黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮體外抗氧化活性研究

范秀芝 殷朝敏 葉羅娜 史德芳 高 虹,?

(1 湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所,湖北武漢 430064;2國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心,湖北 武漢 430064)

黑木耳(Auricularia heimuer)是一種藥食兼用膠質(zhì)菌[1],含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì),以及多糖、黑色素、多酚、黃酮等多種活性物質(zhì)[2-5],具有抗腫瘤、降低膽固醇、抗氧化和抗凝血等活性[6],其質(zhì)地柔軟、味道鮮美,是世界公認的營養(yǎng)保健食品之一。 目前,市售黑木耳主要以干品為主,還有少數(shù)以子實體為原料開發(fā)的黑木耳露飲料和混合粉類固體飲料。 子實體的獲得需要較長的栽培周期和復雜的管理措施。 有報道指出人工培養(yǎng)菌絲體具有與子實體一致的營養(yǎng)和活性物質(zhì),可以替代子實體用于風味、營養(yǎng)及健康配方食品的研制[7]。 目前,關(guān)于黑木耳已有通過菌絲體液體發(fā)酵獲得具有降血脂[8]、抑菌、抗氧化[3,9-10]生物活性多糖和黑色素等發(fā)酵物的研究,也有直接利用液體發(fā)酵產(chǎn)物開發(fā)產(chǎn)品的報道[11-12]。 此外,黑木耳菌絲體固體發(fā)酵研究也有報道,曾峰[13]通過正交優(yōu)化獲得黑木耳菌質(zhì)多糖的最優(yōu)發(fā)酵條件為甘蔗渣∶豆渣=3 ∶2,發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時間28 d,此條件下得到的發(fā)酵菌質(zhì)在液料比27 ∶1、90℃條件下水提90 min,菌質(zhì)多糖含量為7.74 mg·g-1;經(jīng)分離純化可獲得具有多糖特征的AAP-1 純品,并經(jīng)試驗證實該組分具有顯著的體內(nèi)降血脂活性(P＜0.05)。 但目前尚鮮見黑木耳固體發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮的研究報道。

總黃酮是一類廣泛存在于果蔬、中草藥等植物中的多酚類化合物,又稱黃酮類化合物。 該類物質(zhì)具有抗炎抑菌[14]、抗腫瘤[15]、降血糖[16]及抗氧化、抗衰老、降血脂、抗病毒、預防心腦血管疾病、預防老年癡呆和消化道潰瘍等[17]多種生物學活性。 目前,黑木耳中總黃酮的研究主要集中于子實體中總黃酮含量分析[4]、提取工藝優(yōu)化[18-21],以及鐵還原力和自由基清除能力分析[22]。葛渣,作為鮮葛根提取淀粉后的殘渣,保留有葛根大部分有效成分[23],檢測發(fā)現(xiàn)葛渣中總黃酮和葛根素含量顯著高于葛粉,其中總黃酮含量為32.41 mg·g-1[24]。

目前,關(guān)于黑木耳固體發(fā)酵、總黃酮提取及其活性的研究已有大量報道,但添加葛渣進行黑木耳固體發(fā)酵及菌質(zhì)總黃酮抗氧化活性的研究尚鮮見報道。 因此,本研究對添加葛渣的黑木耳菌絲體固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化,并對發(fā)酵菌質(zhì)中總黃酮的還原力及DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力進行研究,旨在明確菌質(zhì)總黃酮抗氧化能力的同時,為直接利用黑木耳固體發(fā)酵菌質(zhì)開發(fā)營養(yǎng)和功能食品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

優(yōu)選的黑木耳菌株黑木耳2 號(HME2)[25](國家審定編號:2007018),保藏于湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所。

玉米糝,滕州市興龍食品有限公司;糙米,湖北思源農(nóng)貿(mào)有限責任公司;葛渣,湖北中坪葛業(yè)開發(fā)有限公司;麩皮、白砂糖,市售。

葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、果糖、可溶性淀粉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、DPPH、水楊酸、硫酸鐵、鄰苯三酚、濃鹽酸、Tris 等均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

蘆丁標準品,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

CP213 電子分析天平,奧豪斯儀器有限公司;101-2AB 型電熱恒溫鼓風干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司;LDZX-75KBS 高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;HWS-24 恒溫水浴鍋、LHS-150SC 恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司;SW-CJ-ID 凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司;GD100 真空冷凍干燥機,江陰市新申寶科技有限公司;KQ-5200DE 超聲波清洗器,昆山市超聲波儀器公司;3K15 高速冷凍離心機,德國Sigma 公司;UV-1800 紫外可見分光光度計,日本島津公司。

1.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.1 供試培養(yǎng)基

1)完全培養(yǎng)基(CYM,1 L):葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母膏2 g、KH2PO40.46 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂18～20 g,用于菌種活化及培養(yǎng)。

2)液體完全培養(yǎng)基(LCYM,1 L):不添加瓊脂的完全培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)液體菌種。

3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L):葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 1 g,添加到固體發(fā)酵培養(yǎng)基作營養(yǎng)液。

4)固體發(fā)酵培養(yǎng)基:50 g 主料加50 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.2 試驗設計

1.3.2.1 主料與液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源的篩選 依照1.3.1 固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方,以50 g 糙米添加50 mL 葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎,進行主料與液體發(fā)酵培養(yǎng)基碳源和氮源種類篩選,以25℃培養(yǎng)溫度下菌絲生長速度為篩選指標。

主料設置5 個處理,包括糙米、玉米糝、糙米∶玉米糝=1 ∶1、糙米∶玉米糝=2 ∶1和糙米∶玉米糝=1 ∶2;碳源設置葡萄糖、果糖、白砂糖、可溶性淀粉及不添加5 個處理,各碳源添加量均為20 g·L-1;氮源設置蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、麩皮(煮汁)和不添加5 個處理,除麩皮添加量為16 g·L-1外,其他氮源添加量均為2 g·L-1。

1.3.2.2 單因素試驗設計 以50 g 玉米糝,添加2%(1.0 g·50 g-1玉米糝)葛渣和2 g·L-1酵母膏為氮源的50 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎配方,當研究某一因素時,其他條件保持不變。 玉米糝用量分別為20、30、40、50、60 g;葛渣添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%;酵母膏添加量分別為1、2、3、4、5 g·L-1,按上述設計分別進行單因素試驗,比較不同配方菌絲生長速度。

1.3.2.3 正交試驗設計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以主料、葛渣、液體發(fā)酵培養(yǎng)基氮源為考察因素,選取3 個水平,以菌絲生長速度和接種35 d 后菌質(zhì)中的總黃酮含量為評價指標,進行L9(33)正交設計以確定黑木耳菌絲體最優(yōu)固體培養(yǎng)基配方。

1.4 黑木耳菌絲生長速度的測定

1.4.1 菌種活化 將4℃保存的菌株轉(zhuǎn)接至90 mm含CYM 平皿上,25℃恒溫培養(yǎng)5 d,用直徑8 mm 打孔器沿邊緣取相同菌齡菌塊備用。

1.4.2 菌絲生長速度測定 將直徑8 mm 的菌塊,菌絲面向上接種到25 mm×250 mm 試管內(nèi)固體培養(yǎng)基中央,待菌絲萌發(fā)并長至培養(yǎng)基表面以下時開始畫線,到同一批處理樣品中出現(xiàn)菌絲長至底部時結(jié)束培養(yǎng)并畫線,測量2 條線間的直線距離(dΔt),計算各處理條件下菌絲生長速度。 每個處理設3 個重復,每支試管測量3 次。

1.5 黑木耳固體發(fā)酵試驗

1.5.1 發(fā)酵種子液制備 將1.4.1 中活化菌絲打孔后,接種到1.3.1 所述的LCYM 中,25℃靜置培養(yǎng)5～7 d。 培養(yǎng)結(jié)束后勻漿,按5%比例接種到1.3.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,25℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 ～7 d,獲得種子液。

1.5.2 固體發(fā)酵 在250 mL 罐頭瓶中裝入優(yōu)化固體培養(yǎng)基,高壓蒸汽滅菌后按5%(干料)比例接入發(fā)酵種子液,25℃靜置培養(yǎng)35 d。 將發(fā)酵后菌質(zhì)真空冷凍干燥,粉碎后置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮含量測定

1.6.1 蘆丁標準曲線繪制 以蘆丁(蕓香苷)為標準品,采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定總黃酮含量[26],具體步驟參照文獻[20,27-28],并略作修改。

精確稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁標準品20 mg,用70%乙醇溶解并定容至100 mL,濃度為200 μg·mL-1,置冰箱保存。 精確量取蘆丁標準液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于6 只25 mL 容量瓶中,加入1.0 mL 5% NaNO2搖勻,靜置6 min 后再加入1.0 mL 10% Al(NO3)3,6 min 后加入5 mL 1 mol·L-1NaOH 溶液,用70%乙醇稀釋至刻度,搖勻后靜置10 min,用紫外分光光度計測定510 nm 處吸光度值,以蘆丁濃度(mg·mL-1)為橫坐標,吸光值A 為縱坐標,求得標準曲線為Y=4.376 3 X-0.001 4(R2=0.999 6),質(zhì)量濃度在0～80 μg·mL-1之間呈良好的線性關(guān)系。

1.6.2 總黃酮提取與測定 需檢測總黃酮的原料包括玉米糝、葛渣、未接種固體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵菌質(zhì),原料在檢測前需干燥、粉碎,過80 目篩。 總黃酮的提取參考黑木耳[19]和杏鮑菇[29]子實體中總黃酮的提取方法,并略作改進。

準確稱取干燥樣品粉末1.00 g,乙醇濃度70%、料液比1 ∶40 g·mL-1、超聲功率300 W,頻率38 KHz,超聲溫度80℃、超聲時間60 min。 4℃、12 000 r·min-1離心25 min,收集上清,得粗提物。 取1 mL 樣液加入到25 mL 容量瓶中,加入1.0 mL 5% NaNO2,搖勻,靜置6 min 后加入1.0 mL 10% Al(NO3)3,反應6 min,再加入5 mL 1 mol·L-1NaOH 溶液,用70%乙醇稀釋至刻度,搖勻后靜置10 min,用紫外分光光度計測定510 nm 波長下吸光度值。 將所測吸光度值帶入標準曲線方程得出提取液濃度后計算樣品中總黃酮的含量。

式中,C 為提取液濃度,mg·mL-1;V 為提取液體積,mL;M 為所取樣品質(zhì)量,g。

1.7 黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮體外抗氧化活性測定

1.7.1 Fe3+還原能力的測定 采用高鐵鹽-鐵氰化鉀比色法[30]測定。 取各梯度的樣品1 mL,分別依次加入2.5 mL 的PBS 溶液(0.2 mol·L-1,pH 值6.7)和K3Fe(CN)6溶液(1%)混勻,50℃保溫20 min 后,加入2.5 mL 10%三氯乙酸,混合后3 000 r·min-1離心10 min,取上清液2.5 mL,加入去離子水2.5 mL,再加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,充分混勻靜置10 min,于700 nm 處測定吸光度值。 以抗壞血酸(Vc)為陽性對照組。 每個濃度梯度平行3 次,求平均值。

1.7.2 DPPH 自由基清除能力的測定[31]準確移取2 mL 樣品于試管中,加入2 mL DPPH 溶液,搖勻,25℃條件下黑暗放置30 min,在517 nm 處測吸光度值(Ai);取樣品溶液2 mL 加2 mL 無水乙醇,搖勻后室溫放置30 min,測定吸光度(A0);取無水乙醇2 mL 加2 mL DPPH 溶液,混勻后室溫放置30 min,測定吸光度值(Ac),最后計算其自由基清除率。 Vc 作陽性對照,操作方法同上,對比DPPH 自由基清除能力。

式中,Ai:樣品對DPPH 作用后的吸光度值;A0:樣品在517 nm 處吸光度值;Ac:DPPH 在517 nm 處吸光度值。

1.7.3 羥自由基(·OH)清除能力測定[32]取2 mL不同濃度梯度總黃酮溶液,依次加入2 mL 6 mmol·L-1FeSO4,2 mL 6 mmol·L-1H2O2,靜置10 min 后,加入6 mL 6 mmol·L-1水楊酸-乙醇,37℃水浴30 min,在510 nm 處測定吸光度值(Ai)。 對照組(Ac),用蒸餾水代替水楊酸進行反應;空白組(A0),用蒸餾水代替黃酮溶液進行反應。 每個濃度梯度平行3 次,求平均值。以Vc 為陽性對照組。

1.7.4 超氧陰離子自由基(O·-2)清除率的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[33]。 取4.5 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖溶液(pH 值8.2)于試管中,25℃水浴20 min,加入不同濃度梯度黃酮樣品溶液各0.1 mL,然后迅速加入0.4 mL 25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液,25℃反應5 min,立即加入1 mL 10 mol·L-1HCl 溶液終止反應,325 nm 處測定吸光度(A1)。 對照組(A2),以70%乙醇或蒸餾水代替黃酮溶液;空白組(A0),以10 mmol·L-1HCl 代替鄰苯三酚溶液。 每個濃度梯度平行3 次,求平均值。 Vc 作陽性對照操作方法同上。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Mircosoft Excel 2010 進行整理,使用SPSS 17.0 軟件進行差異顯著性分析(P＜0.05 或P＜0.01)。 采用Origin 7.5 軟件對數(shù)據(jù)進行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳主料及液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源篩選結(jié)果

發(fā)酵菌質(zhì)可以用于食品開發(fā),因此主料選用含糖量低、營養(yǎng)豐富的糙米[34]和玉米糝[35](中規(guī)格)等粗糧。 由圖1 可知,黑木耳菌絲在5 個主料處理組中生長速度差異不大,其中僅純玉米糝和純糙米培養(yǎng)基中菌絲生長速度存在顯著差異(P＜0.05),純玉米糝上生長速度最快,為3.135 mm·d-1,純糙米中生長速度為2.771 mm·d-1,表明添加玉米糝的固體培養(yǎng)基更有利于HME2 菌株的菌絲生長。

在對液體發(fā)酵培養(yǎng)基碳源種類篩選的研究中發(fā)現(xiàn)(圖1),不添加碳源時菌絲生長最快,為2.835 mm·d-1;以單糖葡萄糖和果糖為碳源時菌絲生長速度低于不添加碳源時的測定值,但差異不顯著;以二糖白砂糖和多糖可溶性淀粉為碳源時菌絲生長速度均極顯著低于其他3 個處理(P＜0.01)。 相反,在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源種類篩選時發(fā)現(xiàn),不添加氮源時菌絲體生長速度最慢(1.188 mm·d-1),以酵母膏為氮源時菌絲生長速度最快,極顯著高于其他氮源(P＜0.01)。

因此,選擇玉米糝為主料,添加以酵母膏為氮源、不含碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行黑木耳固體發(fā)酵培養(yǎng)。

圖1 黑木耳固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料的篩選Fig.1 Selection of raw materials for A. heimuer the solid fermentation medium mycelium

2.2 單因素試驗結(jié)果

為提高固體發(fā)酵菌質(zhì)營養(yǎng)和活性,更好地實現(xiàn)葛渣的綜合利用,增加葛渣添加量為篩選因素。 由圖2可知,在其他因素不變的前提下,添加50 g 玉米糝時菌絲生長速度最快,且與其他添加量組均存在顯著差異(P＜0.05);添加2 g·L-1酵母膏時菌絲體生長速度最快,但與添加3 g·L-1時差異不顯著;葛渣添加量為4%時呈現(xiàn)出最快的生長速度,且與其他處理間均存在顯著差異(P＜0.05),表明較高的葛渣添加量有利于菌絲生長,推測與其較高的纖維素含量有關(guān)。 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇50 g 玉米糝作為主料,添加4%葛渣, 及含2 g·L-1酵母膏為氮源的營養(yǎng)液進行黑木耳固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方正交優(yōu)化。

2.3 正交試驗結(jié)果

以菌絲生長速度和總黃酮含量為指標,采用L9(33)正交試驗優(yōu)化黑木耳菌絲固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方,正交試驗設計及結(jié)果見表2。 由極差分析可知,影響菌絲生長速度和總黃酮含量的培養(yǎng)基組成重要性依次均為C＞A＞B,表明葛渣對黑木耳菌絲生長速度和總黃酮含量均具有重要影響。 其中黑木耳菌絲生長速度最優(yōu)的組合為A3B3C3;黑木耳總黃酮最優(yōu)的組合為A2B3C3。 差異顯著性分析發(fā)現(xiàn),對黑木耳菌絲生長速度的影響,A2和A3無顯著性差異。 綜上分析,采用綜合平衡法[36]得到培養(yǎng)基最優(yōu)配方為A2B3C3,即以50 g玉米糝為主料,添加2.25 g(4.5%)葛渣和50 mL 含2.5 g·L-1酵母膏為氮源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。 在最優(yōu)方案下進行3 組平行驗證試驗,菌絲體生長速度為3.628 mm·d-1,菌質(zhì)總黃酮含量為5.645 mg·g-1。

2.4 黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮的Fe3+還原力分析

圖2 玉米糝、酵耳膏、葛渣添加量對黑木耳菌絲生長速度的影響Fig.2 Effect of the additive amount of corn grit, yeast extract and Radix puerariae residue on the mycelial growth rate of A. heimuer

將菌質(zhì)總黃酮粗提物、Vc(抗壞血酸)分別配制成不同濃度,比較其對Fe3+的還原能力,以評價二者的抗氧化能力。 由圖3 可知,隨著濃度的增大,二者對Fe3+的還原能力均逐漸升高;黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮還原能力始終低于抗壞血酸,但菌質(zhì)總黃酮的還原力與其濃度呈一定線性關(guān)系;隨著濃度的增加,黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮Fe3+還原力與Vc 的Fe3+還原力差距不斷減小,推測當黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮濃度達到一定值時可能會具有與Vc 相同的還原能力。

2.5 黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)對DPPH 自由基的清除能力

由圖4 可知,隨著濃度的增加,黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮對DPPH 自由基的清除能力與抗壞血酸無明顯差異。 Vc 對DPPH 自由基的清除能力基本保持不變(90%左右),而黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮對DPPH 自由基清除能力隨著濃度增加急劇升高后平穩(wěn)下降,當其濃度為200 μg·mL-1時達到最高清除率,為94%,表明黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮具有良好的DPPH 自由基清除能力。

2.6 黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)對羥自由基的清除能力

圖3 黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮的Fe3+還原能力Fig.3 The reducing capacity of total flavonoids from fungal substance of A. heimuer

由圖5 可知,隨著Vc 濃度的增加,羥基自由基(·OH)清除能力逐漸增大,當濃度為800 μg·mL-1時清除率高達99%。 當黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮濃度在100～600 μg·mL-1范圍內(nèi)時,其·OH 清除能力始終高于Vc,在濃度為600 μg·mL-1時黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮·OH 清除率最高(97%),當濃度繼續(xù)增加時·OH 清除能力會有所下降,但在濃度為600 μg·mL-1時的黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮的·OH 清除能力與800 μg·mL-1Vc 對·OH 的清除能力無顯著差異(P＜0.05),表明菌質(zhì)總黃酮具有一定的·OH 清除能力。

表1 正交試驗設計及結(jié)果Table 1 Design and results of the orthogonal experiment

圖4 黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮對DPPH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging capacity of total flavonoids from fungal substance of A. heimuer on DPPH free radicals

圖5 黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮對羥基自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of total flavonoids from fungal substance of A. heimuer on hydroxyl free radicals

2.7 對超氧陰離子自由基的清除能力

圖6 黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.6 Scavenging capacity of total flavonoids from fungal substance of A. heimuer on superoxide anion free radicals

3 討論

黑木耳作為一種絲狀木腐真菌,能夠利用木材中木質(zhì)素、纖維素和半纖維素進行生長發(fā)育,其中在菌絲生長階段主要以非木質(zhì)纖維素和木質(zhì)素作為重要的營養(yǎng)源[37]。 葛渣作為提取葛根有效成分后的剩余殘渣,含有粗蛋白、多糖、粗纖維等多種營養(yǎng)成分,其中含有的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等與黑木耳常規(guī)栽培所用雜木屑成分相似[38-39],因此,在以菌絲培養(yǎng)為主的固體發(fā)酵過程中添加葛渣可以加快菌絲生長速度,而且在一定范圍內(nèi)隨著葛渣添加量的增加,黑木耳菌絲生長速度不斷提高。 在以玉米糝為固體發(fā)酵培養(yǎng)基主料時,菌絲生長速度高于添加糙米的,這可能與玉米糝中較高的纖維素含量有關(guān),可以更好地滿足菌絲生長的營養(yǎng)需求[37]。

為滿足固體發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲生長的營養(yǎng)需求,除主料外通常還需補充有機碳、有機氮及無機鹽等[40],因此本研究在主料中添加液體發(fā)酵培養(yǎng)基作為營養(yǎng)液補充黑木耳菌絲生長所需營養(yǎng),并對其碳源和氮源種類進行篩選。 在液體發(fā)酵培養(yǎng)基碳源篩選時發(fā)現(xiàn),不添加碳源時,菌絲生長速度最快,推測可能是主料玉米糝中的碳源可滿足黑木耳菌絲體的生長,過高的碳源含量或失衡的碳氮比反而會抑制菌絲體的生長。 而在液體發(fā)酵培養(yǎng)基氮源篩選時發(fā)現(xiàn),以酵母膏為氮源時菌絲生長速度極顯著高于其他氮源,與PDA培養(yǎng)基上的研究結(jié)果一致[3,41],推測可能是因為以酵母膏為氮源補充時培養(yǎng)基中的碳氮比更適合黑木耳菌絲體生長。

本研究結(jié)果表明,葛渣、玉米糝中總黃酮含量分別為43.06 mg·g-1和2.54 mg·g-1,正交優(yōu)化試驗中未接種培養(yǎng)基配方中總黃酮含量在2.398 ～2.453 mg·g-1之間,經(jīng)35 d 培養(yǎng)后菌質(zhì)總黃酮含量為3.256 ～5.174 mg·g-1,較空白培養(yǎng)基增加0.858～2.721 mg·g-1,且與現(xiàn)有黑木耳子實體中報道的4.3 ～7.9 mg·g-1[18-22]相近。 但已有報道指出食用菌因不含有黃酮類化合物代謝合成的關(guān)鍵酶而不能合成黃酮類化合物[42],因此本研究中總黃酮含量增加的原因還有待進一步研究。

為縮短試驗周期,本研究在進行原料篩選和單因素試驗時,只選用菌絲生長速度作為考核指標,而在最后的正交優(yōu)化試驗中才增加總黃酮含量這一指標。 正交優(yōu)化試驗結(jié)果表明,不同配方中菌絲生長速度和總黃酮含量變化趨勢基本一致,且不同處理間菌絲生長速度存在差異時,總黃酮含量的差異顯著,表明僅利用菌絲生長速度進行篩選具有一定可靠性。

4 結(jié)論

以玉米糝為主料,添加4.5%葛渣對黑木耳菌株HME2 進行培養(yǎng),35 d 后黑木耳發(fā)酵菌質(zhì)中總黃酮含量達5.645 mg·g-1。 體外抗氧化試驗表明黑木耳菌質(zhì)總黃酮Fe3+還原能力較弱,但具有較強的DPPH 自由基、·OH 和清除能力。 因此,本研究所得固體發(fā)酵菌質(zhì)具有較高的開發(fā)利用價值,可直接作為原料應用于黑木耳功能營養(yǎng)新產(chǎn)品的研發(fā),豐富了黑木耳產(chǎn)品種類,并實現(xiàn)葛渣綜合利用,提高了其利用率和附加值。