重組新城疫病毒疫苗研制現(xiàn)狀

李文桂，陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又稱禽副粘病毒1 型（Avian paramyxovirus type 1，APMV-1），是禽類新城疫的病原體，對(duì)禽類養(yǎng)殖危害較大。按照其致病特性，NDV 常分為低毒、中毒和高度株，其中低毒株是傳遞目的基因的理想載體，可作為病毒載體表達(dá)外源基因。Peeters等[1-2]首先構(gòu)建了NDV的反向遺傳操作系統(tǒng)，這為構(gòu)建重組新城疫病毒提供了有利工具。人們先后構(gòu)建了多種表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）或增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的重組 NDV 疫苗[3-5]，這為篩選重組新城疫病毒提供了方便。國內(nèi)外學(xué)者先后報(bào)道了大量重組新城疫病毒疫苗，這些病原體包括禽流感病毒、人副流感病毒3 型、犬瘟熱病毒、禽巨肺病毒、呼吸道合胞病毒、Nipah 病毒、水皰性口炎病毒、狂犬病毒、牛短嶄熱病毒、傳染性支氣管炎病毒、重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、腸病毒71 型、脊灰病毒、Ⅰ型人類免疫缺陷病毒、傳染性法氏囊病毒、諾如病毒、非洲豬瘟病毒、牛皰疹病毒1 型、西尼羅病毒、鵝細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體和博氏疏螺旋體等。在此，我們簡(jiǎn)要綜述重組新城疫病毒的構(gòu)建及其免疫機(jī)制等方面的研究進(jìn)展。

1 重組新城疫病毒抗正粘病毒

1.1 禽流感病毒

禽流感病毒（Avian influence virus，AIV）的血清型多，變異性強(qiáng)，嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)，并可感染人類。AIV 可分為低致?。↙PAIV）的 H9N2 型和高致?。℉PAIV）的H5N1 和H7N9 型。血凝素（HA）是一種包膜糖蛋白，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答[6]。Nakaya 等[7]將 HA 基因插入 pNDV/B1得 pNDV-HA，加輔助質(zhì)粒 pTM-NP、pTM-N 和pTM-L 共同導(dǎo)入新城疫病毒HB1 株，然后轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）的DF1 株，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-HA表達(dá)的70kD的HA抗原。將 3×107PFU 疫苗靜脈或腹腔注射BALB/c 鼠，初次接種后4 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后5 周免疫組的血清IgG 上升，滴度分別為 1∶360 和 1∶110，此時(shí)用 105PFU的 A 型流感病毒W(wǎng)SN-33 株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后10 d 發(fā)現(xiàn)靜脈、腹腔注射組和對(duì)照組的保護(hù)力分別為100%（5/5)、100%（5/5）和0（0/5）。

Nagy 等[8]將 HA 基因插入 pNDV 得 pNDV-HA，加新城疫病毒LaSota 株轉(zhuǎn)染人腺癌肺泡基底上皮細(xì)胞A549，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可識(shí)別 rNDV-HA 表達(dá)的63kD的HA抗原；將 107病灶形成單位（FFU）疫苗點(diǎn)眼滴鼻或肌肉注射接種2 周齡仔雞，接種后4 周提示免疫組血清IgG 上升，此時(shí)用107PFU 禽流感病毒H9N2 株進(jìn)行點(diǎn)眼滴鼻攻擊，攻擊后3～9 d 發(fā)現(xiàn)口咽和泄殖腔拭子的病毒負(fù)荷明顯降低，肝、肺和支氣管病變顯著減輕。Hu 等[9]將HA 基因插入pLX 得pLX-HA，加新城疫病毒LaSota株共同轉(zhuǎn)染BSR-T7/5 株，篩選重組病毒，以從rNDVHA 提取的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1750 bp的基因片端；將5×106EID50（雞胚半數(shù)感染量）疫苗滴鼻接種3 周齡仔雞，初次接種后2 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后4 周提示免疫組血清IgG 上升，此時(shí)用105EID50禽流感病毒H7N9 株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后2 周免疫組和對(duì)照組的存活率分別為80%（8/10）和0（0/5）。曹有才等[10]將HA 基因插入pBSK得pBS-HA，與pBRN-FL 重組得pBRN-HA，加新城疫病毒LaSota 株共同轉(zhuǎn)染BSR-7 細(xì)胞，篩選重組病毒，間接免疫熒光技術(shù)提示rNDV-HA的表面含有HA 抗原分子。胡瀟等[11]將HA 基因插入pMD-18T得pMD-HA，與pTS-M 重組得pTS-HA，加新城疫病毒 LaSota 株轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可識(shí)別rNDV-HA 表達(dá)的61 kD的HA 抗原。

人們發(fā)現(xiàn)將目的基因按照動(dòng)物密碼子的使用偏好進(jìn)行優(yōu)化，可明顯提高靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平，從而增強(qiáng)DNA 疫苗的免疫原性。陳曦等[12]將密碼子優(yōu)化的HA 序列（OptHA）插入pBSK得 pBSK-OptHA，與 pBRN-FL 重組得 pBRN-Op?tHA，加新城疫病毒LaSota 株共同轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合 rNDV-OptHA 表達(dá)的 55 kD的 OptHA 抗原，共聚焦顯微鏡顯示rNDV-OptHA 感染的細(xì)胞中存在HA 和NDV 抗原，其中表達(dá)的HA 蛋白定位于細(xì)胞膜上；將5×106EID50疫苗點(diǎn)眼滴鼻免疫1 周齡仔雞，初次接種后5 周進(jìn)行加強(qiáng)，提示免疫組的血清IgG 在初次接種后2～8 周上升，初次接種后7周上升到較高程度。

1.2 人副流感病毒3型

人副流感病毒3型（Human parainfluenza vi?rus type 3，HPIV3）是呼吸道感染的常見病原體。HN 蛋白位于病毒棘突的表面，具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶的活性，是一種保護(hù)性抗原[13]。Bukreyev等[14]將 HN 基因插入 pNDV 得 pNDV-HN，轉(zhuǎn)化新城疫病毒BC 株后再轉(zhuǎn)染人表皮樣瘤癌細(xì)胞Hep-2，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合 rNDV-HN表達(dá)的65kD的HN抗原；將 106.5PFU疫苗滴鼻加支氣管注射接種非洲綠猴，初次接種后后4 周進(jìn)行加強(qiáng)，提示免疫組血清IgG 在初次接種后4～8 周上升，初次接種后8 周上升到較高程度，滴度可達(dá)1∶12.3。

2 重組新城疫病毒病毒抗副粘病毒

2.1 犬瘟熱病毒

犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）是犬瘟熱的病原體。H 基因編碼的糖蛋白H 在病毒融合、生長(zhǎng)和細(xì)胞嗜性方面具有重要作用，Cher?pillod 等[15]將pCI-H/F 肌肉注射免疫犬可有效對(duì)抗CDV的攻擊,提示H/F 蛋白具有較好的免疫原性。田美杰等[16]以犬瘟熱病毒的總RNA 為模板擴(kuò)增 2330 bp的H基因，插入 pBSK 得 pBS-H，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-H 表達(dá)的85kD的H蛋白；將2×109.5EID50疫苗肌肉注射接種犬，初次接種后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，提示免疫組血清IgG 在初次接種后2～5 周上升，初次接種后4 周上升到較高程度，滴度為1∶64。Ge 等[17]以犬瘟熱病毒的總RNA 為模板擴(kuò)增H 和F基因片段，分別插入pLaSota 得pLa-H/F，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2 細(xì)胞，篩選重組蛋白，以從rNDVH/F 抽提的總 RNA 為模板，采用 RT-PCR 方法可克隆出相應(yīng)的H 基因和F 基因片段；將1×109EID50疫苗肌肉注射接種6 周齡水貂，初次接種后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后5 周提示免疫組血清中和抗體上升，此時(shí)用2×104TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）犬瘟熱病毒TM/JL2008 株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后3 周rCDV-H、rCDV-F 和對(duì)照組的存活率分別為100%（4/4）、75%（3/4）和50%（2/4）。

2.2 禽巨肺病毒

禽巨肺病毒（Avian metapmeumovirus，AMPV）是火雞鼻支氣管炎的病原體之一。糖蛋白GP 和融合蛋白F 是2 種主要的膜系結(jié)構(gòu)蛋白，具有較好的免疫原性[18]。Hu 等[19]以禽巨肺病毒的總RNA 為模板擴(kuò)增G/F 基因，將G 基因插入pFLC-pLaSota 株得pLa-G，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從rNDV-F 抽提的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1920 bp的G 基因片段；將107TCID50疫苗點(diǎn)眼滴鼻接種1 周齡火雞，初次接種后2 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后4 周提示免疫組血清 IgG 上升，此時(shí)用 4.2×1010TCID50禽巨肺病毒CoTr 株進(jìn)行點(diǎn)眼滴鼻攻擊，攻擊后1 周取支氣管拭子，熒光定量PCR 檢查病毒負(fù)荷，發(fā)現(xiàn)免疫組和對(duì)照組的保護(hù)力分別為20%（2/10）和0（0/10）；隨后將 F 基因插 入 pIRES-hrGFR2α 得pIRES-F，與 pLa-G 重組得 pLa-G/F，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從rNDV-G/F 抽提的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1920 bp的 G 基因片段和 1700 bp的 F 基因片段；將107TCID50疫苗點(diǎn)眼滴鼻接種1 d 齡火雞，接種后4 周提示免疫組血清IgG 上升，此時(shí)用1×103ID50（半數(shù)感染劑量）禽巨肺病毒AMPV-C 株進(jìn)行點(diǎn)眼滴鼻攻擊，攻擊后1 周免疫組和對(duì)照組的保護(hù)力分別為80%（8/10）和0（0/10）。

2.3 呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）可引起小兒毛細(xì)支氣管炎或支氣管肺炎。融合蛋白F 是一種包膜蛋白，可引起RSV 與宿主細(xì)胞膜的融合，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一定的保護(hù)力[20]。Martinez-Sobrido 等[21]將 F 基因插入 pLaSota 得 pLa-F，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Vero 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從rNDV-F 提取的總RNA 為模板，采用RT-PCR方法可克隆出F 基因片段；將5×105PFU 疫苗滴鼻接種IFNAR-/-鼠，接種后4 周用107PFU 呼吸道合胞病毒有毒株進(jìn)行鼻滴攻擊，攻擊后8 d 提示免疫組肺組織的病毒負(fù)荷下降至1/10，肺組織的病變減輕，ELISPOT 證實(shí)脾 IFN-γ+SFCs 數(shù)目增加。

2.4 Nipah病毒

Nipah 病毒（Nipah virus，NiV）可引起呼吸道感染，重癥常伴有病毒性腦炎等并發(fā)癥。糖蛋白G 和融合蛋白F 是Nipah 病毒包膜蛋白的主要成分，將它們免疫仔豬可產(chǎn)生有效的抵抗力[22]。Kong 等[23]將G/F 基因插入pLaSota 得pLa-G/F，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BHK-21 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從rNDV-G/F 抽提的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1920 bp的 G 基因片段和 1700 bp的 F 基因片段；將 2×109EID50疫苗肌肉注射接種仔豬，初次接種后4 周加強(qiáng)1 次，免疫組血清 IgG 在初次接種后 2～29 周上升，初次接種后13 周上升到較高程度。

3 重組新城疫病毒抗彈狀病毒

3.1 水皰性口炎病毒

水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）是水皰性口炎的病原，將糖蛋白GP 免疫宿主可產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答[24]。李曉芳等[25]以水皰性口炎病毒的基因組DNA 為模板擴(kuò)增1592 bp的GP 基因，插入 pBSK 得 pBS-GP，與 pBRN-FL 重組得 pBRN-GP，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-GP 表達(dá)的60 kD的 GP 抗原；將 2×106EID50疫苗肌肉注射接種BALB/c 鼠，初次接種后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，提示免疫組血清IgG 在初次接種后2～5 周上升，初次接種后5 周上升到較高程度。Zhang 等[26]將107TCID50疫苗肌肉注射接種BALB/c 鼠，初次接種后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后5 周提示免疫組血清IgG、IgG2a 和IgG1 上升；此時(shí)用107TCID50水皰性口炎病毒有毒株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后5 d 免疫組的心腦肝腎組織病毒負(fù)荷下降至1/104；隨后將107TCID50疫苗接種BALB/c鼠，雌雄共養(yǎng)2 周后產(chǎn)下仔鼠，用103TCID50水皰性口炎病毒EP 株對(duì)12 d 齡的仔鼠進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后12 d 免疫組和對(duì)照組的存活率分別為33%（3/9）和0（0/9）。

3.2 狂犬病毒

狂犬病毒（Rabies virus）是狂犬病的病原體，用狂犬病毒糖蛋白R(shí)GP 免疫動(dòng)物可產(chǎn)生較好的抵抗力[27]。Ge 等[28]以狂犬病毒的總RNA 為模板擴(kuò)增 RGP 基因，插入 pLaSota 得 pLa-RGP，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-RGP 表達(dá)的RGP 抗原。將108.3、107.3和106.3EID50疫苗分別肌肉注射或滴鼻接種BALB/c 鼠，接種后3 周提示免疫組血清IgG 上升，此時(shí)肌肉注射50 MID50（半數(shù)小鼠感染劑量）狂犬病毒GX/09 株進(jìn)行攻擊，攻擊后12 d 108.3免疫組、107.3免疫組、106.3免疫組和對(duì)照組的存活率分別為 100%（10/10）、100%（10/10）、60%（6/10）和 0（0/10）；隨后將 109.8、109.3和 108.3EID50疫苗肌肉注射或滴鼻接種貓和犬，初次接種后3、6 周加強(qiáng)2 次，提示免疫組血清IgG 和中和抗體在初次接種后3～9 周上升，初次接種后60 周肌肉注射105.8MID50狂犬病毒GX/09 株進(jìn)行攻擊，攻擊后12 周各免疫組的存活率均為100%（5/5），而對(duì)照組為20%（1/5）。

3.3 牛短嶄熱病毒

牛短嶄熱病毒（Bovine ephemeral fever virus，BEFV）是牛短嶄熱病的病原體之一。糖蛋白G 是一種包膜蛋白，可作為保護(hù)性抗原[29]。Zhang 等[30]以牛短嶄熱病毒的總RNA 為模板擴(kuò)增G 基因，插入pLaSota 得pLa-G，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化MDBK 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合 rNDV-G 表達(dá)的 80 kD的 G 抗原；將 2×107TCID50疫苗肌肉注射Holstein 小牛，初次接種后3周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后5 周提示免疫組血清中和抗體升高，滴度為1∶32。

4 重組新城疫病毒抗冠狀病毒

4.1 傳染性支氣管炎病毒

傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis vi?rus，IBV）是雞傳染性支氣管炎的主要病原體。纖突蛋白S 是位于病毒粒子表層囊膜上的糖蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[31]。S 蛋白可分解為S1和S2 亞單位，S1 亞單位高度易變，有助于病毒黏附于宿主細(xì)胞，含有主要的中和表位；S2 亞單位高度保守，有助于病毒的融合活性。焦利紅等[32]以傳染性支氣管炎病毒M41 株DNA 為模板擴(kuò)增S基因，插入 pBSK 得 pBS-S，與 pBRN-FL 重組得pBRN-S，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSK 細(xì)胞，篩選重組病毒蛋白，以從rNDV-S 提取的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出3534 bp的S 基因片段。Zhao 等[33]以傳染性支氣管炎病毒M41 株總RNA為模板擴(kuò)增 S1 基因，插入 pNDV 得 pNDV-S1，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSR-T7/5 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從 rNDV-S 抽提的總 RNA 為模板，采用 RT-PCR 方法可克隆出S1 基因片段；將106EID50疫苗點(diǎn)眼滴鼻接種2 周齡仔雞，初次接種后2 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后3 周提示免疫組血清IgG 上升，流氏細(xì)胞儀（FACS）證實(shí)外周血單核細(xì)胞（PBMC）中CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)增加，此時(shí)用106EID50傳染性支氣管炎病毒有毒株進(jìn)行點(diǎn)眼滴鼻攻擊，攻擊后2 周免疫組和對(duì)照組的存活率分別為100%（10/10）和0（0/10）。

4.2 重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒

重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）是重癥急性呼吸綜合征的病原體，棘突蛋白S 是一種結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒與宿主細(xì)胞的融合過程中起關(guān)鍵作用，將其接種宿主可產(chǎn)生中和抗體[34]。Dinapoli 等[35]將 107PFU 重組 NDV-S 疫 苗皮下注射非洲綠猴，初次接種后4 周進(jìn)行加強(qiáng)，提示免疫組血清IgG 和中和抗體、支氣管灌洗液和鼻咽拭子的SIgA 均在初次接種后28～56 d 上升，初次接種后42 d 上升到較高程度，初次接種后56 d 用106TCID50的SARS-CoV 進(jìn)行滴鼻加氣管內(nèi)注射攻擊，攻擊后2 d 免疫組肺組織的病毒負(fù)荷下降至1/10 000，肺組織的病變減輕。

5 重組新城疫病毒抗絲狀病毒

5.1 埃博拉病毒

埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）是人類重癥出血熱的病原體之一，用包膜糖蛋白GP 免疫宿主可產(chǎn)生較好的保護(hù)力[36]。Dinapoli 等[37]以埃博拉病毒的基因組DNA 為模板擴(kuò)增GP 基因，插入pLaSota 得pLa-GP，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-GP 表達(dá)的100 kD的GP 抗原；將107PFU 疫苗滴鼻或支氣管注射接種恒河猴，初次接種后4 周進(jìn)行加強(qiáng)，提示免疫組血清IgG和中和抗體以及鼻、支氣管分泌液的SIgA均在初次接種后4～8 周上升，初次接種后8 周上升到較高程度，F(xiàn)ACS檢測(cè)表明PBMC中IFN-γ+或TNF-α+的 CD8+T 細(xì)胞增加。

5.2 馬爾堡病毒

馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）是馬爾堡出血熱的病原體。糖蛋白GP 是一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有較好的免疫原性[38]。胡旭東等[39]將2046 bp的 GP 基因插入 pBSK 得 pBS-GP，與 pBRN-FL重組得pBRN-GP，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BHK-21 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清結(jié)合rNDV-GP 表達(dá)的 40 kD的 GP 抗原；將 107EID50疫苗肌肉注射BALB/c 鼠，初次接種后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后5 周提示免疫組血清IgG 上升。

6 重組新城疫病毒抗小RNA病毒

6.1 腸病毒71型

腸病毒71 型（Enterovirus type 71，EV71）可引起幼兒手足口病，常伴發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。VP1 是一種核殼蛋白，將其接種動(dòng)物可產(chǎn)生較好的抵抗力[40]。 Sivasamugham等[41]將VP11-100基因插入pTrcHis2-NPt 得pNPt-VP11-100，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Top10，IPTG 誘導(dǎo)，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合重組病毒表達(dá)的60 kD的NPt-VP11-100融合蛋白；將200 μg 重組蛋白加弗氏佐劑皮下注射接種新西蘭大白兔，初次接種后4、6 周加強(qiáng)2 次，初次接種后10 周提示免疫組血清IgG 上升。Ch'ng等[42]將10 μg 重組蛋白加弗氏佐劑皮下注射接種BALB/c 鼠，初次接種后1 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后2 周提示免疫組血清IgG 上升，此時(shí)腹腔注射10 LD50（半致死劑量）的腸病毒71 型P5 株進(jìn)行攻擊，攻擊后5 d 免疫組和對(duì)照組的存活率分別為94.7%（18/19）和 40%（6/15），免疫組腦脊髓和骨骼肌的病理變化明顯減輕。

6.2 脊灰病毒

脊灰病毒（Poliovirus）可引起小兒麻痹癥。核殼蛋白的前體可被病毒蛋白酶3CD 分解為核殼蛋白P1，P1 和3CD 共表達(dá)后可形成病毒樣顆粒（VLP），誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性抗體[43]。Viktorova等[44]以脊灰病毒的基因組DNA 為模板擴(kuò)增P1/3CD 基因，將其插入 pLaSota 得 pLa-P1/3CD，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化HeLa 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-P1/3CD 表達(dá)的80 kD的 P1 蛋白和 70 kD的 3CD 蛋白；將 105PFU 疫苗滴鼻接種Hartley 豚鼠，初次接種后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，提示免疫組血清IgG、IgM 和中和抗體在初次接種后3～11 周上升，初次接種后9 周上升到較高程度，陰道分泌物IgG 和中和抗體在初次接種后3～9 周上升，初次接種后7 周上升到較高程度。

7 重組新城疫病毒抗其他病毒

7.1 Ⅰ型人類免疫缺陷病毒

Ⅰ型人類免疫缺陷病毒（Human immunodefi?ciency virus type 1，HIV-1）是獲得性免疫缺陷綜合征的病原體。gp160 和gp41 是2 種有效的疫苗候選抗原分子。Carnero 等[45]將密碼子優(yōu)化的Gag 序列（optGag）插入pSL1180 得pSL-optGag，加新城疫病毒HB1 株共同轉(zhuǎn)染DF1 細(xì)胞株，篩選重組病毒，Western印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-optGag 表達(dá)的49 kD的 optGag 蛋白；將 5×105PFU 疫苗滴鼻接種 BALB/c 鼠，初次接種后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后6 周提示脾IFN-γ+的CD8+T 細(xì)胞增加，此時(shí)用106PFU 表達(dá)Gag 蛋白的重組牛痘病毒（VV-Gag）進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后5 d發(fā)現(xiàn)肺組織的病毒負(fù)荷下降至1/100。Maamary 等[46]將 Gagp41 基因插入 pLaSota 得 pLa-Gagp41，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-Gagp41 表達(dá)的 70 kD的 Gagp41 抗原；將 5×105PFU 疫苗滴鼻接種C×B6F1 鼠，初次接種后4 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后5 周經(jīng)ELISPOT 證實(shí)脾IFN-γ+、IL-2+、TNF-α+的CD4+或CD8+T 細(xì)胞數(shù)增加，初次接種后8 周提示免疫組血清IgG上升，此時(shí)用106PFU重組VV-Gag進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后6 d 免疫組肺組織的病毒負(fù)荷下降至1/106。

Khattar 等[47]將 gp160 基因插入 pCR2-1 得 pCR2-1-gp160，與pLaSota 重組得pLa-gp160，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從rNDV-gp160 抽提的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出2598 bp的 gp160 基因片段；將 106PFU 疫苗滴鼻或肌肉注射豚鼠，初次接種后2、4 周加強(qiáng)2 次，初次接種后 6 周提示免疫組血清 IgG、IgGa 和 IgG1 上升，陰道分泌物SIgA 升高，血清中和抗體的滴度分別為1∶164 和1∶44；隨后又構(gòu)建了rNDV-Gag/env，Western印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-Gag/env 表達(dá)的120 kD的 Gp160 蛋白和 55 kD的 p55 蛋白；將 105PFU 疫苗滴鼻接種豚鼠，初次接種后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)免疫組血清IgG 在初次接種后3～8 周上升，初次接種后7 周上升到較高程度，陰道分泌物SIgA 在初次接種后3～8 周上升，初次接種后6 周上升到較高程度，初次接種后 4 周經(jīng) ELISPOT 證實(shí)脾 IFN-γ+SFC 數(shù)增加，初次接種后9 周用107.2TCID50重組VV-Gag 進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后5 d 免疫組的肺組織病毒負(fù)荷下降至1/1000。

7.2 傳染性法氏囊病毒

傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal diseasevirus，IBDV）是禽類法氏囊病的病原體。VP2 是一種構(gòu)成病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白，將其接種動(dòng)物可產(chǎn)生保護(hù)性抗體[48]。Huang 等[49]以傳染性法氏囊病毒GLS-5 株總RNA 為模板擴(kuò)增VP2 基因，插入pGEM-TZ(+)得 pGEM-VP2，與pLaSota重組得pLa-VP2，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從rNDV-VP2 抽提的總RNA 為模板,采用RT-PCR 方法可克隆出1359 bp的VP2 基因片段；將1×104ELD50疫苗點(diǎn)眼接種1 d 齡仔雞，初次接種后3 周加強(qiáng)1 次，初次接種后6 周提示免疫組血清 IgG 和中和抗體上升，滴度分別為 1∶7120 和 1∶982，此時(shí)用103EID50傳染性法氏囊病毒GLS-5 株進(jìn)行點(diǎn)眼攻擊，攻擊后3 d 免疫組和對(duì)照組的存活率分別為100%（10/10）和0（0/10）。

Ge 等[50]將VP2基因插入pBRN-FL得pBRNVP2，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可識(shí)別rNDV-VP2表達(dá)的 42 kD的 VP2 抗原；將 2×106EID50疫苗點(diǎn)眼滴鼻接種7 d 齡仔雞，接種后3 周用105EID50傳染性法氏囊病毒GX 株進(jìn)行點(diǎn)眼滴鼻攻擊，攻擊后8 d 免疫組和對(duì)照組的存活率分別為100%（12/12）和 0（0/8）；隨后將 105.5、104.5、103.5和 102.5EID50疫苗分別卵內(nèi)注射接種18 d 齡雞胚，注射后22 d 仔雞孵出，此時(shí)用103EID50傳染性法氏囊病毒GX 株進(jìn)行點(diǎn)眼滴鼻攻擊，攻擊后10 d 各免疫組和對(duì)照組的存活率分別為74%（37/50）、82%（41/50）、80%（40/50）、86%（43/50）和14%（7/50）。

7.3 諾如病毒

諾如病毒（Norovirus，NoV）可引起病毒性胃腸炎，OPF2 編碼的VP1 是一種主要核殼蛋白，該蛋白可自身聚合成病毒樣顆粒，將其接種動(dòng)物可產(chǎn)生有效的抵抗力[51]。Kim 等[52]以諾如病毒VA387株的總RNA 為模板擴(kuò)增1644 bp的VP1 基因，插入pLaSota 得 pLa-VP1，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合 rNDV-VP1 表達(dá)的 58 kD的 VP1 蛋白；將 106EID50疫苗滴鼻接種 BALB/c 鼠，初次接種后 2、4 周加強(qiáng)2 次，初次接種后6 周提示免疫組血清IgG 和IgG2a 上升，糞 SIgA 升高，ELISPOT 發(fā)現(xiàn)脾 IFN-γ+或TNF-α+SFC 數(shù)增加。

7.4 非洲豬瘟病毒

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）可引起非洲豬瘟。P30 和P72 是2 種有效的保護(hù)性抗原，具有較強(qiáng)的免疫原性[53]。Chen 等[54]以非洲豬瘟病毒 E70 株的 DNA 為模板，擴(kuò)增 p30 和 p72 基因，插入pBSK得pBS-p30/p72，與pLaSota重組得pLa-p30/p72，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從rNDV-p30/p72 抽提的總RNA 為模板，采用RTPCR 方法可克隆出 600 bp的 P30 基因片段，Western印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-p30/p72 表達(dá)的30 kD的 P30 蛋白和 72 kD的 P72 蛋白；將 108EID50重組NDV-p30 肌肉注射BALB/c 鼠，初次接種后2、4 周加強(qiáng)2 次，初次接種后5 周提示免疫組血清IgG上升；接著將108EID50重組NDV-p72 肌肉注射BALB/c 鼠，初次接種后 2、4、6 周加強(qiáng) 3 次，初次接種后 8 周提示免疫組血清IgG、IgG1 和IgG2a 上升，脾細(xì)胞明顯增殖，ELISPOT證實(shí)脾IFN-γ+或IL-4+SFC顯著增加。

7.5 牛皰疹病毒1型

牛皰疹病毒1型（Bovine herpesvirus type 1，BHV-1）是牛傳染性鼻支氣管炎的病原體。糖蛋白gD 是一種包膜蛋白，參與病毒黏附并進(jìn)入宿主細(xì)胞，可誘導(dǎo)有效的保護(hù)力[55]。Khattar 等[56]以牛皰疹病毒1型的基因組DNA 為模板擴(kuò)增gD 基因，插入pCR2-1得pCR2-1-gD，與pLaSota 重組得pLa-gD，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化MDBK 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可識(shí)別rNDV-gD 表達(dá)的71 kD的gD 單體蛋白和140 kD的gD 二聚體蛋白；將106PFU 疫苗滴鼻接種12 周齡小牛，提示免疫組血清IgG 和鼻咽拭子SIgA 在接種后1～4 周上升，接種后 2 周上升到較高程度，接種后 4 周用2×107PFU 牛皰疹病毒 1 型Cooper 株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后10 d 免疫組的鼻咽拭子病毒負(fù)荷下降至1/1000。

7.6 西尼羅病毒

西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）可引起西尼羅熱，前膜蛋白prM 和包膜蛋白E 是病毒表面的糖蛋白，可在病毒表面形成異二聚體，將其接種動(dòng)物可產(chǎn)生較好的抵抗力[57]。Wang 等[58]人工合成 prM/E 基因，插入 pLaSota 得 pLa-prM/E，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BHK-21 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-prM/E表達(dá)的25 kD的prM蛋白和45kD的E蛋白；將 2×109EID50疫苗肌肉注射接種兒馬，初次接種后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后5 周提示免疫組血清IgG 和中和抗體上升；隨后將2×108EID50疫苗肌肉注射或1×1010EID50疫苗口服接種4 周齡仔雞或幼鵝，初次接種后3 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后5 周提示免疫組血清IgG 和中和抗體顯著上升。

7.7 鵝細(xì)小病毒

鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）可引起幼鵝瘟，將核殼蛋白VP3 接種幼鵝可產(chǎn)生保護(hù)性抗體[59]。Wang 等[60]以鵝細(xì)小病毒 GD01 株為模板擴(kuò)增 VP3 基因，插入 pCI-MNA-1 得 pCI-VP3，將其導(dǎo)入新城疫病毒pLaSota 株后再轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞，篩選重組病毒，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-VP3 表達(dá)的 70 kD的 VP3。將 106EID50疫苗皮下注射4 d 齡幼鵝，初次接種后2 周進(jìn)行加強(qiáng)，提示免疫組血清中和抗體在初次接種后3～12 周上升，初次接種后6 周上升到較高程度。

7.8 豬圓環(huán)病毒Ⅱ型

豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus type 2，PCV2）可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，ORF2編碼的衣殼蛋白Cap 可自身聚合為病毒樣顆粒，將其接種仔豬可產(chǎn)生有效的抵抗力[61]。Cap△41 是刪除NLS 序列的Cap 基因，王子龍等[62]以豬圓環(huán)病毒Ⅱ型 G 株為模板，擴(kuò)增 Cap/Cap△41 基因，插入pBRN-FL 得 pBRN-Cap/Cap△41，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從rNDV-Cap/Cap△41 提取的 DNA 為模板，采用 PCR 可克隆出 750 bp的 Cap 基因片段和 600 bp的 Cap△41 基因片段，共聚焦顯微鏡顯示rNDV-Cap/Cap△41 感染的細(xì)胞中存在 NDV 蛋白及 PCV2的 Cap、Cap△41 蛋白，其中Cap 蛋白位于胞核，而Cap△41 位于胞漿中。

7.9 傳染性喉氣管炎病毒

傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）可引起傳染性喉氣管炎，糖蛋白gB 與病毒吸附和進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)，是一種保護(hù)性抗原分子[63]。孫娜娜等[64]以傳染性喉氣管炎病毒LJS09 株的DNA為模板擴(kuò)增gB 基因，插入pBR-FL 得pBR-gB，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSR-T7/5 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從rNDV-gB 抽提的總 RNA 為模板，采用 RT-PCR 方法可克隆出1323 bp的gB 基因片段，Western 印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-gB 表達(dá)的gB 抗原。

8 重組新城疫病毒抗細(xì)菌

8.1 雞毒支原體

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）可引起雞呼吸道感染。TM1 基因編碼一種29 kD的蛋白，將其免疫仔雞可誘導(dǎo)一定的保護(hù)力[65]。馮秋霞等[66]以雞毒支原體的基因組DNA 為模板擴(kuò)增 TM1 基因，插入 pBRN-FL 得 pBRN-TM1，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞，篩選重組病毒，以從rNDV-TM1 提取的總RNA 為模板，采用PT-PCR方法可克隆出1960 bp的TM1 基因片段；將106ELD50疫苗點(diǎn)眼滴鼻接種6 d 齡仔雞，提示免疫組血清IgG 在接種后1～3 周上升，接種后3 周上升到較高程度；在接種后3 周用5×108CFU 雞毒支原體有毒株進(jìn)行氣管內(nèi)注射攻擊，攻擊后2 周免疫組和對(duì)照組的保護(hù)力分別為90%（9/10）和0（0/10）。

8.2 博氏疏螺旋體

博氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）可引起萊姆病。基礎(chǔ)膜蛋白BmpA 是一種外膜蛋白，與萊姆病的關(guān)節(jié)炎發(fā)生密切相關(guān)[67]。Xiao 等[68]以博氏疏螺旋體的基因組DNA 為模板擴(kuò)增BmpA 基因，與組織纖溶酶原激活物（tpA）基因融合后，插入pLaSota 得pLa-tpA-BmpA，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3，篩選重組病毒，Western印跡發(fā)現(xiàn)感染血清可結(jié)合rNDV-tpA-BmpA 表達(dá)的 42 kD的 BmpA 蛋白；將 106PFU 疫苗滴鼻接種倉鼠，初次接種后2 周進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后3 周提示免疫組血清IgG 上升，此時(shí)腹腔注射108CFU班氏疏螺旋體進(jìn)行攻擊，攻擊后12 d 取關(guān)節(jié)、心和膀胱組織，熒光定量PCR 檢查細(xì)菌負(fù)荷，發(fā)現(xiàn)免疫組的關(guān)節(jié)細(xì)菌負(fù)荷明顯減少，膀胱細(xì)菌負(fù)荷輕微降低，心臟細(xì)菌負(fù)荷則無明顯變化。

9 結(jié)語

新城疫病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能已研究得比較清楚，血清型僅有1 個(gè)，遺傳性狀比較穩(wěn)定，毒株重組和毒力返強(qiáng)的機(jī)會(huì)微乎其微，而且其復(fù)制過程僅在胞質(zhì)中完成，沒有DNA 階段，肯定不能與宿主細(xì)胞的DNA 發(fā)生結(jié)合；新城疫病毒能容納附加的RNA 節(jié)段，可作為載體向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸靶抗原，可能得到免疫預(yù)防的理想效果；新城疫病毒僅編碼8 種內(nèi)在蛋白，明顯減少了內(nèi)在蛋白與目的蛋白競(jìng)爭(zhēng)免疫顯性表位的可能性；新城疫病毒的基因組可以插入大于4 kb的外源基因，能夠穩(wěn)定表達(dá)，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生體液免疫、局部黏膜免疫及細(xì)胞免疫；新城疫病毒僅感染禽類，人體不會(huì)存在抗NDV的抗體；重組新城疫病毒可通過飲水、噴霧、滴鼻、點(diǎn)眼或注射多種途徑接種，方便高效，簡(jiǎn)單易行；重組新城疫病毒對(duì)呼吸道具有親嗜性，插入的目的基因通常不改變新城疫病毒的復(fù)制、致病性和嗜向性；重組新城疫病毒對(duì)基因交換具有抵抗性，可在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作；重組新城疫病毒在細(xì)胞或雞胚經(jīng)過多次傳代仍可高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因，而且具有高效價(jià)的雞胚生長(zhǎng)特性，生產(chǎn)成本較低；新城疫病毒的基因組僅有1 個(gè)啟動(dòng)子，基因間隔序列可降低其轉(zhuǎn)錄水平，所以插入位點(diǎn)的選擇對(duì)于重組病毒的復(fù)制以及外源基因的表達(dá)十分關(guān)鍵；新城疫病毒的基因組含有6 個(gè)轉(zhuǎn)錄單位NP、P、M、F、HN、L，目的基因插入位點(diǎn)愈靠近3'端，表達(dá)水平愈高。

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，必將推動(dòng)病毒或細(xì)菌的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，這對(duì)于闡明病毒或細(xì)菌蛋白的抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，篩選新的抗原分子，構(gòu)建由各期抗原分子組成的多期多價(jià)疫苗具有重要指導(dǎo)意義，有必要研究這些疫苗的免疫原性、轉(zhuǎn)化效率、MHC 限制性以及能否長(zhǎng)期在宿主體內(nèi)表達(dá)。在重組新城疫病毒的構(gòu)建過程中，要深入了解各個(gè)啟動(dòng)子的特性，啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控關(guān)系，分析外源基因的特點(diǎn)，完善重組病毒的構(gòu)建平臺(tái)，提高外源基因的表達(dá)量，增強(qiáng)免疫原性的穩(wěn)定性；研制新型佐劑、疫苗載體和制備融合抗原，提高疫苗的免疫原性；積極探索重組新城疫病毒的免疫劑量、免疫次數(shù)、免疫間隔時(shí)間和免疫途徑等。期待這些焦點(diǎn)的闡明將重組新城疫病毒疫苗的研究帶入一個(gè)新時(shí)代。