基因編輯技術(shù)的發(fā)展及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

何利娟，徐如夢，李冬月，鄭超，鄭二松，梁偉芳，周潔，楊勇，陳劍平，王栩鳴，嚴(yán)成其,3

1.浙江師范大學(xué) 生化學(xué)院，浙江 金華 321000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江省植物有害生物防控重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；3.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201；5.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌712100

隨著系統(tǒng)生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，全球農(nóng)業(yè)科技正在發(fā)生顯著變化。大規(guī)?；蛸Y源發(fā)掘和利用有了系統(tǒng)性的理論與堅實的分子生物學(xué)技術(shù)作為基礎(chǔ)?；蚍治?、細(xì)胞工程、染色體工程、分子標(biāo)記輔助選擇、基因克隆與轉(zhuǎn)基因等技術(shù)已經(jīng)成為高效種質(zhì)創(chuàng)新的主體策略。分子設(shè)計育種將提供大量突破性品種并催生智能植物品種的誕生。傳統(tǒng)育種和基因工程相結(jié)合培育新的植物品系已經(jīng)成為主流研究手段。其中，以CRISPR/Cas9 為代表的基因組編輯工具發(fā)展尤為迅猛，已成為一項新興的顛覆性技術(shù)。利用基因編輯改變作物產(chǎn)量、抗性等農(nóng)業(yè)性狀方面的科研報道層出不窮。從純粹的技術(shù)手段上講，利用分子生物學(xué)操作改良作物，尤其像水稻這樣的模式生物的農(nóng)藝性狀已經(jīng)沒有不可逾越的技術(shù)障礙。然而，目前社會對轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的安全性還普遍存疑，世界各國對轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的管控也非常嚴(yán)格，而對基因編輯的監(jiān)管也還有很多不甚明朗的地方。所以，從現(xiàn)實應(yīng)用角度講，當(dāng)前基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域如何從一項研究轉(zhuǎn)化為可運用的技術(shù)，需要考慮更多的是社會的接受程度及相應(yīng)產(chǎn)品的監(jiān)管問題。

1 基因編輯

我們身處在一個遺傳學(xué)高速發(fā)展的時期，遺傳分析和遺傳操作技術(shù)進(jìn)步飛速。高通量DNA測序和基因組編輯等技術(shù)正在通過模式生物研究、遺傳進(jìn)化研究、食品工程改進(jìn)、醫(yī)學(xué)應(yīng)用等方面影響人們的生活。傳統(tǒng)的遺傳學(xué)研究依賴于自發(fā)突變的發(fā)現(xiàn)和分析，孟德爾（Gregor Johann Mendel）、摩爾根（Thomas Hunt Morgan）和埃弗里（Oswald Theodore Avery）等先驅(qū)很好地展示了這一點。在 20 世紀(jì)中葉，Muller 和 Auerbach 證明通過輻射或化學(xué)處理可以提高誘變率[1-2]。但這些操作，如輻射和化學(xué)誘變，在基因組中產(chǎn)生的是隨機(jī)變化的位點。20 世紀(jì)七、八十年代，在酵母和小鼠中產(chǎn)生了第一批靶向基因組變化[3-6]。從本質(zhì)上來講，基因組編輯所做的就是打斷染色體DNA，而其關(guān)鍵在于這種打斷是特異性針對特定位點的。DNA 雙鏈斷裂（DSB）發(fā)生后，細(xì)胞會采用DNA 修復(fù)機(jī)制對斷裂點進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)過程中，目的基因會發(fā)生特定類型的突變或插入，從而實現(xiàn)基因編輯[7]。通常，修復(fù)機(jī)制導(dǎo)致非同源末端連接（NHEJ）和同源定向重組（HDR）2 種類型的修復(fù)。NHEJ 主要導(dǎo)致可變長度的插入和缺失突變，因此可用于敲除基因。HDR 通常依賴于未損傷的染色單體與同源序列的重組，HDR 基因打靶在高等真核生物細(xì)胞中不是一個有效的過程，通常只有大約1/100 萬的細(xì)胞經(jīng)歷了所需的基因組修飾[8-9]。這種基因編輯有著非常大的潛力，但在目前技術(shù)條件下其非重組效率非常低，且還受其他相關(guān)技術(shù)的限制，因而其應(yīng)用范圍還比較有限[9]。

鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription acti?vator-like effector nuclease，TALEN）這 2 種DNA 結(jié)合蛋白也可以被工程化以編輯特定目的基因。ZFN 由鋅指DNA 結(jié)合域與DNA 切割域融合而成，其編輯效率取決于核酸酶的DNA 親和力和特異性。ZFN 技術(shù)已用于多種動植物的基因編輯，且在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也顯示出重大價值，用于多種病毒的編輯，是一種有效的抗病毒藥物[10]。TALEN 源于人們對轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子（transcription activator-like effector，TALE）的認(rèn)識。最初在植物病原體黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)TALE 能通過細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)被注入植物細(xì)胞，通過靶定效應(yīng)因子促進(jìn)細(xì)菌的侵染?；谄湫蛄刑禺愋越Y(jié)合能力，人們通過將其與FokⅠ核酸酶連接，創(chuàng)造了基因組編輯工具TALEN[11]。ZFN 和TALEN 技術(shù)都需要合成能夠與特異DNA 序列結(jié)合的蛋白模塊，這一步驟非常繁瑣費時。CRISPR/Cas 技術(shù)則使用一段向?qū)NA 引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶到靶點處完成基因組編輯。與ZFN 和TALEN 技術(shù)相比，基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)更加簡單靈活，基本適應(yīng)所有類型的細(xì)胞和生物體[12-13]。

1.1 ZFN技術(shù)

早期基于鋅指核酸酶等方法的基因編輯技術(shù)又被稱為基因打靶。ZFN 具有單獨的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DNA 切割結(jié)構(gòu)域，即天然型IIS 限制酶FokⅠ具有物理上可分割的特性[14]。Kim 等的研究表明，可以通過用人工識別結(jié)構(gòu)域替代天然識別結(jié)構(gòu)域重定向切割位點[15-16]。ZFN的功能首先是在體外被證明的，作為嵌合型限制性內(nèi)切核酸酶，其顯示出明確的切割活性[17]。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中用合成的ZFN 進(jìn)行的實驗顯示出非常高的切割和重組效率[18]。Bibikova 等此后又在果蠅中實現(xiàn)了靶向誘變和靶向基因置換[19-20]。在后繼研究中，ZFN 又被運用到青蛙、大鼠、小鼠、水芹、煙草等各種生物的基因編輯中[4,21-26]。雖然在不同物種中基因編輯效率有所不同，但普遍在10%左右。值得一提的是，在針對植物的基因編輯實驗中，相關(guān)技術(shù)手段更為多樣化。有一些編輯是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，并利用病毒啟動子控制相關(guān)編碼序列來實現(xiàn)的[27-29]，也有采用直接DNA 轉(zhuǎn)化[28,30-32]或者利用病毒作為載體的成功案例[24]。雖然大量報道證實了ZFN的靶向誘變效果，但在某些物種或細(xì)胞類型中卻沒有發(fā)現(xiàn)基因替換。例如在斑馬魚中，雖然ZFN的誘變效率明顯很高，但未見有利用ZFN 實現(xiàn)基因同源替換的報道。采用共注射作為DNA 供體技術(shù)在實驗中未發(fā)現(xiàn)問題，但該技術(shù)似乎無法實現(xiàn)靶位點的切割和重組。這些情況表明，DSB 修復(fù)機(jī)制在不同的細(xì)胞類型和發(fā)育階段是不同的。ZFN 技術(shù)在大量物種中證明可行，其基因編輯效率也可以接受，但是其構(gòu)建策略復(fù)雜，構(gòu)建過程動輒需要2～3個月，后期篩選成本也比較大。

1.2 TALEN技術(shù)

由于基于ZFN的技術(shù)具有許多不足，且構(gòu)建過程復(fù)雜，應(yīng)用成本高，還存在較高的“脫靶”概率，因此，人們在不斷積極探索新的基因組編輯方法。TALEN 就是其中的一種[33]。TALEN 系統(tǒng)的發(fā)展歷史與黃單胞菌屬細(xì)菌的研究有關(guān)。這些細(xì)菌是水稻、胡椒和番茄等作物的病原體，研究顯示這些病原物會將TALE 分泌到植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，從而影響植物的代謝過程，使其對病原物變得更加易感。

對TALE的進(jìn)一步研究表明，它們能夠通過模仿真核轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合并激活其靶基因的表達(dá)。TALE 由DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、核定位信號和激活結(jié)構(gòu)域組成[34]。早在2007，這些蛋白質(zhì)與DNA 結(jié)合能力就已有報道[35]，之后2 組研究人員分別破譯了TALE 蛋白識別靶DNA的代碼[36-37]。證明DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域由單體組成，其中每一個單體結(jié)合一個核苷酸。單體由34 個氨基酸殘基的串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成，其中第12 和13 位是高度可變的（repeat variable diresidue，RVD），它們負(fù)責(zé)識別特定的核苷酸。TALE 簡單的識別特性受到研究者的注意[38]。理論上，人工合成的TALEN 能夠識別任何已知的基因組區(qū)域，進(jìn)而引入雙鏈斷裂。惟一限制是靶序列的5'端之前需要堿基T。但這一缺點影響并不大，因為在大多數(shù)情況下，可以通過改變間隔序列長度來保證這一點。一旦進(jìn)入細(xì)胞核，TALEN 就會與靶位點結(jié)合，而蛋白C 端的FokⅠ結(jié)構(gòu)則會工作引入雙鏈斷裂，并最終實現(xiàn)基因編輯的目的[39]。

1.3 CRISPR/Cas9技術(shù)

在TALEN 技術(shù)問世后約2年，另一種基于CRISPR/Cas的基因組編輯系統(tǒng)被開發(fā)出來，其主要元件是非編碼RNA 和Cas 蛋白。與嵌合TALEN蛋白不同，CRISPR/Cas 系統(tǒng)通過非編碼RNA 識別靶位點，利用RNA 和DNA 之間互作來進(jìn)行靶基因的錨定，形成的非編碼RNA 和Cas 蛋白的復(fù)合物則會切割相應(yīng)的基因位點。早在1987年，就在某些細(xì)菌基因中發(fā)現(xiàn)了一些奇特的重復(fù)序列[40]，而在接下來的近20年里，它們的功能一直未被弄清。直到2005年，細(xì)菌基因組測序才逐漸揭開了這些序列的神秘面紗。相關(guān)研究顯示，許多微生物的基因組中都存在相似的核苷酸序列，即一些通過短回文重復(fù)序列分開的DNA 區(qū)域，被命名為規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。這些CRISPR 表達(dá)盒往往位于具有解旋酶和核酸酶活性的 Cas 基因附近[41]。2005年，3 個獨立的生物信息學(xué)研究小組報告，CRISPR 表達(dá)盒中間區(qū)DNA 通常與許多噬菌體和質(zhì)粒的DNA 同源[42-44]。2007年，在嗜熱鏈球菌中的研究表明，細(xì)胞如果在CRISPR 基因座上攜帶與噬菌體基因組DNA 互補片段，會使其對噬菌體具有抗性[45]。

CRISPR 系統(tǒng)起源古老，在原核生物中廣泛存在，87%的古細(xì)菌和48%的真細(xì)菌中都有它們的身影[46]。由于這個原因，CRISPR 系統(tǒng)在不同物種中顯示出相當(dāng)高的保守性。在大多數(shù)物種中，CRISPR 盒數(shù)量（1～18）、重復(fù)大?。?3～37 bp）及間隔物的數(shù)量和大?。?7～84 bp）都相當(dāng)類似[47]。

自然界中，CRISPR 系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制形成分為3 個主要階段。第一階段，將進(jìn)入宿主細(xì)胞的外源DNA 小片段插入宿主基因組的CRISPR 基因座，形成新的間隔區(qū)，間隔區(qū)側(cè)翼有2～5 bp的保守序列 PAM（protospacer adjacent motif）[48-49]。新形成的間隔區(qū)總是插入CRISPR 表達(dá)盒前導(dǎo)序列之前富含AT的一頭。這也是大多數(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng)新靶標(biāo)形成的方式[50-51]。第二階段，是整個CRISPR 基因座的轉(zhuǎn)錄。基因座被轉(zhuǎn)錄為長的pre-crRNA（poly-spacer 前體 crRNA）。在大多數(shù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，未成熟轉(zhuǎn)錄物加工為成熟crRNA（CRISPR RNA）是通過Cas6 內(nèi)切核酸酶實現(xiàn)的[52-54]。crRNA 通常為 39～45 個核苷酸，其中含有一個間隔序列，而它們的末端則含有參與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成的序列[55-56]。第三階段，參與外源DNA或RNA的干擾。由crRNA 和Cas 蛋白復(fù)合物來實現(xiàn)，crRNA 負(fù)責(zé)互補識別靶標(biāo)序列，Cas 蛋白則負(fù)責(zé)對其進(jìn)行切割降解。

另一方面，病原物在與其宿主的長期協(xié)同進(jìn)化過程中形成了針對CRISPR 干擾的保護(hù)機(jī)制[57]，因而在細(xì)菌和古細(xì)菌中存在多種CRISPR/Cas 系統(tǒng)。生物信息學(xué)研究顯示，CRISPR/Cas 系統(tǒng)可分為3 種大類型和至少10 種亞型[41,47]。其中，從化膿性鏈球菌病原體分離的II-A CRISPR/Cas 系統(tǒng)使用最廣泛。從這種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了一組最小的Cas 基因，以及一種多功能的Cas9 蛋白。該蛋白既能對pre-crRNA 進(jìn)行加工，也能對外源DNA 進(jìn)行切割[47,58]。crRNA 加工還依賴于小的非編碼RNA——tra-crRNA（trans-activating crRNA）。tracrRNA 分子與pre-crRNA 中的重復(fù)序列互補結(jié)合，形成雙鏈體，然后在宿主細(xì)胞的RNaseⅢ與Cas9 復(fù)合體共同作用下切割雙鏈體，形成含有20個核苷酸間隔序列的成熟crRNA。在Mg2+存在的情況下，Cas9 在crRNA的引導(dǎo)下，在靶基因座中產(chǎn)生雙鏈斷裂[59]。在實際應(yīng)用中，我們還需要考慮CRISPR/Cas 系統(tǒng)的PAM 序列，常用的化膿性鏈球菌Cas9的靶DNA 必須含有序列為NGG的PAM，而在嗜熱鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌中，Ⅱ型Cas9 對應(yīng)的PAM 序列則分別為NGGNG 和NNNNGATT[59-60]。

2 基因編輯的應(yīng)用

2.1 基因編輯在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用

基因組編輯已成為科研和商業(yè)、醫(yī)學(xué)應(yīng)用中廣泛使用的工具，CRISPR/Cas 無可否認(rèn)是其中最為便捷且應(yīng)用最為廣泛的一項技術(shù)。由于先前使用ZFN 和TALEN的研究取得了令人鼓舞的結(jié)果[61-62]，一些涉及基因組編輯的體細(xì)胞療法已獲準(zhǔn)用于Ⅰ期臨床試驗[63-64]。相較于體細(xì)胞級別的治療，種系編輯要更為激進(jìn)，因為它能夠?qū)⒕庉媯鬟f至胚胎，導(dǎo)致疾病的基因位點永遠(yuǎn)地從被治療的個體的血統(tǒng)中消失。但這樣做的風(fēng)險也非常大，因為糾正DNA 序列的嘗試有可能是弊大于利的。而且，由于基因組中的突變不僅影響受治療的個體，還會遺傳給其后代，因而它們的效果還存在很大的不可預(yù)測性。由于CRISPR的編輯的易用性，基于該技術(shù)的種系編輯存在被濫用的可能，帶來的一系列倫理問題也值得人們深思[65]。

2.2 基因驅(qū)動與基因編輯

基因驅(qū)動是一種基于基因編輯的基因工程技術(shù)。與普通的基因編輯相比，它能夠快速地在整個種群中傳播經(jīng)過修改的基因。自然界也存在天然基因驅(qū)動，但目前研究者的興趣主要集中在由CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因驅(qū)動[66]。蚊子是很多熱帶疾病的載體，傳播的疾病對人類生命和健康造成了威脅。目前已有針對蚊子開展利用基因驅(qū)動的研究，生產(chǎn)雌性不育的蚊子[67]或使蚊子群體無法傳播瘧疾[68]?；蝌?qū)動的好處比較直接：在公共衛(wèi)生方面，可利用這種技術(shù)制造遏制登革熱、瘧疾和寨卡病毒傳播的轉(zhuǎn)基因蚊子；在農(nóng)業(yè)方面，可通過該技術(shù)控制或修改那些破壞作物或攜帶作物疾病的物種。但是它對生態(tài)方面的影響卻是非常深遠(yuǎn)的，即便是來自實驗室的一次很小的、事故性的釋放都有可能造成基因驅(qū)動的全球傳播。此外，基因驅(qū)動技術(shù)還有可能帶來意想不到的后果，比如對非目標(biāo)物種造成破壞或制造出新的強(qiáng)勢入侵物種。

2.3 基因編輯在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用

CRISPR/Cas9 是目前獲得廣泛認(rèn)可的專一性好、基因定點突變效率高的基因組編輯技術(shù)。作為新的基因定點編輯工具，其構(gòu)建簡單、成本低、快速且高效，已廣泛用于牲畜和農(nóng)作物的基因組編輯。從本質(zhì)上講，由基因編輯所產(chǎn)生的新品種都是經(jīng)過基因改造的，屬于廣義的轉(zhuǎn)基因范疇。但它們與早期的轉(zhuǎn)基因生物又有重大區(qū)別[69]。大多數(shù)情況下，這些新品種沒有引入來自其他物種的遺傳物質(zhì)，而且引入的變化通常在自然情況下也會發(fā)生。即使是利用基因編輯導(dǎo)入外源DNA，它們也是被精確地插入基因組的特定位置。因此，相比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其安全性高得多。

目前基因編輯作物的例子非常的多，包括高產(chǎn)水稻[70]、抗病小麥[71]、耐儲存的馬鈴薯[72]和生產(chǎn)健康油料的大豆[73]等。畜牧產(chǎn)品方面也有很多成功案例，如缺乏角的奶牛[74]、綿羊[75-76]、攜帶更多肌肉的豬和其他食用動物[77]。基因組編輯具有優(yōu)于育種選擇的優(yōu)勢，即可以在一代中引入性狀而不破壞有利的遺傳背景?？梢詫⑾嗤挠幸嫘揎椧脒m合于不同環(huán)境的不同品種或栽培品種。2016年，Nature雜志在報道中提到美國賓夕法尼亞州立大學(xué)科學(xué)家楊亦農(nóng)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)得到的工程化蘑菇已經(jīng)開始種植售賣，而美國農(nóng)業(yè)部并沒有對這種新型CRISPR/Cas9 基因編輯蘑菇進(jìn)行管制。美國農(nóng)業(yè)部認(rèn)為不需特殊監(jiān)管程序來監(jiān)管這種蘑菇的培養(yǎng)和售賣。此外，還有幾十種基因修飾生物（genetically modified organisms，GMO）（大多數(shù)是植物）也被美國農(nóng)業(yè)部認(rèn)可無需特殊監(jiān)管[78]。這些通過編輯進(jìn)行精確基因組修飾的產(chǎn)品是否會比早期的轉(zhuǎn)基因生物更易獲得公眾認(rèn)可，還有待觀察。

2.4 CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用前景

全球有超過30 億人每天攝取大米，水稻所提供的能量約占世界膳食消耗總能量的20%[79]。由于水稻具有廣泛的適應(yīng)性，因此，它的生產(chǎn)是事關(guān)全球糧食安全的戰(zhàn)略性議題[80]。隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，CRISPR/Cas9 技術(shù)在水稻基因功能研究方面有了長足發(fā)展。采用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻基因組，改變水稻的各種農(nóng)藝性狀，已不再具有不可逾越的技術(shù)障礙。過去的幾十年中，傳統(tǒng)的突變體篩選和分子輔助育種為水稻生產(chǎn)做出了巨大貢獻(xiàn)。然而目前，水稻生產(chǎn)面臨諸多新挑戰(zhàn)，如人口快速增長、全球氣候變化，以及由此衍生的新的病蟲害及其他環(huán)境問題。因此，迫切需要更先進(jìn)的技術(shù)和方法來創(chuàng)制水稻新品種，使其具有更高的產(chǎn)量、更好的生物/非生物脅迫耐受性。

從2013年起，有大量關(guān)于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在水稻中成功定向誘變的報道[81-85]。其中部分研究還顯示，相比于TALEN，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)誘發(fā)的突變頻率更高[84]。在作物中，產(chǎn)量、質(zhì)量和脅迫響應(yīng)等農(nóng)藝學(xué)性狀往往由多個基因共同控制，因此有不少探究水稻多靶點基因編輯方法及效率的研究。實際結(jié)果非常鼓舞人心，基于CRISPR/Cas9 構(gòu)建的三靶點、四靶點的基因編輯都獲得了成功[81,86-87]。這些研究清楚地表明CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是水稻染色體工程的高效工具。Ma 等的一項研究還測試了基因組編輯效率[88]，在水稻基因組中編輯的46 個目標(biāo)位點平均突變頻率為85.4%。該研究還同時編輯了OsWaxy 基因內(nèi)的3 個位點，使編輯后的材料直鏈淀粉含量降低了14%。此后，Liang 等開發(fā)了水稻 CRISPR/Cas9-sgRNA 多重編輯系統(tǒng)新策略，設(shè)計了21 個sgRNA，其中82%的目標(biāo)位點顯示缺失、插入、取代和倒位，顯示出CRISPR/Cas9 優(yōu)秀的編輯效率[89]。所有這些研究表明，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠高效地產(chǎn)生單個或多個基因突變，可用于加速水稻育種。

CRISPR/Cas9 技術(shù)為水稻從基礎(chǔ)研究到生產(chǎn)應(yīng)用的銜接提供了橋梁，能為水稻育種實踐提供更直接的助力，有著極其廣闊的應(yīng)用前景。更重要的是，CRISPR/Cas9 技術(shù)在水稻中的應(yīng)用具有很強(qiáng)的實用性，比如針對水稻抗病性的研究和產(chǎn)量方面的研究。水稻對東格魯病的抗性與翻譯起始因子4γ基因（eIF4G）密切相關(guān)，利用CRISPR/Cas9 產(chǎn)生突變后，敏感品種IR64 也能獲得對東格魯病的抗性，從而提高水稻產(chǎn)量[90]。研究顯示，采用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)同時對 Grain Width2（GS3）、Grain Width（GW5）和 Grain Width（TGW6）進(jìn)行編輯，能夠顯著增加谷粒重量[91]。朱健康院士團(tuán)隊利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)編輯ABA 受體基因，提高了水稻產(chǎn)量[70]。

3 基因編輯的優(yōu)勢及面臨的問題

常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)普遍采用的方式是通過導(dǎo)入外源基因來實現(xiàn)相關(guān)性狀的改良。這種操作會向作物基因組導(dǎo)入3 類外源物質(zhì)：一是目標(biāo)外源基因，二是用于調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的相關(guān)元件，三是轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)簽[92]。其中，外源基因又可以從親緣關(guān)系上分為多種情況。例如，向水稻導(dǎo)入不同品種的基因、導(dǎo)入同族的野生稻基因、導(dǎo)入其他物種基因等。而表達(dá)調(diào)控元件和轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)簽更是五花八門，各種各樣。正是由于這種紛繁復(fù)雜的情況，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理的復(fù)雜性，也使得社會和科學(xué)共同體內(nèi)部對轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的安全性存有揮之不去的疑慮。這些擔(dān)心也是很好理解的，因為任何一部分外源物質(zhì)導(dǎo)致的不可預(yù)知的后果，都會影響到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品整體的安全性。這些擔(dān)憂也是農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)應(yīng)用的主要阻力之一。

以CRISPR/Cas9 為代表的基因編輯技術(shù)與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)有著很大的差別。從本質(zhì)上來講，它們的生物學(xué)功能是切割降解DNA，因此，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)非常適合于對特定目標(biāo)基因的特定位點進(jìn)行剪切，造成單核苷酸級別的改變，從而改變作物的原有基因功能。當(dāng)然，CRISPR/Cas9 或其他方法介導(dǎo)的雙鏈斷裂后的DNA 修復(fù)過程都取決于細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制。NHEJ在連接斷裂DNA 時會引入一些突變，而大多情況下高等真核生物NHEJ 產(chǎn)生突變，而非插入DNA片段。因此，如果目標(biāo)僅僅是敲除蛋白質(zhì)編碼序列，這樣的編輯效率是比較高的。當(dāng)然這一技術(shù)也能用于外源DNA 片段導(dǎo)入，只是效率較低，成本較高[93-94]。值得一提的是，對于非插入型的應(yīng)用，在基因編輯完成后，可以從分離的后代中找到完全沒有任何外源片段的材料，這也是大家追求的結(jié)果。就目前的報道來看，包括CRISPR/Cas系統(tǒng)和ZFN、TALEN 在內(nèi)的基因編輯方法的有效性都很好，但它們的特異性都不完美，均存在脫靶問題，而且有潛在的產(chǎn)生一系列脫靶效應(yīng)的可能，引起基因組的重排或無法預(yù)測的突變，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞死亡[95]。人們對脫靶的關(guān)注程度取決于應(yīng)用。在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上這個問題相對嚴(yán)重，因為脫靶導(dǎo)致的無法預(yù)測的結(jié)果有時是無法接受的。當(dāng)然如果脫靶不會引發(fā)新的臨床病癥的突變，它們并非不可忍受。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用，尤其是作物基因編輯方面，由于不涉及倫理問題，這一缺點就不是非常明顯。因為研究者可以對作物的基因組進(jìn)行完整測序，并且可以徹底分析突變材料的表型，從而排除那些無效或有害的突變。

4 結(jié)語

隨著CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，人們變得越來越關(guān)注這一技術(shù)的倫理和社會影響。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如何限定基因編輯技術(shù)的應(yīng)用顯得非常令人困惑。當(dāng)然，針對某些破壞性疾病，如亨廷頓病和肌肉萎縮癥，顯然社會比較容易形成共識；但如果是身材矮小、運動能力低下這些問題，則回答就會模糊得多。更進(jìn)一步，頭發(fā)顏色、眼睛顏色、身高、膚色，這些方面是否允許做人為改變，則涉及更深層次的倫理問題，一定會引起更廣泛的爭論。所幸的是在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面這些問題不那么尖銳，因為農(nóng)業(yè)產(chǎn)品尤其是作物往往很少涉及倫理問題。但監(jiān)管方面的爭論依然十分激烈。目前歐盟對轉(zhuǎn)基因和基因編輯的監(jiān)管在全球來講相對比較嚴(yán)格，其法律要求任何基因改造的作物都必須是可檢測的，且遺傳變化必須與傳統(tǒng)育種技術(shù)具有相同的穩(wěn)定性。但歐盟內(nèi)反對轉(zhuǎn)基因群體的呼聲一直也很高，這些群體認(rèn)為轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能產(chǎn)生“非自然”的危害，因為它們不是生物體的“正常”部分，基因編輯同傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因一樣應(yīng)該受到嚴(yán)格監(jiān)管。但是像CRISPR/Cas9 這樣的新技術(shù)又顯得非常不同，因為所有的基因編輯變化雖然都是可檢測的，但這些改變與其他傳統(tǒng)的育種方法，如輻照誘變、化學(xué)誘變引入的變化無法區(qū)分。因此，在爭論還在繼續(xù)的情形下，政府與國家層面的規(guī)范和立法對該技術(shù)未來的發(fā)展至關(guān)重要。