DEPDC1基因在非肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)及臨床意義

趙文超，王敬晗，祝建勇，趙錦標(biāo)，安 陽(yáng)，李景波，邱寶安，夏念信

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC；簡(jiǎn)稱肝癌)在世界范圍內(nèi)是發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，在我國(guó)亦是如此。目前認(rèn)為HCC發(fā)生主要與乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)和丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV)感染相關(guān)[1]。但非肝炎病毒性肝癌(多數(shù)為非乙肝丙肝相關(guān)性肝癌，non-B non-C HCC,NBNC-HCC)也占相當(dāng)比例，且更容易被忽視。NBNC-HCC患者的背景肝病多與代謝性疾病相關(guān)，主要包括非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，其他包括酒精性脂肪性肝病、肥胖、糖尿病等[2]。近期有來自日本的統(tǒng)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)，在肝炎病毒流行得以逐步控制的今天，NBNC-HCC的發(fā)生率有逐步增加的趨勢(shì)[3]，其相關(guān)危險(xiǎn)因素、預(yù)后結(jié)果等尚存爭(zhēng)議。原因在于對(duì)于此類肝癌患者的臨床特點(diǎn)和與常見肝炎病毒相關(guān)性肝癌的發(fā)病機(jī)理之間缺乏對(duì)比研究[4]。對(duì)NBNC-HCC在生物學(xué)行為、分子機(jī)制領(lǐng)域的探討，有助于改變我們對(duì)此類肝癌患者的認(rèn)識(shí)，并改善其預(yù)后。

人含DEP結(jié)構(gòu)域1(DEP domain containing 1，DEPDC1)基因位于染色體1p31.2，全長(zhǎng)約23 Kb，其表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞膜錨定、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞極性確立、小分子GTP酶活性密切相關(guān)[5]。有研究表明在膀胱癌中，下調(diào)DEPDC1的表達(dá)可明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[6]。同時(shí)還有研究顯示乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展與DEPDC1相關(guān)[7]。目前DEPDC1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用報(bào)道較少，且多集中于肝炎、肝硬化背景下的肝癌，尚未有在NBNC-HCC中的比較研究。本研究收集了大量NBNC-HCC臨床樣本，旨在初步評(píng)估DEPDC1基因表達(dá)與NBNC-HCC的發(fā)生及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2007年6月—2014年6月間解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心肝膽外科手術(shù)切除、經(jīng)病理切片證實(shí)的56例NBNC-HCC冰凍組織和石蠟標(biāo)本(同時(shí)每例患者另取距癌組織2～5 cm處的癌旁組織標(biāo)本作為對(duì)照)，并搜集患者的臨床病例資料。其中男32例，女24例，中位年齡48(21～67)歲。患者隨訪64個(gè)月，中位生存時(shí)間45個(gè)月。同時(shí)對(duì)56例肝癌組織及其癌旁組織抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的分析。

1.2 主要抗體及試劑 實(shí)時(shí)定量PCR所用熒光標(biāo)記物SYBR Green Mix購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；兔抗人DEPDC1pAb抗體(HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Ahmar公司)。TRIzol reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；甲醇、無水乙醇均購(gòu)自上海試劑一廠；Annexin V-硫氰酸熒光素凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。DEPDC1引物序列上游:5′-CACTGGGTATTA TCTGCCATGAAG3′；下游：5′-AATCTGCGATTGTI CTGAATACATO-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為112 bp。GAPDH引物序列上游：5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGTATO 3′；下游:5′-GATGGCATGGACTGTGGTCAT 3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為154 bp，由美國(guó)Invitrogen公司合成。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)DEPDC1蛋白的表達(dá) 將所有肝癌及其癌旁組織進(jìn)行4 mm連續(xù)切片，石蠟包埋，應(yīng)用cyclin G1多抗進(jìn)行免疫組化SP法染色。具體操作步驟：①石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，以清除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；②抗原微波熱修復(fù)3 min，抗原修復(fù)液為pH6.0檸檬酸緩沖液；③3.5%～10%正常山羊血清封閉非特異性位點(diǎn)，室溫孵育10 min；④傾去血清，滴加cyclin GI-抗工作液37 ℃孵育過夜；⑤滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，濕盒中孵育20 min;⑥滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，濕盒中孵育20 min。上述步驟之間均用0.01 mmol/L PBS(pH=7.4)沖洗。二氨基聯(lián)苯胺染色，自來水沖洗、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核、封片。結(jié)果判定：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈清晰黃褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，高倍鏡(×400)下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，染色強(qiáng)度：無染色0分，輕度染色計(jì)1分，中度染色計(jì)2分，強(qiáng)染色3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%計(jì)0分,10%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。2項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分相乘，0～1分為陰性病例(-)，≥2分為陽(yáng)性病例(+)，≥4分為強(qiáng)陽(yáng)性病例(++)。由2名病理科醫(yī)師雙盲法計(jì)數(shù)，差異超過10%需重新計(jì)數(shù)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝癌組織及癌旁組織中DEPDC1 mRNA的表達(dá) 將收集的肝癌及癌旁組織碾碎，分別置于1.5 mL EP管中，Trizol reagent收集組織，根據(jù)試劑盒說明的步驟進(jìn)行RNA的抽提，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃延伸30 s，39個(gè)循環(huán)，72～95 ℃溶解曲線分析5 s。以雙Ct值法計(jì)算靶基因相對(duì)表達(dá)水平：DEPDC1相對(duì)表達(dá)水平=(ΔCt)；ΔCt=Ct(DEPDC1)-Ct(GAPDH)；Δ(ΔCt)=ΔCtΔCt(Control)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEPDC1蛋白在肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)水平 首先免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)了56例NBNC-HCC及其癌旁組織中DEPDC1蛋白的表達(dá)情況，免疫組化染色(圖1)所示，陽(yáng)性染色主要位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色或褐色，56例肝癌組織DEPDC1染色均呈陽(yáng)性著色，且肝癌組織中的表達(dá)(7.83±0.17)顯著高于癌旁組織(4.67±0.22)，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 DEPDC1 mRNA在肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)水平 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)56例手術(shù)切除的NBNC-HCC組織及其癌旁組織中DEPDC1 mRNA的表達(dá)，研究結(jié)果(圖2)顯示，DEPDC1 mRNA在41例肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織中的表達(dá)，高表達(dá)率為73.2%(41/56)。研究提示DEPDC1基因在大多數(shù)肝癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，DEPDC1基因有可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

圖1 免疫組化染色法檢測(cè)DEPDC1蛋白在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(sp×100)

圖2 DEPDC1 mRNA在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

2.3 DEPDC1的表達(dá)與NBNC-HCC臨床病例特征的相關(guān)性 整理入組的56例NBNC-HCC患者相關(guān)臨床病例資料，結(jié)合DEPDC1免疫組織化學(xué)染色和評(píng)分情況行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以肝癌組織中DEPDC1表達(dá)評(píng)分的中位數(shù)為界值，高于此界值定義為DEPDC1高表達(dá)組，低于此界值定義為DEPDC1低表達(dá)組。DEPDC1高、低表達(dá)組的患者臨床特征見表1。肝癌患者在DEPDC1高表達(dá)組，其腫瘤分化程度較低表達(dá)組低；TNM分級(jí)較低表達(dá)組晚；甲胎蛋白DEPDC1高表達(dá)組明顯高于低表達(dá)組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)DEPDC1高表達(dá)組的微血管癌栓發(fā)生率為69.7%，較低表達(dá)組34.5%明顯增高，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DEPDC1表達(dá)與肝癌患者年齡、性別、腫瘤大小未見明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)。

2.4 DEPDC1的表達(dá)與NBNC-HCC預(yù)后的相關(guān)性 56例NBNC-HCC患者進(jìn)行預(yù)后隨訪，整理預(yù)后信息，在肝癌組織中DEPDC1的高、低表達(dá)可較好地預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后情況。DEPDC1高表達(dá)組患者預(yù)后較差(中位總體生存期為42個(gè)月)，而DEPDC1低表達(dá)組患者預(yù)后較好(中位總體生存期為56個(gè)月)，DEPDC1低表達(dá)組與高表達(dá)組相比，其總體生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3)。

表1 DEPDC1表達(dá)程度與腫瘤臨床病例數(shù)據(jù)之間的關(guān)系

圖3 總體生存期曲線

3 討論

近年來流行病學(xué)研究顯示，隨著抗肝炎病毒藥物的不斷發(fā)展，病毒相關(guān)性肝癌的發(fā)病率則呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)。相反，NBNC-HCC的發(fā)病率逐步升高，占所有肝癌病例的6.8%～17.3%[2]?？梢灶A(yù)見NBNC-HCC的治療將逐步得到重視。由于既往NBNC-HCC在所有肝癌患者中僅占據(jù)較少部分，且由于其背景疾病涉及范圍較廣，包括酒精性肝病、NAFLD、代謝性疾病(糖尿病、高脂血癥、含鐵血黃素沉積癥)等[2]，導(dǎo)致其相關(guān)臨床特點(diǎn)較復(fù)雜，研究較少。其與肝炎相關(guān)性肝細(xì)胞癌在分子機(jī)制、細(xì)胞通路方面的異同，也缺乏比較研究。

目前，手術(shù)切除仍然是治療肝細(xì)胞癌的最有效手段。然而，由于肝癌起病較隱匿，大多數(shù)患者確診時(shí)已無法手術(shù)切除。由于NBNC-HCC患者背景肝病發(fā)病率較高，難以得到重視，早期發(fā)現(xiàn)的概率較低，因此有部分研究提示NBNC-HCC患者手術(shù)切除率比肝炎病毒相關(guān)性肝癌患者低[8]。對(duì)于接受手術(shù)的患者，術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是影響手術(shù)效果的首要原因，手術(shù)僅僅是治療的一環(huán)，多學(xué)科、多手段綜合治療逐步成為主流?；谏鲜霈F(xiàn)狀，研究NBNC-HCC發(fā)生發(fā)展過程中的基因變化，篩選藥物治療的靶點(diǎn)，有著重要的臨床意義。

DEPDC1基因編碼一種高度保守的蛋白，大小約92 kDa。該蛋白作用廣泛，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞有絲分裂以及凋亡。其在膀胱癌、前列腺癌、多發(fā)骨髓瘤、膠質(zhì)瘤中均有過表達(dá)的報(bào)道[9-10]，提示此蛋白在腫瘤的發(fā)展過程中起到了重要作用。有研究提示，DEPDC1蛋白在微管為靶標(biāo)的化療過程中，能夠通過JNK依賴的途徑，促使BCL-2家族抗凋亡MCL-1蛋白下調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡[11]。膀胱癌中DEPDC1和ZNF-224基因可共同促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路表達(dá)[12]；另有研究表明，DEPDC1蛋白在調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用，并通過E2F途徑與腫瘤的生長(zhǎng)及骨轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[10]。已有報(bào)道提示在肝細(xì)胞癌中DEPDC1的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)[13]。但在NBNC-HCC患者中，DEPDC1是否與在肝炎病毒相關(guān)性肝癌具有同樣的促進(jìn)作用尚無證據(jù)。

本研究首先通過實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)在肝癌組織中，DEPDC1基因高表達(dá)率為73.2%；免疫組化染色發(fā)現(xiàn)肝癌組織DEPDC1染色均呈陽(yáng)性著色，且肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織。表示在NBNC-HCC組織中，DEPDC1的高表達(dá)為常態(tài)。在DEPDC1高表達(dá)組，腫瘤分化程度較低表達(dá)組低，TNM分級(jí)晚，甲胎蛋白值較高，同時(shí)微血管癌栓發(fā)生率(69.7%)較低表達(dá)組(34.5%)明顯增高。目前認(rèn)為，腫瘤的生物學(xué)行為是影響預(yù)后的決定性因素，包括腫瘤的分化程度、侵襲性、表面標(biāo)記、血管形成、免疫逃逸等諸多方面。而TNM、甲胎蛋白、微血管癌栓是分化程度的具體體現(xiàn)。大量研究均表明，甲胎蛋白水平與HCC的分化程度及預(yù)后顯著相關(guān)[14]。同時(shí)微血管癌栓的出現(xiàn)導(dǎo)致腫瘤經(jīng)門脈播散，已被證實(shí)是肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的主要途徑。這些都提示DEPDC1基因在NBNC-HCC發(fā)展中的作用與腫瘤的生物學(xué)行為直接相關(guān)。這一結(jié)果基本與既往報(bào)道的肝炎病毒相關(guān)性肝癌中結(jié)果類似，提示DEPDC1基因的作用很可能位于多種致癌因素作用最終的共同通路上。

綜上所述，本研究從基因及組織學(xué)水平檢測(cè)了NBNC-HCC組織中DEPDC1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)DEPDC1基因在NBNC-HCC組織中高表達(dá)，并與腫瘤的分期及分化程度相關(guān)。結(jié)合既往的研究結(jié)果，提示DEPDC1基因在肝細(xì)胞癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且很可能是多種致癌因素最終的共同通路，有著重要的臨床意義。