肺纖維化機(jī)制的研究進(jìn)展

何 巧 綜述，熊 簡 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 400016)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是肺纖維化的最常見形式，許多研究表明IPF的發(fā)病率和患病率正在增加，IPF與高齡密切相關(guān)。IPF男性與女性患者比例通常接近2∶1。各種病例對照研究已經(jīng)確定吸煙，暴露于煙草煙霧、金屬粉塵、木屑、二氧化硅、灰塵、飼養(yǎng)牲口等職業(yè)/環(huán)境，病毒感染、病理性胃食管反流與IPF風(fēng)險增加有關(guān)。然而，許多IPF患者似乎沒有任何與疾病風(fēng)險相關(guān)的風(fēng)險因素，風(fēng)險因素需要個體具有遺傳易感性以響應(yīng)誘導(dǎo)損傷，而發(fā)展成肺纖維化。呼吸衰竭是IPF患者常見的死亡原因，冠狀動脈疾病并發(fā)癥、 肺栓塞或肺癌也是其死亡原因。

肺纖維化的病理學(xué)過程研究發(fā)現(xiàn)，早期致病因子對血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的彌漫性損傷，引起肺泡炎癥，因免疫介導(dǎo)的肺部炎癥持續(xù)存在,以及一系列免疫相關(guān)因子通過各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑擴(kuò)大組織損傷，大量成纖維細(xì)胞聚集，驅(qū)動膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)異常沉積和組織收縮，正常的肺泡組織受損，異常修復(fù)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)異常和功能障礙[1]。上述過程同時存在，互相影響，導(dǎo)致肺的進(jìn)行性瘢痕形成，最終發(fā)展成為廣泛的纖維化變化。5年生存率僅20%[2]。大量研究表明，目前抑制免疫炎性反應(yīng)的治療策略并非對所有肺纖維化疾病有效[3-4]。甚至可能對IPF患者有害。近年來對IPF的病理學(xué)研究重點(diǎn)發(fā)生變化，以前定義為炎癥性疾病，目前認(rèn)為IPF是上皮驅(qū)動的疾病。盡管如此，免疫和自身免疫過程仍可能在IPF的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。由于IPF與高齡密切相關(guān)，包括端?？s短，基因組不穩(wěn)定性和表觀遺傳突變[5]，細(xì)胞衰老和衰老細(xì)胞積累，異常的細(xì)胞通信，線粒體功能障礙，干細(xì)胞衰竭，氧化應(yīng)激的累積效應(yīng)和蛋白質(zhì)組穩(wěn)態(tài)的破壞?，F(xiàn)將概括在IPF中起重要作用的細(xì)胞，其中細(xì)胞因子、遺傳、衰老與肺纖維化的相關(guān)性有所提及，為肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究和治療提供新思路。

1 肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells,AECs)

AECs參與肺纖維化機(jī)制為：遺傳易感性、年齡相關(guān)因素及觸發(fā)因素相結(jié)合引發(fā)上皮損傷，重復(fù)的上皮細(xì)胞損傷/應(yīng)激/凋亡和隨后的異常修復(fù)反應(yīng)和基質(zhì)積累，導(dǎo)致進(jìn)行性纖維化和肺功能隨時間逐漸喪失[6-7]。

AEC1s的損傷和AEC層的破壞被作為IPF發(fā)病機(jī)制的起始事件。早期AEC1s在博來霉素(BLM)誘導(dǎo)大鼠肺嚴(yán)重受損，基底膜暴露，激活和聚集血小飯，引起血液凝固過程，產(chǎn)生一些物質(zhì)以增加毛細(xì)血管滲透性，使炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)進(jìn)入肺間質(zhì)[8]。AEC1s的損傷和AEC層的破壞之后是AEC2s的增殖和分化，以構(gòu)建正常組織結(jié)構(gòu)，AEC2s功能障礙在肺異常修復(fù)損傷中起關(guān)鍵作用。反復(fù)上皮細(xì)胞損傷后的組織重塑不能重建正常上皮屏障，不能抑制肌成纖維細(xì)胞的異常行為與增殖及循環(huán)纖維細(xì)胞進(jìn)入肺組織。

AECs還可以通過上皮-間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(EMT)分化為成纖維細(xì)胞,EMT是AEC2s的分子重編程，其典型標(biāo)記是α平滑肌肌動蛋白(αSMA)，降低非編碼小RNA分子let-7d的水平可促進(jìn)EMT的轉(zhuǎn)化[9]。

AECs參與肺纖維化的其他機(jī)制:線粒體DNA損傷與AECs凋亡和肺纖維化的發(fā)生密切相關(guān)，其與BLM誘導(dǎo)小鼠肺損傷中增加的活性氧物質(zhì)(ROS)水平相關(guān)[10]。肺纖維化疾病存在基因調(diào)控(AECs周期的異?；蛘{(diào)控及細(xì)胞凋亡)與環(huán)境壓力相結(jié)合的遺傳傾向[11]。有研究已經(jīng)在IPF肺組織中發(fā)現(xiàn)，p53途徑的破壞可以促進(jìn)細(xì)胞周期停滯和不適當(dāng)?shù)纳掀ぜ?xì)胞凋亡，但在其他肺纖維化疾病中沒有發(fā)現(xiàn)[12]。PTEN是一個腫瘤抑制基因，一些研究表明，PTEN/NF-κB途徑調(diào)控衰老的AEC可促進(jìn)成纖維細(xì)胞中膠原的積累，導(dǎo)致肺纖維化。作為IPF的初始階段，AEC的衰老過程可能是潛在的治療靶點(diǎn)。

2 血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,EC)

在肺纖維化早期階段肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs)參與肺纖維化的發(fā)展變化過程[13]，隨著基底膜的破壞，肺泡結(jié)構(gòu)的損傷和AEC的喪失累及肺泡血管并導(dǎo)致EC增生及血管通透性增加。EC增生促進(jìn)新生毛細(xì)血管形成，從而聚集大量AECs，大量纖維蛋白增生及膠原沉積。同時其分泌黏附分子讓單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞易于附著在EC表面，有利于炎性細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞的浸潤。有研究顯示，大多數(shù)肺纖維化期間PMVECs中的緊密連接(TJ)在BLM處理的組織中處于開放狀態(tài)[14]。這種細(xì)胞旁病變的功能障礙直接導(dǎo)致白細(xì)胞的浸潤呈連續(xù)性，加重肺纖維化。內(nèi)皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EndoMT)是在BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化過程中發(fā)現(xiàn)的，在維持炎癥和膠原蛋白分泌中起著非常重要的作用。α-SMA可以用作于EndoMT的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BLM誘導(dǎo)的大鼠PMVECs中上調(diào)α-SMA、Notch1和Jagged1的表達(dá)水平，而Dll4的表達(dá)下調(diào)。此外，PMVECs中Jagged1和α-SMA蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，而Jagged1的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致NF-κB下調(diào)，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3 肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage,AM)

炎癥狀態(tài)在各種原因引起的肺損傷的早期階段明顯，而肺纖維化發(fā)展的晚期相反[15]，這可能是傳統(tǒng)的抗炎療法治療肺纖維化失敗的重要原因。雖然現(xiàn)在IPF側(cè)重于上皮損傷機(jī)制，但在肺纖維化病理學(xué)研究中仍能發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)及免疫介導(dǎo)。在BLM誘導(dǎo)肺損傷動物模型早期階段，炎性細(xì)胞浸潤主要以AM為主。炎癥期間AM分化為替代活化狀態(tài)(M2表型)可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的過度增殖并促進(jìn)纖維化形成。在BLM誘導(dǎo)肺損傷動物模型中觀察到：Wnt共受體Lrp5促進(jìn)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)，進(jìn)一步促進(jìn)AM分化為拮抗肺纖維化分解的亞型；Lrp基因敲除小鼠可促進(jìn)纖維化的分解，減輕纖維化進(jìn)展[16]。

4 中性粒細(xì)胞

支氣管肺泡灌注液(BALF)中增多的中性粒細(xì)胞與肺纖維化的早期死亡率增加有關(guān)。若損傷持續(xù)存在，繼AM后，中性粒細(xì)胞被招募致?lián)p傷部位。來自環(huán)境的不同刺激可以在炎癥部位對中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化活性。系統(tǒng)外滲到組織中的白細(xì)胞是被炎癥趨化因子誘導(dǎo)的，與中性粒細(xì)胞最相關(guān)的趨化因子受體是CXCR1、CXCR2。粒細(xì)胞趨化蛋白-2 (GCP-2/CXCL6)作用于CXCR1、CXCR2兩種趨化因子受體，在趨化中性粒細(xì)胞、促進(jìn)血管生成中有著重要作用。BLM致肺損傷中，使用CXCR2受體拮抗劑、抗GCP-2[17]、抗CXCL-8[18]治療可減少肺實(shí)質(zhì)中的中性粒細(xì)胞，減少膠原沉積。

中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)通過破壞肺的通透屏障功能，刺激促炎細(xì)胞因子和生長因子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子(PDGF)的釋放，參與肺纖維化的炎癥期。在肺纖維化小鼠中，NE抑制劑可減少中性粒細(xì)胞堆積和膠原沉積，降低轉(zhuǎn)化生成生因子-β1(TGF-β1)的活化，已在臨床上有效治療急性肺損傷及肺部炎癥[19]。其在肺纖維化中的治療作用尚需進(jìn)一步研究。中性粒細(xì)胞如何與其他免疫成分合作，對中性粒細(xì)胞關(guān)鍵途徑的治療策略需進(jìn)一步探索。

5 淋巴細(xì)胞

IPF患者在BALF和肺實(shí)質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白水平升高和存在免疫復(fù)合物。因此，IPF被認(rèn)為具有在肺組織中的異常免疫應(yīng)答。某些淋巴細(xì)胞因子被認(rèn)為是促纖維化的，對成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞活性有直接影響。CD4+T輔助細(xì)胞在受抗原刺激后，分化成Th1/Th2效應(yīng)細(xì)胞亞群，Th2亞群典型的白細(xì)胞介素(IL)是IL-4,可誘導(dǎo)IL-5，IL-13和TGF-β1水平增加，募集巨噬細(xì)胞，肥大細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，并直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化，Th2細(xì)胞型細(xì)胞因子占主導(dǎo)地位可導(dǎo)致纖維化[20]。轉(zhuǎn)錄因子GATA3在肺纖維化中顯著升高，其主要在淋巴細(xì)胞中表達(dá)，可能的機(jī)制是GATA3僅在Th2中表達(dá)，體現(xiàn)Th2類細(xì)胞因子的主導(dǎo)地位[21]。

淋巴細(xì)胞的作用仍有爭議。例如以下兩種T細(xì)胞：一方面有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞(以產(chǎn)生IL-17為特征的T細(xì)胞)對纖維化沒有直接影響。另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)IL-17在肺纖維化中表達(dá)增加，且與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[22]，阻斷、中和IL-17A可以延緩肺纖維化的進(jìn)展并促進(jìn)其緩解[23]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)是一類新的對炎性反應(yīng)起拮抗作用的CD4+T細(xì)胞亞群，在肺纖維化早期通過增加TGF-β1釋放和膠原沉積達(dá)到促纖維化作用，而在晚期，Tregs可通過抑制成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-9和CXC趨化因子配體(CXCL)12減弱纖維細(xì)胞募集和肺纖維化[24]。可見Treg可能同時具有抗纖維化和促纖維化的作用，取決于肺纖維化的階段及與其他T細(xì)胞亞型的相互作用。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肺纖維化具有自身免疫紊亂特征，存在Th17/Treg細(xì)胞失衡現(xiàn)象[25]。與健康人和患有其他肺病的患者相比，在IPF患者的BALF和外周血中，CD4+CD25+FOXP3+Tregs的數(shù)量減少，可用于IPF患者診斷的生物學(xué)標(biāo)志細(xì)胞，有待進(jìn)行前瞻性研究明確其臨床意義。

6 肥大細(xì)胞

肥大細(xì)胞被認(rèn)為參與各種組織、器官的纖維化過程。將分離和純化的大鼠腹膜肥大細(xì)胞(PMC)與同源胚胎肺成纖維細(xì)胞(LFb)一起培養(yǎng)，結(jié)果顯示PMC可促進(jìn)LFb增殖和活躍。IPF患者的肺組織肥大細(xì)胞數(shù)量增加，其細(xì)支氣管灌洗含有比對照組更高濃度的組胺，與纖維化的嚴(yán)重程度相關(guān)。肥大細(xì)胞可以由趨化因子和生長因子募集，通過分泌各種細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，合成和分泌膠原蛋白，參與肺纖維化進(jìn)程[26]。肥大細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的CADM1依賴性相互作用促進(jìn)肥大細(xì)胞活化和存活。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子作為IPF患者肺纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)，主要來源于肥大細(xì)胞。結(jié)締組織生成因子(CTGF)在肺肥大細(xì)胞中具有免疫陽性信號，表明肺中的肥大細(xì)胞也是肺纖維化期間肺中CTGF增加的機(jī)制[27]。

7 間充質(zhì)細(xì)胞

間充質(zhì)細(xì)胞，特別是成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的作用對IPF發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。AEC損傷和細(xì)胞凋亡、凝血途徑的激活及異常的傷口修復(fù)機(jī)制，可直接募集成纖維細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)分化和增殖而逐漸破壞肺基質(zhì)，進(jìn)一步導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的激活和積聚。成纖維細(xì)胞是肺中Ⅰ型膠原蛋白的主要來源,而Ⅰ型和Ⅲ型膠原的比例不平衡，導(dǎo)致膠原沉積和肺纖維化。AEC經(jīng)過EMT是否可以被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞，仍然存在爭議。肌成纖維細(xì)胞比成纖維細(xì)胞合成更多的ECM。

通過全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)和IPF患者中mRNA表達(dá)模式的各種分析顯示，與肺發(fā)育相關(guān)的胚胎學(xué)途徑(例如Wnt、PTEN/PI3激酶/Akt、hedgehog和TGF-β信號通路)和表觀遺傳因素在修復(fù)應(yīng)答和肌成纖維細(xì)胞激活中起重要作用[28]。DNA甲基化為表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象之一，Thy-1啟動子中DNA的高甲基化導(dǎo)致IPF肺成纖維細(xì)胞中Thy-1的表達(dá)降低，隨之可造成肌成纖維細(xì)胞的不受控制的生成和疤痕形成[29]。組蛋白乙?；母淖兛捎绊懪c纖維化和(或)凋亡相關(guān)的基因(例如Fas-配體，環(huán)加氧酶2和CXCL-10)的表達(dá)，導(dǎo)致IPF成纖維細(xì)胞變得對凋亡具有抗性[30]。

8 肺纖維化中關(guān)鍵因子

許多專家認(rèn)為IPF發(fā)病機(jī)制以Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞的損傷和AEC層的破壞作為起始事件，其后促纖維化細(xì)胞因子釋放激活上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生過量膠原蛋白，造成肺組織不可逆損傷。

有假設(shè)提出，由于呼吸引起的細(xì)胞外細(xì)胞基質(zhì)拉伸可能通過TGF-β激活促進(jìn)肺纖維化疾病進(jìn)展[31]。TGF-β1基因沉默內(nèi)皮祖細(xì)胞移植可能通過降低Smad-2表達(dá)及增強(qiáng)Smad-7的表達(dá)從而抑制肺纖維化。TGF-β1可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性，加強(qiáng)金屬蛋白酶組織抑制劑的作用，刺激成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成促炎和致纖維化細(xì)胞因子(TNF-α、PDGF、IL-13和 IL-1β)，參與肺纖維化形成，減少膠原分解[32]，還能夠誘導(dǎo)AECs發(fā)生EMT和促進(jìn)其凋亡，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[33]。

其余重要因子還包括：VEGF可參與血管生成和增加血管通透性，作為內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化因子，參與內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[34]，PDGF同樣具有該作用。CTGF是成纖維細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)生和肌成纖維細(xì)胞分化的強(qiáng)烈刺激因子，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖、遷移和分化，促進(jìn)肺纖維化形成。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)不僅誘導(dǎo)單核細(xì)胞參與肺纖維化彌漫性肺泡炎的發(fā)生，其還在誘導(dǎo)肺纖維化中起關(guān)鍵作用，凝血酶可誘導(dǎo)其分泌增加，敲去MCP-1或其主要受體CCR2可保護(hù)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化[35]。肺纖維中高表達(dá)的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)可以促進(jìn)ROS的生成，通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生有氧糖酵解，增加膠原的生成[36]。AngⅡ可能通過上調(diào) Hippo信號通路中Yapl的表達(dá)和TGF-β1/smad信號通路中smad2/3的表達(dá),從而促進(jìn)Ⅰ型膠原的合成,最終誘導(dǎo)大鼠肺纖維化。

已有研究表明，Krebs von den lungen-6抗原(KL-6)、表面活性蛋白A(SP-A)和表面活性蛋白D(SP-D)、MMP-1和MMP-7、CC趨化因子配體18(CCL18)、IL-8、熱休克蛋白70(HSP70)、CXCL-13等生物標(biāo)志物可作為IPF預(yù)后指標(biāo)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2(IGFBP-2)可作為IPF診斷生物學(xué)標(biāo)志物[37]。

9 展 望

肺纖維化的形成是一個極其復(fù)雜的過程，是致病因素與人體不斷相互作用的結(jié)果。本文通過對肺纖維化過程中的細(xì)胞及介質(zhì)進(jìn)行簡要闡述，以提供治療方向及尋找早期診斷和評估疾病預(yù)后的指標(biāo)。目前在理解IPF發(fā)病機(jī)制和可以提供給患者的治療方面已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。然而，關(guān)于診斷和管理的主要問題仍然存在，目前，只有來自HRCT或SLB的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)可供診斷依據(jù)。對肺纖維化機(jī)制的研究已經(jīng)提出了幾種不同的遺傳和生物標(biāo)志物用于輔助診斷和預(yù)后，但是到目前為止其臨床效用仍然難以明確。新鑒定的基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)記物可能會徹底改變該領(lǐng)域，與胸部影像學(xué)和組織病理學(xué)相結(jié)合提供更好的診斷精確度。若能早期診斷肺纖維化，就能及早干預(yù)，阻止疾病進(jìn)展和預(yù)防疾病發(fā)生，進(jìn)而改善患者預(yù)后。