高效液相色譜電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗壞血酸的效果研究

朱碧寧

(陽江職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 陽江 529566)

引 言

抗壞血酸又稱為維生素C是一種已糖醛基酸，廣泛地存在于植物的組織中?？箟难嵋彩且环N含有六個(gè)碳原子的酸性的多羥基化合物，具有很強(qiáng)的還原性，極易被氧化，被廣泛地運(yùn)用于藥物、臨床治療、食品以及人體中，是人體中最不可缺少的一種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)?？箟难釁⑴c了人體內(nèi)的一系列的代謝及其相關(guān)的反應(yīng)，有利于刺激腎上腺激素的合成，促進(jìn)了人體的腸道內(nèi)的吸收以及解毒的作用。常用的測(cè)定的抗壞血酸的方法有很多，各種方法均具有自己的獨(dú)特之處，但是這些方法在樣品處理方面比較復(fù)雜，所以本文就在恒電流的條件下，利用不穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光的試劑直接將抗壞血酸氧化使其產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光并結(jié)合高效液相色譜法與電化學(xué)發(fā)光法，建立了高效液相色譜電化學(xué)發(fā)光法來檢測(cè)抗壞血酸。

1 高效液相色譜法以及電化學(xué)發(fā)光法的原理

第一，高效液相色譜法的原理。高效液相色譜(HPLC)法的原理就是將高壓下的液體作為流動(dòng)相，并且采用顆粒極其細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。高效液相色譜法具體的分為分析以及分離[1]。高效液相色譜法的分析原理：高效液相色譜法的分析是利用泵將相關(guān)的溶劑吸入到色譜系統(tǒng)中將溶劑吸入進(jìn)去之后，再將溶劑輸出來，經(jīng)過相關(guān)的測(cè)量之后，再通過色譜注，進(jìn)行完分離之后，再次進(jìn)入到檢測(cè)器，進(jìn)行相關(guān)的信息采集以及處理，并同時(shí)記錄下。如果遇到了比較復(fù)雜的混合物(極性范圍比較寬的)那么就可以采用梯度控制器作為梯度來洗脫[2]。高效液相色譜法的分離原理：高效液相色譜法的分離，是在流動(dòng)相以及固定相之間將進(jìn)入色譜柱的溶質(zhì)進(jìn)行來回交換。其主要的原理就是因?yàn)槿苜|(zhì)的不同分配系數(shù)或者是不同的分子大小，從而引起流動(dòng)相以及固定相對(duì)溶質(zhì)不同的阻力作用，這樣就使得不同的成分會(huì)因?yàn)椴煌姆峙湎禂?shù)而以不同的速度流出色譜柱。比如，假設(shè)樣品中主要含有三種不同成分，A、B以及C，這三種成分進(jìn)入了色譜柱之后(隨著流動(dòng)相進(jìn)入)，那些分配系數(shù)相對(duì)小的成分就會(huì)因?yàn)椴蝗菀妆还潭ㄏ喙潭ㄗ?，而比較早地流出了色譜柱的外面。分配系數(shù)相對(duì)較大的則會(huì)在固定相中停留時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)比較晚流出色譜柱[3]。而分配系數(shù)在兩者之間的則會(huì)第二個(gè)流出色譜柱。綜上所述，如果存在著這樣一種物質(zhì)并進(jìn)入到色譜柱中，會(huì)因?yàn)樗锩娴牟煌煞值牟煌峙湎禂?shù)，而呈現(xiàn)出不同的流動(dòng)速率。這些成分就會(huì)以先后不同的順序流出色譜柱的外面，從而就會(huì)達(dá)到分離的目的。不同的組成成分在色譜柱中的分離的情況，最主要取決于各種的成分在兩相之間的分配系數(shù)、吸附的能力以及親和力是否存在著差異，這就是熱力學(xué)平衡的問題，同時(shí)也是分離的首要條件。其次就是當(dāng)不同的組成成分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)的時(shí)候，譜帶會(huì)隨著柱長(zhǎng)而展寬，分離的情況和兩相(固定相、流動(dòng)相)之間的擴(kuò)散的系數(shù)、固定相顆粒度的大小、色譜柱的填充的情況以及與流動(dòng)相的流動(dòng)速度有關(guān)。所以分離的效果主要涉及到了熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩種方面的綜合。

第二，電化學(xué)發(fā)光法的原理。電化學(xué)發(fā)光法是一種在電極的表面因?yàn)殡娀瘜W(xué)反應(yīng)而引發(fā)的特異性的發(fā)光反應(yīng)，主要包括電化學(xué)以及化學(xué)發(fā)光兩部分。在電化學(xué)反應(yīng)的過程中，給工作電極上的陽極加上一定量的電壓，在能量的作用下，陽極上就會(huì)釋放出電子從而發(fā)生了相關(guān)的氧化反應(yīng)成為了更高價(jià)的金屬。在這個(gè)電極的表面的電子也會(huì)同時(shí)會(huì)釋放電子從而發(fā)生了相關(guān)的氧化反應(yīng)，那么這個(gè)電子就會(huì)成為一種陽離子的自由基，迅速地自發(fā)脫去一個(gè)質(zhì)子，形成另一個(gè)自由基。在整個(gè)的反應(yīng)體系中就會(huì)存在一種極具有強(qiáng)氧化性的離子，以及極具有強(qiáng)還原性的自由基。這兩者之間還會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，最后的結(jié)果就會(huì)使高價(jià)的離子被還原成激發(fā)態(tài)的低價(jià)離子，能量的來源主要是在于高價(jià)的離子以及自由基之間所能夠形成的電勢(shì)差。通過這種循環(huán)的過程，測(cè)定的信號(hào)就會(huì)不斷被放大，靈敏度也就大大提高了。

2 高效液相色譜電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗壞血酸的檢測(cè)方法

第一，儀器與試劑的選擇。TCC-UV-260紫外線可見分光光度計(jì)、LC-6A高效液相色譜儀、C18柱、SPD-6AV紫外檢測(cè)器、超微弱發(fā)光分析儀、JH2C恒電位儀、電解池、抗壞血酸溶液(0.1 g/L)/MnSO4溶液(1 mol/L)、NH4H2PO4溶液(5.0 g/L)。所有的試劑都為分析純，所有的水都是二次去離子水。

第二，樣品的測(cè)定。在選定好的電化學(xué)的發(fā)光條件以及色譜的條件下，分別對(duì)人體的血清以及尿液中的抗壞血酸進(jìn)行測(cè)定，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的流出的時(shí)間當(dāng)作是定性的依據(jù)，然后再用峰高再對(duì)抗壞血酸進(jìn)行定量檢測(cè)。取人體中的血清、尿液5 mL，分別加入到等體積30 g/L的H3PO4溶液中，當(dāng)作是VC提取劑，用來防止蛋白質(zhì)堵塞住了色譜柱，搖勻后靜置30 min，提取上層清液，將提取到的上層清液用0.45 μm的色譜過濾膜中過濾，最后再取30 μL進(jìn)樣，這樣就用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗壞血酸得到了色譜圖。

第三，流動(dòng)相的選擇。對(duì)于流動(dòng)相的選擇應(yīng)該與電化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)相適應(yīng)，所以選擇的流動(dòng)相應(yīng)該具有以下的條件：具有較好的分離的效果，而且又不能對(duì)電化學(xué)的試劑有影響(熄滅作用)。經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5 g/L的NH4H2PO4溶液對(duì)于電化學(xué)的發(fā)光并沒有任何影響，并且具有無毒、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。所以應(yīng)選擇NH4H2PO4溶液作為流動(dòng)相。

第四，流動(dòng)相流速的選擇。流速對(duì)于發(fā)光強(qiáng)度有一定影響，流速在0.5 mL/min～2 mL/min的范圍內(nèi)，電化學(xué)的發(fā)光的強(qiáng)度會(huì)隨著流速的增大而增大；但當(dāng)流速大于2 mL/min的時(shí)候。電化學(xué)的發(fā)光強(qiáng)度會(huì)隨著流速的增大而減小，在考慮到要與高效液相色譜的泵速(1 mL/min)相匹配，而流動(dòng)相的流速不一樣，對(duì)所呈現(xiàn)出的色譜峰的展寬也不一樣，所以在兼顧了靈敏度以及分離度的條件下，應(yīng)選擇1.0 mL/min的流動(dòng)相的流速。

第五，電解電流的選擇。電解電流也會(huì)對(duì)發(fā)光的強(qiáng)度有所影響，電化學(xué)的發(fā)光強(qiáng)度會(huì)隨著電解電流的增大而增大，但當(dāng)電解的電流大于10 mA的時(shí)候，電化學(xué)的發(fā)光強(qiáng)度會(huì)隨著電解的電流的增大而減小。這是因?yàn)殡姌O的表面會(huì)產(chǎn)生氣泡，從而影響穩(wěn)定性，所以應(yīng)選取電解電流應(yīng)為10 mA。

第六，實(shí)驗(yàn)的方法。在選定好的電化學(xué)發(fā)光的條件以及色譜的條件下，首先將輸液管插到相應(yīng)的各個(gè)溶液中，然后啟動(dòng)蠕動(dòng)泵、恒電流泵以及高壓泵，等到基線穩(wěn)定以后，用進(jìn)樣器提取VC標(biāo)準(zhǔn)溶液或者是樣品溶液再注入到色譜柱中[4]。最后，根據(jù)色譜柱的峰高繪制出工作的曲線或者進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)語

高效液相色譜電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗壞血酸相比較于熒光法、分光光度分析法、色譜法等等，這種方法具有穩(wěn)定性強(qiáng)、操作步驟簡(jiǎn)單、靈敏度較高、選擇性好、準(zhǔn)確性更高等優(yōu)點(diǎn)。高效液相色譜電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗壞血酸也正在被廣泛應(yīng)用，并取得了較大的進(jìn)展。