)現(xiàn)皂苷對大腸桿菌及枯草芽孢桿菌具有抑制作用。

從生態(tài)學(xué)角度來看，植物次生代謝物的出現(xiàn)和分布可能與植物對食草動物的防御策略有關(guān)。為了限制微生物，昆蟲或脊椎動物捕食造成的損害，植物已經(jīng)開發(fā)出復(fù)雜的代謝途徑來產(chǎn)生與防治害蟲和病原體相關(guān)的特定的次生化合物[55]。皂苷對昆蟲具有毒性作用，表明其具有保護(hù)植物免受昆蟲啃食的作用[56]。在灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)幼蟲時期喂食苜蓿皂苷，造成其幼蟲期及蛹期延長，延緩生長，死亡率增加并且繁殖力降低，這些影響中至少有一部分可能是由于食物滯留時間延長而引起的消化問題[57]。從紫花苜蓿葉中提取皂苷混合物研究其殺蟲活性，結(jié)果表明，葡萄蛾(Lobesia botrana) 幼蟲的死亡率隨著飼料中皂苷含量的增加而增加[58]。蟲害是限制我國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要原因之一[59]，因此研究苜蓿皂苷的殺蟲特性具有重要的現(xiàn)實意義。

4.4 對反芻動物的影響

紫花苜蓿因其營養(yǎng)全面、適口性好等優(yōu)勢已經(jīng)成為了現(xiàn)代畜牧業(yè)不可缺少的部分[60]。從苜蓿中提取苜蓿皂苷注入成年閹割了的綿羊瘤胃中，保持其瘤胃及十二指腸中含有等能量的飼糧，結(jié)果表明，添加苜蓿皂苷能夠有效降低瘤胃微生物的發(fā)酵和氮素的降解，瘤胃內(nèi)原蟲數(shù)量減少[61]。張建剛等[62]對山羊進(jìn)行了體外瘤胃微生物發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)瘤胃細(xì)菌培養(yǎng)液在添加皂苷后揮發(fā)性脂肪酸含量升高，pH較對照組低。王雅倩等[63]對山羊瘤胃微生物進(jìn)行體外試驗，通過添加適量的苜蓿皂苷可以有效提高瘤胃內(nèi)酸性物質(zhì)含量，提高消化率，改善瘤胃發(fā)酵環(huán)境。Liu等[64]選取50只公羔羊在日糧中添加苜蓿皂苷，90 d后發(fā)現(xiàn)添加苜蓿皂苷對羔羊的平均日增重沒有影響，隨著苜蓿皂苷劑量的增加，養(yǎng)分消化率逐漸增加。對反芻動物進(jìn)行放牧管理時家畜在大量采食苜蓿后容易引起臌脹病，引起臌脹病的原因為苜蓿皂苷在反芻動物瘤胃內(nèi)含量過高[65]。目前引起鼓脹病的機(jī)理還沒有研究清楚，因此在反芻動物的飼養(yǎng)過程中需要注意日糧的精粗搭配[66]。

4.5 其他作用

豆科植物根瘤菌具有植物固氮的功能，大田農(nóng)耕經(jīng)常會選擇豆科植物與其他作物輪作或?qū)⒍箍浦参锱c其他植物種精選混播，但這種處理方式并沒有能夠提高其產(chǎn)量，有研究證明可能是苜蓿皂苷的化感作用造成的[67]。化感作用是指植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物抑制或促進(jìn)其他植物的生長和發(fā)育[68]?？梢詫④俎Ｗ鳛榘樯魑?，或是利用苜蓿殘茬等手段來控制田間的惡性雜草蒲公英(Taraxacum mongolicum)、 白 茅 (Imperata cylindrica)、 野 莧菜(Amaranthus blitum)等[69]。血鸚鵡魚作為一種觀賞魚類，因其獨(dú)特的花紋而著名，苜蓿皂苷能夠促進(jìn)其對蝦青素的吸收，從而改善魚體的色澤等指標(biāo)提高市場價值[70]。

5 苜蓿皂苷的應(yīng)用前景及展望

隨著人類社會的發(fā)展，越來越多的人開始追求綠色、有機(jī)、健康的生活。紫花苜蓿是一種可持續(xù)利用的綠色資源，而苜蓿皂苷作為一種純天然的植物次生代謝物質(zhì)，具有多種功能，因此具有良好的應(yīng)用前景[71]。

首先，紫花苜蓿是營養(yǎng)價值最高的牧草之一，在動物飼料方面的應(yīng)用很廣泛，苜蓿皂苷可以作為一種天然的飼料添加物，以增加家畜對飼料的消化率，保持營養(yǎng)平衡[64]；促進(jìn)家禽脂質(zhì)代謝，在生產(chǎn)低膽固醇肉雞及雞蛋方面可以開發(fā)利用[72]。其次，苜蓿皂苷能夠有效降低動物體內(nèi)膽固醇含量，在醫(yī)藥方面可以用作研制治療心血管以及動脈粥樣硬化等疾病的藥物[73]。近年來，苜蓿皂苷被發(fā)現(xiàn)對于部分腫瘤、癌癥具有有益的作用，未來在開發(fā)抗癌藥物時是一個很好的切入點；苜蓿皂苷除了在動物生產(chǎn)及醫(yī)藥方面具有重要的作用以外，在大田病蟲害防止以及化妝品行業(yè)均具有良好的利用價值。苜蓿皂苷可以作為一種低毒農(nóng)藥，在防止病蟲害方面發(fā)揮作用?？寡趸悄壳盎瘖y品研發(fā)的最熱門方向之一，苜蓿皂苷具有一定的抗氧化功能[74]，又可以直接從植物中提取，因此在研制純天然綠色的護(hù)膚品過程中可以發(fā)揮重要作用。

目前市面上皂苷含量較高的苜蓿品種包括阿爾岡金、甘農(nóng)3號、新疆大葉等[75]，皂苷具有多種多樣的生物學(xué)功能，因此培育皂苷含量高的苜蓿品種也將成為熱門研究。