細(xì)胞焦亡與肝臟缺血再灌注損傷

王小瑩 綜述，申麗娟△，劉作金 審校

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,昆明 650000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科,重慶 400010)

肝臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是臨床上常發(fā)生于肝葉切除術(shù)、肝移植術(shù)中因肝門阻斷及其他各種因素引起的低血容量休克后的一種常見的病理生理過(guò)程，缺血再灌注不僅不能使肝功能得以恢復(fù)，反而會(huì)導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)受損、肝功能損傷。長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)IRI的機(jī)制進(jìn)行研究，希望通過(guò)對(duì)機(jī)制的了解對(duì)IRI的過(guò)程進(jìn)行干預(yù)，以提高肝臟對(duì)缺血缺氧過(guò)程的耐受性，從而減輕肝組織的損傷[1-2]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞焦亡及其相關(guān)途徑被證實(shí)存在于IRI的過(guò)程中，并通過(guò)對(duì)細(xì)胞焦亡途徑的干預(yù)，可減輕IRI的程度。

1 細(xì)胞焦亡

1.1細(xì)胞焦亡 是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的形態(tài)學(xué)上與凋亡相似，伴隨炎性反應(yīng)發(fā)生的細(xì)胞程序性死亡。大量炎性因子伴隨Caspase-1的活化而釋放為其特征性反應(yīng)。此過(guò)程趨化周圍巨噬細(xì)胞，并誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，由Caspase-1激活誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是由一系列能形成炎性因子的模式識(shí)別受體所觸發(fā)。細(xì)胞受到內(nèi)源性或外源性損傷時(shí)會(huì)釋放與人體自身免疫細(xì)胞通過(guò)一定數(shù)目的細(xì)菌編碼的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)與識(shí)別自身的危險(xiǎn)信號(hào)的損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)相結(jié)合。根據(jù)亞細(xì)胞定位，PRRs可分為兩類：位于質(zhì)膜上的跨膜蛋白Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)和C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)；位于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，包括：RIG樣受體(RIG-like receptor，RIR),AIM2樣受體(AIM2-like receptor，ALR),核苷酸結(jié)合區(qū)和富含亮氨酸的重復(fù)序列(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing，NLR)蛋白。NLRs和ALRs的亞群通過(guò)識(shí)別同源配體與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)結(jié)合，觸發(fā)一種防御機(jī)制，其中炎性因子在胞質(zhì)中趨化聚集以激活促炎性Caspase-1，而Caspase-1的活化，一方面對(duì)白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18進(jìn)行激活，Caspase-1通過(guò)切割I(lǐng)L-1β和IL-18前體的方式，促進(jìn)其成熟與釋放；另一方面因其在急慢性炎性反應(yīng)該過(guò)程中使機(jī)體對(duì)感染和損傷產(chǎn)生全身或局部的反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生[3-4]。

1.2細(xì)胞焦亡的途徑 在哺乳動(dòng)物中，NLRs與ALRs對(duì)應(yīng)的炎性因子主要包括Nlrpb1、Nlrp3、Nlcr4和AIM2，當(dāng)細(xì)胞受到外源性或內(nèi)源性損傷時(shí)會(huì)釋放大量活性氧(reactive oxy gen species,ROS)物質(zhì)，與特定模式識(shí)別受體結(jié)合并將其激活是活化這類炎性因子的關(guān)鍵。細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑就是這種依賴激活劑活化的炎性因子將Caspase-1活化而引起下游IL-1β與IL-18的成熟與釋放的途徑[5]。而細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑則與之相反，Caspase-11(在人類為Caspase4/5)的活化并不依賴炎性激活劑。IL-1β和IL-18的成熟與釋放同樣可由Caspase-11的活化誘發(fā)，從而引起細(xì)胞焦亡。研究發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性菌表面脂多糖成分為Caspase-11的天然受體，而脂多糖(LPS)與Caspase-11相結(jié)合并將其激活是啟動(dòng)這一途徑的必要條件。因細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑在膿毒血癥、內(nèi)毒素血癥等感染性疾病病程中發(fā)揮了重要作用，近年來(lái)逐漸受到重視[6]。

2 IRI

2.1概念 IRI是臨床常見的并發(fā)癥，常發(fā)生于肝葉切除手術(shù)，肝移植中因肝門阻斷及其他因素引起的低血容量性休克后，導(dǎo)致局部和遠(yuǎn)端細(xì)胞損傷和器官功能障礙。目前研究認(rèn)為，IRI的機(jī)制主要包括：鈣穩(wěn)態(tài)的失調(diào)，活性氧和氮的生成，機(jī)體微環(huán)境的改變，Kupffer細(xì)胞的活化，補(bǔ)體的活化。這些機(jī)制均可導(dǎo)致各類損傷相關(guān)模式途徑的激活，從而造成肝臟組織及功能的損傷[1]。其中，已被證實(shí)Kupffer細(xì)胞的激活可引起IRI。Kupffer細(xì)胞可被活性氧、鈣離子及革蘭陰性菌表面的LPS激活，目前已知最強(qiáng)的激活物即為L(zhǎng)PS[7-8]。而在肝臟缺血再灌注的過(guò)程中，由于腸系膜上靜脈淤血造成的腸道屏障功能受損，再灌注時(shí)，腸道內(nèi)細(xì)菌移位入肝，革蘭陰性菌表面的LPS此時(shí)便可作為Kupffer細(xì)胞的激活物在IRI過(guò)程中發(fā)揮作用。Kupffer細(xì)胞激活后會(huì)產(chǎn)生大量的炎性因子如IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、核因子(NF)-κB等，炎性因子可活化肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞使其產(chǎn)生活性氧物質(zhì)及表達(dá)黏附因子，使白細(xì)胞、血小板黏附聚集，使得微循環(huán)障礙發(fā)生。同時(shí)，這些炎性因子還可激活自然殺傷性T淋巴細(xì)胞(natural killer T cells，NKT)、中性粒細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞，造成肝組織損傷，肝細(xì)胞死亡[9-10]。

2.2IRI過(guò)程中與細(xì)胞焦亡相關(guān)的炎性因子

2.2.1NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體 是NLR家族中一種炎性蛋白，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過(guò)程，尤其在細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑中發(fā)揮著重要作用。ASC和Caspase蛋白酶是其標(biāo)志性組成結(jié)構(gòu)，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，PRRs通過(guò)與ASC結(jié)合而將NLRP3激活，使其發(fā)揮Caspase蛋白酶作用活化Caspase-1，由此啟動(dòng)了細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑[11-13]。在炎性反應(yīng)對(duì)IRI中作用的研究表明，在IRI模型中，NLRP3缺陷小鼠明顯表現(xiàn)出較少的中性粒細(xì)胞遷移和組織損傷，肝功能得到一定的保護(hù)[14]。

2.2.2Caspase-1與Caspase-11 Caspase是一個(gè)高度保守的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族?？煞譃閰⑴c并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的凋亡Caspase，包括：Caspase-2、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10；以及不參與細(xì)胞凋亡而是對(duì)IL-1β前體有切割而使其活化成熟作用的炎性Caspase，包括：Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11。因此，參與到細(xì)胞焦亡這一過(guò)程中的主要是Caspase-1與Caspase-11(人類為Caspase-4/5)[15-16]。

Caspase-1是細(xì)胞焦亡途徑中的特征性活化因子。在IRI過(guò)程中，Caspase-1因活化的NLRP3發(fā)揮蛋白酶作用切割其前體將其活化，從而誘發(fā)IL-1β及IL-18的成熟與釋放，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生。HUSTED等[17]也研究證實(shí)，IRI過(guò)程與Caspase-1介導(dǎo)引起IL-1β、IL-18成熟釋放的細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑有關(guān)。

Caspase-11是IRI過(guò)程中細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑的重要啟動(dòng)因子[12，18-19]。KAYAGAKI等[20]發(fā)現(xiàn)，存在一種依賴于Caspase-11活化NLRP3而使IL-1β釋放引起的細(xì)胞焦亡。后被稱為細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑，Caspase-11被稱為非經(jīng)典炎性體。在細(xì)胞核內(nèi)，LPS主要通過(guò)TLR通路激活肝臟固有Kupffer細(xì)胞，TLRs被激活后，經(jīng)MyD88及其下游信號(hào)分子活化NF-κB，研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-11基因的5′端上游啟動(dòng)子區(qū)域有多個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。活化的NF-κB 可進(jìn)入核內(nèi)與Caspase-11基因上游的啟動(dòng)子結(jié)合，使Caspase-11轉(zhuǎn)錄增加[21-22]。另一方面，在細(xì)胞質(zhì)，LPS通過(guò)內(nèi)吞形式入胞，與Caspase-11直接結(jié)合并將其激活[23]。在內(nèi)毒素模型中，Caspase-11-/-的小鼠被證明比野生型小鼠存活率高[24]。在肝臟缺血再灌注的過(guò)程中存在一種有別于其他臟器缺血再灌注損傷的情況：肝門的阻斷造成門靜脈高壓，腸系膜上靜脈淤血，腸壁血管通透性上升，黏膜屏障功能受損，再灌注時(shí)腸道菌移位入血，經(jīng)門靜脈入肝，造成內(nèi)毒素血癥對(duì)肝臟造成損傷。而腸道革蘭陰性菌胞壁LPS成分就成了活化Caspase-11，啟動(dòng)IRI途徑中細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑的激動(dòng)劑[25-26]。

2.2.3IL-1β與IL-18 是單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞在應(yīng)答內(nèi)外源性損傷時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是細(xì)胞焦亡途徑中最終活化并釋放的特征性炎性因子。在IRI的過(guò)程中，前體pro-IL-1β和pro-IL-18經(jīng)上游Caspase-1剪切并活化。活化后的IL-1β與IL-18可激活中性粒細(xì)胞、NKT細(xì)胞等免疫細(xì)胞，引發(fā)炎性反應(yīng)，造成肝細(xì)胞損傷、死亡[27- 28]。

3 目前與細(xì)胞焦亡相關(guān)IRI的保護(hù)措施

IRI是目前臨床上肝葉切除、肝移植等手術(shù)中最常見的并發(fā)癥，其直接影響到手術(shù)治療效果及術(shù)后患者的生存情況，甚至可以引起其他臟器的損傷[29]。Kupffer細(xì)胞的活化被證明對(duì)IRI起到了啟動(dòng)作用，因其活化引發(fā)的一系列炎性因子釋放，形成了啟動(dòng)IRI中細(xì)胞焦亡途徑的必要條件[28]。已知的最強(qiáng)Kupffer細(xì)胞激活物為L(zhǎng)PS。目前將IRI分為兩相，Ⅰ相損傷由Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)為主，而Ⅱ相損傷以中性粒細(xì)胞介導(dǎo)為主。Ⅰ相損傷是因Kupffer細(xì)胞激活釋放大量活性氧及細(xì)胞炎性因子造成的肝細(xì)胞急性損傷。Ⅱ相損傷發(fā)生于Ⅰ相損傷之后，是由于炎性因子的活化釋放激活了炎性反應(yīng)通路，大量活化的中性粒細(xì)胞在肝臟內(nèi)聚集、黏附，不但能通過(guò)釋放氧自由基、蛋白酶等對(duì)肝臟造成損害，其聚集、黏附還可因阻塞肝竇造成肝竇狹窄，加重肝臟微循環(huán)障礙，引起肝細(xì)胞損害甚至損傷肝功能[30]。目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)抗細(xì)胞焦亡的特異性藥物，因此，通過(guò)抑制Kupffer細(xì)胞或抑制其釋放的炎性因子，以阻止其向Ⅱ相損傷轉(zhuǎn)化成為目前研究的熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，Kupffer細(xì)胞能被其特異性抑制劑三氯化釓(GdCl3)抑制其活化，從而降低包括NLRP3、Caspase-1在內(nèi)的炎性因子的表達(dá)，使得IRI減輕[31]。另外在臨床上，麻醉藥的預(yù)處理及缺血后處理已被證實(shí)對(duì)手術(shù)引起的缺血再灌注損傷有確切的保護(hù)作用。尤其是如異氟醚、七氟醚等鹵代類吸入麻醉藥，可通過(guò)抑制Caspase-1、Caspase-11及IL-1β的活化表達(dá)對(duì)IRI起保護(hù)作用，并且其起到的保護(hù)作用明顯優(yōu)于常用靜脈麻醉藥物[32]。因此，制訂相關(guān)手術(shù)麻醉方案時(shí)，選擇鹵代類吸入麻醉藥作為圍術(shù)期用藥對(duì)肝功能進(jìn)行保護(hù)已在臨床上達(dá)成共識(shí)。

綜上所述，IRI過(guò)程中通過(guò)激活炎性因子引起細(xì)胞焦亡，炎性因子作為將肝臟缺血再灌注與細(xì)胞焦亡連接起來(lái)的橋梁，若可抑制其活化，無(wú)疑可阻斷細(xì)胞焦亡這一通路，從而減輕IRI。因此，對(duì)細(xì)胞焦亡通路的干預(yù)調(diào)控和針對(duì)炎性因子的靶向抑制將可能為減輕IRI提供新的治療方法。