褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備、再生條件的研究

王金斌 李 文 蔣 瑋 白 藍(lán) 劉 華李正鵬 吳文惠 唐雪明,,?

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201106;2上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

褐色雙孢蘑菇(Agaricus bisporus Protobello)的菇蓋為棕褐色,菌肉和菇柄呈白色,是商業(yè)化菌株白色雙孢蘑菇的一個(gè)變種,國內(nèi)俗稱牛排菇,棕秀一號(hào)是國內(nèi)選育認(rèn)定的商業(yè)化栽培的褐色蘑菇菌株,其味道鮮美,貨架期長,適溫廣,且低溫結(jié)實(shí)能力強(qiáng),抗逆,不易褐變[1]。雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)栽培起源于法國,至今已有460 多年的歷史,雙孢蘑菇菌種的提純、制備與改良也有100 多年歷史[2]。 雙孢蘑菇的育種方法和技術(shù)主要包括自然選種、純種培養(yǎng)、組織分離保種、多孢分離育種[3]、單孢分離育種[4-5]和雜交育種[6-7]等。 但雙孢蘑菇遺傳背景復(fù)雜,缺少優(yōu)良性狀和穩(wěn)定遺傳的生物學(xué)標(biāo)記,且擔(dān)子上的兩個(gè)孢子大多是自身可育的異核,其與不能結(jié)實(shí)的同核體間沒有鎖狀聯(lián)合的形態(tài)差異,限制了雙孢蘑菇的常規(guī)雜交育種工作,導(dǎo)致雙孢蘑菇改良菌株的進(jìn)程緩慢[8-11]。 目前,世界各國使用的雙孢蘑菇商業(yè)菌種來源于國外雜交品種U 系列或國內(nèi)AS2796 系列的后代,如A15、W192 等工廠化栽培菌株[2]。

隨著雙孢蘑菇選育種技術(shù)發(fā)展到基因工程水平。Morin 等[12]2012年完成了雙孢菇A. bisporus var.bisporusH97 ( 雙 孢 變 種) 和 A. bisporus var.burnettiiJB137-S8(四孢變種)2 個(gè)變種的全基因組序列測(cè)定,并構(gòu)建了全基因組框架圖,為雙孢蘑菇的分子遺傳學(xué)研究和功能基因組研究打開了大門。 建立良好穩(wěn)定的原生質(zhì)體制備技術(shù)是雙孢蘑菇的分子遺傳學(xué)操作的關(guān)鍵步驟之一[13]。 原生質(zhì)體再生[14-15]、誘變[16-17]、融合育種[18-19]、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種[20-21]、原生質(zhì)體基因組重排[22-23]以及基因組定向編輯技術(shù)[24]都必須以高產(chǎn)量和高再生率的原生質(zhì)體為前提,所以優(yōu)化原生質(zhì)體制備和再生條件顯得尤為必要[25]。

近年來,白色雙孢蘑菇原生質(zhì)體的制備已成為研究熱點(diǎn),供試菌株包括As2796、浙農(nóng)1 號(hào)、雙孢蘑菇765 號(hào)等[26-29]。 綜合前人在白色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備的相關(guān)研究,本試驗(yàn)以褐色雙孢蘑菇棕秀一號(hào)為材料,在前期獲得最佳褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生溫度、滲透壓穩(wěn)定劑和再生培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,對(duì)影響褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備和再生的菌齡、溶壁酶濃度、蝸牛酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度等5 個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化,通過響應(yīng)面法確定褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率的最佳條件,初步利用紫外線和甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理,以期選育出基質(zhì)利用率高的褐色雙孢蘑菇菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試褐色雙孢蘑菇棕秀一號(hào)菌株,由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心提供。

1.2 主要試劑

溶壁酶(lywallzyme),購自廣東微生物研究所;蝸牛酶(snailase),購自上海源葉生物科技有限公司;甘露醇,購自北京鼎國生物技術(shù)中心;甲基磺酸乙酯,購自美國Sigma 公司。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖稻草浸汁培養(yǎng)基(1 L):無霉菌新鮮稻草100 g,煮沸30 min 后用雙層紗布過濾,濾液定容到1 L,即為稻草浸汁[28];馬鈴薯葡萄糖稻草浸汁培養(yǎng)基配置:用稻草浸汁代替水,新鮮馬鈴薯塊200 g、葡萄糖20 g,按照馬鈴薯葡萄糖瓊脂[potato dextrose agar(medium),PDA]培養(yǎng)基配制方法配制;再生培養(yǎng)基(1 L):新鮮馬鈴薯塊200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g,甘露醇終濃度為0.6 mol·L-1。 上述培養(yǎng)基均采用濕熱滅菌法滅菌,然后置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 褐色雙孢蘑菇菌絲的培養(yǎng)

取適量PDA 培養(yǎng)基上生長的菌絲(菌齡7 d),接種到裝有100 mL 液體馬鈴薯葡萄糖稻草浸汁培養(yǎng)基的三角瓶中,25℃恒溫培養(yǎng)7 d,每12 h 搖勻一次,收集菌絲。 用ULTRA-TURRAX 無菌均質(zhì)器(上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司)將菌絲拍打粉碎,然后吸取1 mL菌液至100 mL 液體馬鈴薯葡萄糖稻草浸汁培養(yǎng)基中,25℃條件下恒溫培養(yǎng)5～10 d。

1.5 褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體的制備

取培養(yǎng)5～10 d 的褐色雙孢蘑菇菌絲,先用4 層滅菌的紗布過濾,然后用無菌水沖洗3 次,用無菌紙吸干后懸浮于適量的一定濃度的等體積雙酶溶液(0.5%～2.5%溶壁酶,1%～9%蝸牛酶)中,25 ～33℃、100 r·min-1振蕩酶解6～10 h 后,用G3 的砂芯漏斗過濾以除去菌絲碎屑,然后4℃條件下4 000 r·min-1離心10 min,收集原生質(zhì)體并用0.6 mol·L-1甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑洗滌3 次,最后加入適量0.6 mol·L-1甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑制成懸浮液,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.6 褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體的再生

將制備好的原生質(zhì)體懸液稀釋至濃度5×103個(gè)·mL-1,然后取100 μL 涂布于再生培養(yǎng)基上,25℃恒溫培養(yǎng)7～11 d 觀察再生情況并計(jì)算再生率,以無菌水作低滲處理原生質(zhì)體為再生對(duì)照。 以上每個(gè)處理設(shè)5 個(gè)重復(fù)。 按照公式計(jì)算再生率[30-31]:

再生率=(再生培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)-低滲處理后再生培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù))/涂布原生質(zhì)體數(shù)×100%。

1.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在原生質(zhì)體制備過程中,分別考察菌齡(5 ～9 d)、溶壁酶濃度(1%～5%)、蝸牛酶濃度(1%～9%)、酶解時(shí)間(1～5 h)、酶解溫度(25 ～33℃)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響。

1.8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理[32-33],在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以菌齡、溶壁酶濃度、蝸牛酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度5 個(gè)因素為自變量,以原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率為響應(yīng)值,進(jìn)行五因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與水平因素見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與因素水平表Table 1 Design and levels of response surface experiment

1.9 褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體誘變效應(yīng)的初探

在褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備和再生的最佳條件的基礎(chǔ)上,根據(jù)菌種誘變處理后致死率在70%～80%時(shí)正突變效果最佳,用紫外線(15 W 紫外燈,培養(yǎng)皿距紫外燈管30 cm,照射時(shí)間45 s)或1%EMS(在25±0.5℃條件下處理1 h)處理褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體,以在PDA 培養(yǎng)基上恒溫(25℃)培養(yǎng)5 d 的原生質(zhì)體生長直徑為指標(biāo),篩選生長性能改進(jìn)的褐色雙孢蘑菇菌株。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert V8.0.6 軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以獨(dú)立樣品測(cè)定結(jié)果的平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 菌齡對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備及再生的影響 由圖1 可知,隨著菌絲菌齡的延長,制備的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率先增加后降低,呈正態(tài)分布。 當(dāng)菌絲菌齡為7 d 時(shí),制備的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率最高。因此,將6～8 d 作為菌絲的較適菌齡。

圖1 菌齡對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.1 Effect of mycelial age on the preparation and regeneration of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

2.1.2 溶壁酶濃度對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備及再生的影響 由圖2 可知,不同濃度的溶壁酶酶解獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率是不同的,溶壁酶濃度為1.5%時(shí),原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高;溶壁酶濃度為2%時(shí),原生質(zhì)體的再生率最高。 綜上,選擇1%～2%作為溶壁酶的較適濃度。

2.1.3 蝸牛酶濃度對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備及再生的影響 由圖3 可知,蝸牛酶分離褐色雙孢蘑菇菌絲原生質(zhì)體與溶壁酶的變化趨勢(shì)一致,蝸牛酶濃度過高或過低,原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率均下降。 不同濃度的蝸牛酶酶解均可獲得褐色雙孢蘑菇菌絲原生質(zhì)體,但其產(chǎn)量和再生率有區(qū)別,故選擇5%～7%作為蝸牛酶的較適濃度。

圖2 溶壁酶濃度對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.2 Effect of lywallzyme enzyme concentration on the preparation and regeneration of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

圖3 蝸牛酶濃度對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.3 Effect of snaliase enzyme concentration on the preparation and regeneration of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響 由圖4 可知,隨著酶解時(shí)間的延長,褐色雙孢蘑菇菌絲原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率先增加后逐步降低。 當(dāng)酶解時(shí)間為3 h 時(shí),原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率達(dá)到最高。 因此,選擇2～4 h 作為較適酶解時(shí)間。

2.1.5 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響 優(yōu)化酶解溫度是為了獲得溶壁酶和蝸牛酶雙酶酶解的最適溫度,以提高褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率。由圖5 可知,當(dāng)酶解溫度為29℃時(shí),褐色雙孢蘑菇菌絲原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率最高。 酶解溫度過低或過高均會(huì)影響溶壁酶和蝸牛酶的酶活性,進(jìn)而影響脫壁效果。果。 因此,選擇29～31℃作為較適酶解溫度。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the preparation and regeneration of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

圖5 酶解溫度對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.5 Effect of enzymolysistemperature on the preparation and regeneration of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 以原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率為響應(yīng)值,考察菌齡、溶壁酶 濃度、蝸牛酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度5 個(gè)因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響,共設(shè)計(jì)了五因素三水平的46 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface experiment

表2(續(xù))

運(yùn)用軟件Design Expert V8.0.6 分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)、數(shù)學(xué)擬合方程及方差分析,并對(duì)表1 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析,得到褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量、再生率與各因素變量的二次多項(xiàng)回歸方程模型。

2.2.2 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)與方差分析 良好的擬合模型的建立為最優(yōu)工藝條件的求解提供了先決條件[34]。 由表3 可知,回歸方程模型(1)達(dá)極顯著水平(P＜0.000 1),表明回歸方程模型(1)與實(shí)際情況具有很好的擬合度,能夠反映褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量與各因素之間的關(guān)系;校正決定系數(shù)Radj2= 0.944 3,失擬項(xiàng)差異不顯著(P＞0.05),表明回歸方程模型(1)理論上能解釋5 個(gè)變量對(duì)響應(yīng)值的影響達(dá)94.43%,其他影響因素對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響較小,回歸方程模型(1)可以很好地反映實(shí)際值。 方差分析表明,二次回歸方程模型(1)可用于褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備產(chǎn)量的分析與預(yù)測(cè),試驗(yàn)中5 個(gè)因素對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響程度次序?yàn)槿鼙诿笣舛龋久附鉁囟龋揪g＞蝸牛酶濃度＞酶解時(shí)間。 回歸方程模型的結(jié)果表明,一次項(xiàng)A、B、E 與二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2、E2差異性極顯著(P＜0.01),交互項(xiàng)AE 達(dá)到顯著水平(P＜0.05),表明A、E 對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響具有交互作用,不是簡單的線性關(guān)系。

表3 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析(因變量為原生質(zhì)體產(chǎn)量)Table 3 Significance test and analysis of variance (ANOVA) of regression equation (protoplast yield as the dependent variable)

由表4 可知,回歸方程模型(2)差異達(dá)極顯著水平(P＜0.000 1),說明回歸方程模型(2)與實(shí)際情況擬合較好,能夠反映褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生率與各因素之間的關(guān)系。 失擬項(xiàng)差異不顯著(P＞0.05),說明其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小,適用于褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生率與各因素變量的優(yōu)化。 校正決定系數(shù)0.938 9,可解釋為回歸方程模型(2)有93.89%的響應(yīng)值,僅有6.11%不能用模型(2)來解釋。 考察因素對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生率影響的次序?yàn)槿鼙诿笣舛龋久附鉁囟龋揪g＞蝸牛酶濃度＞酶解時(shí)間。交互作用中AE 的交互作用呈極顯著水平(P＜0.01)。

表4 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析(因變量為原生質(zhì)體再生率)Table 4 Significance test and analysis of variance (ANOVA) of regression equation(Regeneration rate as the dependent variable)

2.2.3 各因素交互作用的響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖中曲面的陡峭程度表示變量對(duì)因變量(褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率)的影響程度,曲面較平表明影響較小,反之曲面越陡則影響較大;等高線圖體現(xiàn)了5個(gè)考察因素之間交互影響的強(qiáng)弱,等高線為圓形表示交互作用不顯著,橢圓形則表示交互作用顯著[26]。 結(jié)合回歸方程(1)、(2)及表3 ～4 可知,二次項(xiàng)AE 具有極顯著的交互作用(P＜0.001),即菌齡與酶解溫度2個(gè)因素間交互作用顯著,圖6、圖7 也驗(yàn)證了這一結(jié)果。

2.2.4 試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證 通過Design Expert V8.0.6響應(yīng)曲面法分析試驗(yàn)結(jié)果,確定最佳褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的原生質(zhì)體制備工藝條件為菌齡8.36 d、溶壁酶酶濃度1.35%、蝸牛酶酶濃度7.01%、酶解時(shí)間3.00 h、酶解溫度30.45℃,此條件下由回歸方程(1)得出的褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量理論值為4.37×107個(gè)·mL-1。 考慮到實(shí)際操作,將原生質(zhì)體最佳制備工藝條件調(diào)整為:菌齡8.36 d、溶壁酶濃度1.35%、蝸牛酶酶濃度7.01%、酶解時(shí)間3.00 h、酶解溫度30.4℃,此條件下褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體的平均產(chǎn)量為4.39×107個(gè)·mL-1,與理論值偏差不大,說明回歸方程模型(1)可用于實(shí)際預(yù)測(cè)。

圖6 各因素交互作用對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graphs of the effects of various factors and their interaction on the yield of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

顯微觀察優(yōu)化條件下制備的褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體。 由圖8 可知,原生質(zhì)體個(gè)體較大、形狀圓潤,說明原生質(zhì)體活性較好,保證了其再生率。

圖7 各因素交互作用對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface graphs of the effects of various factors and their interaction on the yield of Agaricus bisporus Protobella protoplasts

經(jīng)軟件分析得出最佳褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生率的原生質(zhì)體制備工藝為菌齡9.00 d、溶壁酶酶濃度1.32%、蝸牛酶酶濃度6.96%、酶解時(shí)間2.97 h、酶解溫度31.00℃,此條件下由回歸方程(2)得出的褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生率的理論值為14.53%。 此條件下對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備進(jìn)行5 次平行制備實(shí)驗(yàn),褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體的實(shí)際平均再生率為15.10%,與理論值偏差不大,說明回歸方程模型(2)可應(yīng)用于實(shí)際預(yù)測(cè)。

2.3 誘變后生長性能的篩選

以褐色雙孢蘑菇棕秀一號(hào)為研究材料,分別在原生質(zhì)體制備產(chǎn)量優(yōu)化和再生率優(yōu)化條件下,經(jīng)過紫外線和EMS 誘變后,并進(jìn)行褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體的再生,以平板生長性能為篩選指標(biāo),初篩選育出18 株生長性能提高的褐色雙孢蘑菇菌株。 圖6 中圓圈所示即為篩選得到的5 株生長速率提高的突變菌株。

圖9 褐色雙孢蘑菇生長性能提高菌株的篩選Fig.9 Screening of improved growth performance strains of Agaricus bisporus Portobello

3 討論

原生質(zhì)體的制備與再生是兩個(gè)相互聯(lián)系的過程,通常原生質(zhì)體產(chǎn)量較高時(shí),再生率也較高,但過度酶解會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體損壞或破裂,不利于原生質(zhì)體的再生[33]。 獲得原生質(zhì)體的高產(chǎn)量和提高原生質(zhì)體的再生率是影響原生質(zhì)體后續(xù)育種操作成功的關(guān)鍵因素。本研究采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面法,考察菌齡、溶壁酶濃度、蝸牛酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度5 個(gè)因素對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響,結(jié)果表明,菌齡、溶壁酶濃度、蝸牛酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度等5 個(gè)因素的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)AE均對(duì)原生質(zhì)體的制備具有顯著影響,其中菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備影響最大。 菌齡會(huì)影響菌體生理狀態(tài),如細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、菌體的代謝水平與菌體的活力。 為使褐色雙孢蘑菇的菌絲體有利于制備原生質(zhì)體及原生質(zhì)體的再生,本試驗(yàn)通過優(yōu)化菌齡,使其菌體細(xì)胞更易于原生質(zhì)體化。 菌體對(duì)溶壁酶、蝸牛酶最敏感,若褐色雙孢蘑菇的菌絲體菌齡過短,制備的原生質(zhì)體易破裂;菌齡過長,菌絲則老化,對(duì)溶壁酶和蝸牛酶敏感度降低,酶解效果差,且菌絲的活力也降低,從而褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體的得率及再生率降低。 酶解時(shí)間對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生影響最大,原生質(zhì)體上未酶解完全的殘留細(xì)胞壁,有利于原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生。 當(dāng)酶解時(shí)間過長,會(huì)失去再生的細(xì)胞殘壁引物而難于再生,溶壁酶和蝸牛酶酶解體系中雜酶或雜質(zhì)(過氧化物酶、核糖核酸酶)也會(huì)對(duì)原生質(zhì)體造成損害,致使原生質(zhì)體活性越低,甚至變形破裂[30]。

本研究結(jié)果表明,回歸模型(1)和(2)方差分析達(dá)到極顯著水平,且失擬項(xiàng)不顯著,表明回歸方程模型(1)和(2)對(duì)實(shí)際試驗(yàn)擬合效果好。 通過驗(yàn)證試驗(yàn),最終確定最佳褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的原生質(zhì)體制備工藝為菌齡8.36 d、溶壁酶酶濃度1.35%、蝸牛酶酶濃度7.01%、酶解時(shí)間3.00 h、酶解溫度30.4℃,此條件下褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體平均產(chǎn)量為4.39×107個(gè)·mL-1,較王波等[27]原生質(zhì)體制備條件提高了854.3%;確定最佳褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生率的原生質(zhì)體制備工藝為菌齡9.00 d、溶壁酶酶濃度1.32%、蝸牛酶酶濃度6.96%、酶解時(shí)間2.97 h、酶解溫度31.0℃,此條件下褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體的平均再生率為15.1%,較王波等[27]優(yōu)化的原生質(zhì)體再生率提高了157.2%。

不同誘變劑的誘變機(jī)理不同,因此不同誘變方法可以構(gòu)建具有一定基因型多樣性的褐色雙孢蘑菇陽性突變庫。 本研究通過優(yōu)化的褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備及再生條件,利用化學(xué)誘變和物理場(chǎng)誘變的方法對(duì)褐色雙孢蘑菇的生長性能進(jìn)行了初篩,選育出18 株生長性能提高的褐色雙孢蘑菇菌株,為構(gòu)建豐富的基因型陽性正向突變褐色雙孢蘑菇菌株庫提供了技術(shù)支撐。 與直接對(duì)擔(dān)孢子進(jìn)行誘變[35]相比,以原生質(zhì)體作為誘變材料,由于其沒有細(xì)胞壁,對(duì)誘變劑更加敏感,能提高突變率,更有利于篩選目的菌株。 此外,該方法簡便,效果較好,是選育生長性能優(yōu)良的褐色雙孢蘑菇菌種的有效方法。

4 結(jié)論

真菌微生物細(xì)胞細(xì)胞壁的存在,限制了褐色雙孢蘑菇誘變育種、細(xì)胞融合和分子育種技術(shù)的應(yīng)用和效率。 本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)面法系統(tǒng)性優(yōu)化,建立了雙酶酶解制備褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式回歸模型,經(jīng)驗(yàn)證該模型合理可靠,能準(zhǔn)確地反映褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率。 菌齡、溶壁酶濃度、蝸牛酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度5 個(gè)因素對(duì)褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率有顯著影響,最佳褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的原生質(zhì)體制備工藝為菌齡8.36 d、溶壁酶酶濃度1.35%、蝸牛酶酶濃度7.01%、酶解時(shí)間3.00 h、酶解溫度30.4℃,此條件下褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體平均產(chǎn)量為4.39×107個(gè)·mL-1;最佳褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生率的原生質(zhì)體制備工藝為菌齡9.00 d、溶壁酶酶濃度1.32%、蝸牛酶酶濃度6.96%、酶解時(shí)間2.97 h、酶解溫度31.0℃,此條件下褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體的平均再生率為15.1%。 本研究結(jié)果為以褐色雙孢蘑菇原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、基因組重排、基因編輯技術(shù)的后續(xù)分子試驗(yàn)的科學(xué)研究奠定了理論基礎(chǔ)。