NGAL在腸道炎癥中作用的研究進(jìn)展

劉 文 綜述，仝巧云 審校

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌 443000)

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)又稱脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(lipocalin,lcn-2)、噬鐵蛋白、24P3，是最早發(fā)現(xiàn)于中性粒細(xì)胞的一種分泌性蛋白，為lipocalin家族成員之一。在體內(nèi)廣泛參與炎癥及免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤形成及侵襲轉(zhuǎn)移等生理病理過程。NGAL主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，在結(jié)腸、胃、腎臟、肝臟等組織中也有少量表達(dá)，當(dāng)組織炎癥或上皮細(xì)胞損傷時(shí)，NGAL的表達(dá)明顯升高。本文探討NGAL在腸道炎癥及腫瘤發(fā)生中的作用，為這些疾病的治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 NGAL的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

NGAL是由178個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小分子急性期糖蛋白，以單體、同源二聚體及與基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)共價(jià)結(jié)合的異源二聚體3種分子形式存在。免疫細(xì)胞主要分泌二聚體NGAL，而上皮細(xì)胞只分泌單聚體NGAL，決定NGAL形態(tài)的分子機(jī)制尚不清楚。據(jù)推測，NGAL在中性粒細(xì)胞中長期儲(chǔ)存形成二聚體，而上皮來源的NGAL分泌速度相對較快則主要由單體組成[1]。與lipocalin家族成員相似，NGAL蛋白多肽鏈的N-末端為310螺旋，C-末端為α-螺旋，中間為八段反平行式β-折疊構(gòu)成的β折疊桶，β折疊桶一端開放，提供與配體結(jié)合的進(jìn)口，另一端被310螺旋封閉，桶底部內(nèi)側(cè)是由疏水性氨基酸殘基排列形成的親脂性結(jié)合位點(diǎn)，可運(yùn)載固醇類、血小板活化因子、白三稀和脂多糖等介導(dǎo)炎性反應(yīng)的親脂性小分子。但NGAL的β折疊桶更大、更開放，與配體的結(jié)合腔更淺，使其更易于與大分子配體特異性結(jié)合，從而較好地發(fā)揮其生物學(xué)功能。

MMP9在炎癥性腸病中高表達(dá)[2]，通過促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放及炎癥細(xì)胞的聚集加速炎癥的進(jìn)展，最終造成廣泛的組織損傷。在腫瘤組織中,MMP9介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的浸潤，與腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力密切相關(guān)[3-4]。NGAL的β折疊桶封閉端的游離巰基，可與MMP9通過二巰鍵結(jié)合，促進(jìn)pro-MMP9的活化，阻止MMP9的內(nèi)源性降解，減慢基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)對MMP9的失活作用，從而延長MMP9的活性[2]，并由此參與腸道炎癥及腫瘤的進(jìn)展。

NGAL是天然抗菌免疫的重要組成部分，它可與細(xì)菌分泌的鐵載體結(jié)合形成NGAL-鐵載體-鐵復(fù)合物，阻止細(xì)菌從周圍環(huán)境中獲取鐵，抑制細(xì)菌生長。當(dāng)組織炎癥時(shí)，大腸桿菌增加鐵載體產(chǎn)量以滿足其對鐵的需求，同時(shí)中性粒細(xì)胞大量分泌NGAL以隔離和中和鐵載體[5]。與野生組小鼠相比，NGAL缺乏的小鼠對細(xì)菌感染更為敏感，感染大腸桿菌后表現(xiàn)出更高的病死率。因此，組織炎癥中NGAL誘導(dǎo)的低鐵反應(yīng)可被看作是對感染的原始保護(hù)[6]。此外，NGAL可以和其受體NGALR結(jié)合將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)成一條新的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，細(xì)胞外的低鐵環(huán)境可通過減少氧自由基的產(chǎn)生來減輕氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷。

除了限制腸道細(xì)菌對鐵的利用而起抗炎作用外，NGAL對黏膜損傷也具有細(xì)胞保護(hù)作用，當(dāng)腸道上皮細(xì)胞受損傷時(shí)，NGAL可促進(jìn)存活的上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞向損傷后的裸露區(qū)域遷移，重建上皮完整性；其再生上皮細(xì)胞、隱窩細(xì)胞中NGAL的免疫反應(yīng)活性和mRNA信號(hào)均顯著增加[7]。同時(shí)，NGAL也可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的細(xì)菌吞噬作用，與白細(xì)胞介素-10(IL-10)缺失小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞相比，在NGAL/IL-10雙缺失的巨噬細(xì)胞中自噬蛋白LC3-Ⅱ的形成明顯減少，重組NGAL可恢復(fù)LC3-Ⅱ的形成，從而改善巨噬細(xì)胞細(xì)菌吞噬功能；在大腸桿菌感染后的NGAL/IL-10雙缺陷小鼠模型中，分泌NGAL的巨噬細(xì)胞的植入可減輕結(jié)腸炎[8]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)是腫瘤微環(huán)境中的重要鐵源，NGAL作為腫瘤微環(huán)境中主要的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在TAM調(diào)控的腫瘤鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。TAM具有較強(qiáng)的吞噬活性，可以有效地回收鐵并與TAM合成的NGAL結(jié)合主動(dòng)釋放到腫瘤微環(huán)境中，增加腫瘤微環(huán)境中鐵的可用性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移，NGAL缺陷型TAM胞內(nèi)含鐵量顯著增加，腫瘤微環(huán)境中含鐵量減少[9]。NGAL對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性具有雙向調(diào)節(jié)作用，取決于NGAL的載鐵狀態(tài)，鐵負(fù)載的NGAL通過NGALR將鐵跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，胞內(nèi)鐵濃度的增加可抑制凋亡通路中Bim蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞瘤2基因(Bcl-2)合成增加，最終抑制細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路和抑制細(xì)胞的凋亡；無鐵NGAL可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)鐵流出進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[10-11]，NGAL對鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的介導(dǎo)使其可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

NGAL也可與其受體NGALR結(jié)合誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1和ERK2信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞遷移、黏附[12]。研究發(fā)現(xiàn)從NGAL缺陷小鼠中提取的中性粒細(xì)胞不能滲入感染部位，不能吞噬和殺滅細(xì)菌，且中性粒細(xì)胞的趨化性和黏附性也明顯減弱[13]。有體外證據(jù)表明NGAL能以不依賴鐵的方式增加CD4+T淋巴細(xì)胞上人白細(xì)胞抗原G的表達(dá)，而鐵結(jié)合的NGAL也可激活CD4+/ FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，提示其參與細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫[14]。

2 NGAL的分子誘導(dǎo)與表達(dá)調(diào)節(jié)

2.1NGAL與核因子-κB(NF-κB) NGAL啟動(dòng)子區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、STAT1、STAT3的結(jié)合位點(diǎn)，腸道炎癥時(shí)，NF-κB通過激活NGAL的基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)血清NGAL水平來維持正常腸黏膜穩(wěn)態(tài)及對機(jī)體的免疫應(yīng)答，IL-1可通過激活NF-κB促進(jìn)NGAL的表達(dá)[15]；NGAL也可通過負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)NF-κB和STAT3通路的激活，減少NF-κB抑制蛋白α(IκBα )降解和STAT3磷酸化來發(fā)揮抗炎效應(yīng)。在小鼠巨噬細(xì)胞中，NGAL缺乏導(dǎo)致脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的NF-κB、STAT3炎癥信號(hào)通路的激活增加，并加劇LPS引起的促炎標(biāo)志物CD11c、IL-6和NOS的表達(dá)，但在無LPS刺激的條件下將重組NGAL導(dǎo)入巨噬細(xì)胞時(shí)，NGAL對NF-κB、STAT3信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化沒有影響，表明NGAL本身不是促炎因子，而是在促炎刺激存在時(shí)發(fā)揮抗炎作用[16]。

2.2NGAL與TH17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子 TH17細(xì)胞作為一種CD4輔助性T細(xì)胞，可分泌IL-17、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子，在維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)及抵御外源性病原體感染中發(fā)揮重要作用[17]。研究表明，IL-22和IL-17A共同刺激可顯著誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞NGAL mRNA的表達(dá)，且腫瘤壞死因子α(TNF-α)可進(jìn)一步放大這種效應(yīng)，使NGAL有希望成為判斷抗TNF-α抗體治療炎癥性腸病(IBD)的療效的候選標(biāo)記物[18]。此外，IL-23/IL-17軸可通過誘導(dǎo)炎癥部位對中性粒細(xì)胞的招募，進(jìn)而促進(jìn)NGAL在炎癥部位的分泌，增強(qiáng)抗菌及免疫調(diào)節(jié)作用。NGAL的表達(dá)受IL-23R基因型的調(diào)控，當(dāng)增加IL-23R突變基因時(shí)，血清NGAL濃度呈明顯下降趨勢，但在用抗IL-23R抗體治療IBD小鼠模型后，NGAL水平逐漸恢復(fù)到初始水平，表明基因受損的IL-23軸阻礙了NGAL的正常上調(diào)[18]。

3 NGAL與腸道炎癥相關(guān)性疾病

3.1NGAL與IBD 黏膜免疫、腸道微生態(tài)和宿主易感性在IBD的發(fā)病中起重要作用?；蛭㈥嚵蟹治鲲@示NGAL基因是潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者結(jié)腸黏膜中表達(dá)最豐富的基因之一,也是UC的易感基因；在腸上皮細(xì)胞和腸黏膜的中性粒細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)NGAL蛋白，而mRNA的合成僅位于上皮細(xì)胞，提示結(jié)腸黏膜中性粒細(xì)胞中的NGAL是由骨髓中未成熟的中性粒細(xì)胞前體合成并在炎癥部位釋放；而腸上皮細(xì)胞則參與大量NGAL的從頭合成，使上皮細(xì)胞作為黏膜防御的一部分直接參與炎癥過程的調(diào)節(jié)[19]。在小鼠模型中，NGAL的缺失導(dǎo)致結(jié)腸細(xì)菌黏附蛋白表達(dá)上調(diào)；糞便細(xì)菌數(shù)量較前增加3倍，以在IBD更為普遍的擬桿菌屬及腸桿菌屬居多；且NGAL表達(dá)缺陷的小鼠結(jié)腸炎癥及便血較野生型更顯著[20]。將鼠NGAL導(dǎo)入乳酸菌中產(chǎn)生大量表達(dá)NGAL的乳酸菌，在體外環(huán)境中，其對異常pH、高濃度膽汁酸、氧化應(yīng)激的耐受性增強(qiáng)；而小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)NGAL的乳酸桿菌可以抑制大腸桿菌的生長、降低腸桿菌素的生物活性，并顯示出更好的腸道黏膜保護(hù)作用，這一結(jié)論表明益生菌產(chǎn)生和分泌NGAL的基因修飾可提高益生菌在治療結(jié)腸炎方面的穩(wěn)定性、有效性[21]。

NGAL目前也被認(rèn)為是IBD診斷和活動(dòng)性監(jiān)測的潛在標(biāo)記物。少數(shù)臨床研究表明，與健康對照或IBS患者相比，IBD患者的腸黏膜、糞便、血清中NGAL明顯升高[22-23]，且腸黏膜及糞便中NGAL濃度與臨床表現(xiàn)活動(dòng)性及內(nèi)鏡下病變活動(dòng)性具有明顯的相關(guān)性[24]，敏感性、特異性優(yōu)于C反應(yīng)蛋白(CRP)及紅細(xì)胞沉降率(ESR)；在克羅思病(CD)中，結(jié)腸型患者糞便NGAL水平顯著高于小腸型患者；在UC中，全結(jié)腸炎較直腸炎患者糞便NGAL明顯升高[22]。缺鐵性貧血是IBD常見并發(fā)癥，盡管靜脈補(bǔ)鐵，但在10個(gè)月內(nèi)超過50%的患者會(huì)復(fù)發(fā)[25]，有研究發(fā)現(xiàn)UC和CD中NGAL與鐵濃度之間存在顯著負(fù)相關(guān)性，一方面與IBD患者長時(shí)間的血液損失有關(guān)，另一方面與長期潛在的亞臨床炎癥引起IL-6、TNF-α等炎癥因子上調(diào)，造成NGAL合成增多導(dǎo)致鐵螯合作用加強(qiáng)有關(guān)[24]，因此NGAL可能是診斷炎癥相關(guān)性貧血患者缺鐵與否更可靠的潛在標(biāo)志。

3.2NGAL與腸道腫瘤 慢性炎癥是腸道腫瘤發(fā)病的重要機(jī)制之一，結(jié)腸炎相關(guān)癌癥(CAC)的風(fēng)險(xiǎn)隨病程增加而增加，與炎癥的嚴(yán)重程度正相關(guān)。因此，明確腫瘤相關(guān)性炎癥在結(jié)直腸癌(CRC)中的作用及調(diào)控具有重要意義。大量研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸炎、癌前病變和惡性腫瘤中，結(jié)腸上皮細(xì)胞均可見NGAL的高表達(dá),而正常結(jié)腸組織幾乎不表達(dá)NGAL[22，26]。但關(guān)于NGAL與腸道腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，目前持兩種觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，NGAL與腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。KIM等[27]通過免疫印跡法檢測NGAL，也證實(shí)了NGAL在CRC細(xì)胞中的高表達(dá)；敲除NGAL基因，可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和從上皮到間充質(zhì)狀態(tài)的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變；此外，CRC細(xì)胞中NGAL的下調(diào)也增加了細(xì)胞遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)了大量葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)生，伴隨著能量代謝相關(guān)基因的增加。因此，NGAL對CRC細(xì)胞的增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量代謝具有負(fù)調(diào)控作用，可能是CRC中潛在的轉(zhuǎn)移抑制因子和治療靶點(diǎn)。這一結(jié)論與文獻(xiàn)[28]的研究結(jié)果相符，他們發(fā)現(xiàn)NGAL/IL-10雙缺陷小鼠的腸道所有黏液層完全喪失，黏膜屏障惡化，附著于腸上皮細(xì)胞和隱窩的細(xì)菌大量入侵，并以IL6-STAT3依賴的方式促進(jìn)腸道炎癥-異型增生-腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而NGAL可防止結(jié)腸炎因IL-10缺乏引起的右側(cè)結(jié)腸腫瘤的自發(fā)形成，其機(jī)制與微生物菌群的改變有關(guān)。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，NGAL促進(jìn)腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移。多種腫瘤中NGAL可與MMP9形成復(fù)合物，阻止MMP9的降解。MMP9不僅可以直接降解基底膜和基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，同時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)釋放血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，促進(jìn)腫瘤血管形成、浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[29-30]。HU等[31]發(fā)現(xiàn)在人結(jié)腸癌細(xì)胞中，NGAL過表達(dá)通過Racl、E-cadherin和catenins的異位，導(dǎo)致癌細(xì)胞的骨架系統(tǒng)重組，減低細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附，增加細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附，進(jìn)而提高癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

NGAL在不同腫瘤細(xì)胞中功能的差異,可能與腫瘤細(xì)胞的類型不同有關(guān)，仍需進(jìn)一步大樣本、更深入的研究。

綜上所述，NGAL與腸道炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但目前對于NGAL在腸道炎癥及腫瘤方面的具體作用及機(jī)制尚有很多不同的觀點(diǎn)。所以，有必要對其展開更加深入的研究，這不僅有利于在基因分子水平上深化NGAL對腸道炎癥及腫瘤發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)理論認(rèn)識(shí)，更有利于推進(jìn)NGAL在IBD及腸道腫瘤中的臨床應(yīng)用。