凝集素與TLRs信號通路的免疫調(diào)節(jié)作用

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(1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,黑龍江哈爾濱 150500; 2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江省普通院校微生物重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150080; 3.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院,西藏林芝 860000)

凝集素是一類能夠凝集血紅細(xì)胞且具有糖特異性的蛋白質(zhì)或糖蛋白[1]。凝集素最早是從蓖麻種子中發(fā)現(xiàn)的,后來又從動物體內(nèi)中發(fā)現(xiàn),在自然界中種類繁多、分布廣泛,微生物、動物、植物中均含有凝集素。凝集素參與生物的各種過程,包括細(xì)胞識別、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附于細(xì)胞外基質(zhì)等。凝集素按照其來源可分為植物凝集素、動物凝集素和微生物凝集素。

前期學(xué)者對植物中的凝集素研究較為深入,大多是關(guān)于豆科植物種子的報道?，F(xiàn)在越來越多的凝集素是從海洋生物中分離出來,現(xiàn)已知有300多種凝集素是從海洋生物中提取出來[2]。對這些海洋生物凝集素的研究都集中在具有生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的抗菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑、抗腫瘤劑、抗傷害感受劑和抗炎劑等方面。隨著大型真菌培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,目前,已經(jīng)從300多種大型真菌中分離提取出凝集素,并對其進(jìn)行了初步研究[3]。研究表明凝集素具有抗腫瘤[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、抗病毒[6]等生物活性。在免疫調(diào)節(jié)過程中,凝集素可以發(fā)揮重要的作用。凝集素被定性為免疫調(diào)節(jié)劑,可誘導(dǎo)某些細(xì)胞因子和反應(yīng)物的產(chǎn)生,對腫瘤或微生物的感染具有有效免疫應(yīng)答的作用[7]。大多數(shù)凝集素可以通過Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)激活巨噬細(xì)胞,刺激T細(xì)胞、B細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。TLRs是非特異性免疫中的較為重要蛋白質(zhì)分子,也是聯(lián)系特異性免疫和非特異性免疫的橋梁。TLRs在巨噬細(xì)胞識別細(xì)胞外信號中起到重要的作用。TLRs不僅可以參與非特異性免疫調(diào)節(jié),還能誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá),激活細(xì)胞信號通路。本文就TLRs的特征和凝集素對免疫調(diào)節(jié)作用的現(xiàn)狀進(jìn)行概述。

1 凝集素分離純化及生物活性概述

1.1 凝集素分離純化

研究表明,不同來源凝集素的分離純化方法存在很大的相似性。主要是通過PBS浸提、硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析,如草菇凝集素[8]、黃牛肝菌凝集素[9]、雙孢蘑菇凝集素[10]、白蕓豆凝集素[11]、菜豆凝集素[12]等;也可以通過PBS浸提、硫酸銨沉淀、離子交換層析分離純化,如苦蕎凝集素[13]、大蒜凝集素[14]等;也有少數(shù)是通過PBS浸提、親和層析直接分離純化,如貽貝凝集素[15]等。在利用親和層析純化時,需要獲悉與待分離凝集素特應(yīng)性結(jié)合的物質(zhì),配制相應(yīng)親和層析膠。在提取未知凝集素時很難確認(rèn)這種凝集素相應(yīng)的配體,因此用親和層析純化存在一定的困難,這也是很少用這種方法的原因。

凝集素分離純化后需要分析鑒定它的性質(zhì),用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)和Native-PAGE(非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測凝集素的純度和分子質(zhì)量[16];用Edman法檢測凝集素的N末端序列[17]。通過檢測分子質(zhì)量、亞基數(shù)量、等電點、N末端序列等判斷凝集素的種類及結(jié)構(gòu)特點,也可以通過傅里葉變換紅外光譜、X射線衍射等方式檢測凝集素的高級結(jié)構(gòu)[18]。結(jié)構(gòu)決定功能,凝集素的結(jié)構(gòu)與功能之間存在緊密的聯(lián)系。凝集素特殊的結(jié)構(gòu)對于識別靶細(xì)胞表面的受體有著重要的意義。大多數(shù)凝集素表面具有特異性糖結(jié)合位點,這種特性是由凝集素特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定[19]。凝集素可以凝集細(xì)胞表面的糖類物質(zhì),或者與周圍環(huán)境中的糖類物質(zhì)結(jié)合形成糖蛋白,因此凝集素主要是以蛋白質(zhì)或多糖復(fù)合物的形式存在,其多種生物活性可能與這種特性有關(guān)[1]。

1.2 凝集素生物活性

凝集素具有多種生物活性。在抗腫瘤方面,猴頭菇凝集素[20]可以抑制人乳腺癌MCF-7和人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖;巴西毛果種子凝集素[21]可以抑制肺癌A549、人卵巢癌A2780、乳腺癌MCF-7的增值;巴西利馬豆凝集素[22]可以抑制鼠黑素瘤細(xì)胞的增值。在免疫調(diào)節(jié)方面,KML是一種從Korean mistletoe中分離到的一種凝集素,它可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng),促進(jìn)多種細(xì)胞因子(IL-3、TNF-α)的表達(dá)和ROS的產(chǎn)生,可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[23];用洋蔥凝集素ACA處理RAW264.7細(xì)胞及大鼠腹腔巨噬細(xì)胞24 h,NO、IL-12和TNF-α的表達(dá)量明顯增加[24]。在抗菌方面,樹舌凝集素可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌的生長[25];黑蕓豆凝集素在20 μg/mL時,可以抑制黑曲霉、香蕉尖孢鐮刀菌、錐栗炭疽病病菌、蓮細(xì)極鏈格孢菌、瓜果腐霉病菌、葡萄灰霉菌[26];桑葉凝集素可以抑制綠色木霉菌、蘋果落葉病菌、西瓜枯萎病菌、煙草黑脛菌等病菌[27]。在抗病毒方面,楊樹菇凝集素可以有效抑制煙草花葉病毒(TMV)[28]。繡球藤凝集素可以抑制牛痘病毒和水泡口炎病毒[29]。

2 TLRs信號通路概述

Toll樣受體首次發(fā)現(xiàn)于果蠅,因與果蠅蛋白Toll具有較高的同源性,故稱為Toll樣受體[30],之后在哺乳動物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了Toll樣受體的存在。TLRs是最早發(fā)現(xiàn)的天然免疫模式識別受體(PRRs),可以識別外源的病原菌相關(guān)分子模式(PAMPs)、內(nèi)源的損害相關(guān)分子模式(DAMPs)和異源物先關(guān)分子模式(XAMPs)[31]。TLRs是一類Ⅰ型跨膜蛋白質(zhì),由三部分組成,包括亮氨酸重復(fù)序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域。TLRs與配體識別的關(guān)鍵部位是由19～25個亮氨酸重復(fù)序列組成的,活化TLRs的結(jié)構(gòu)是TIR結(jié)構(gòu)域[32]。TLRs主要在免疫細(xì)胞中表達(dá),如巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等[33]。TLRs與相關(guān)接頭蛋白結(jié)合后,可以激活下游信號通路,誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等釋放炎癥介質(zhì),殺死外來的病原體[34]。TLRs是非特異性免疫識別的關(guān)鍵受體,在由炎癥反應(yīng)、腫瘤等引起的免疫性疾病調(diào)節(jié)中起到重要的作用。食用菌凝集素免疫調(diào)節(jié)主要是通過刺激TLRs信號通路完成的。

2.1 TLRs家族成員的介紹

TLRs家族包含13個成員。在TLR家族這個大家庭中,根據(jù)它們在細(xì)胞中的定位和各自的PAMP(病原體相關(guān)分子模式)配體可以分成兩個亞組。TLR11與TLR5具有同源性,位于細(xì)胞表面;TLR13位于細(xì)胞囊泡中[35-36]。TLR10與TLR1相似,具有與TLR2形成二聚體的接口和脂肽結(jié)合的通道[37]。TLR1、2和6識別脂肽和糖脂,TLR7、8和9識別核酸如ssRNA和未甲基化的CpG DNA,TLR3區(qū)分與病毒感染相關(guān)的dsRNA、TLR4識別纖維蛋白、脂多糖(LPS)和熱休克蛋白,TLR5鑒定細(xì)菌鞭毛蛋白,TLRs 11和12識別肌動蛋白結(jié)合蛋白[38]。其中TLR4是發(fā)現(xiàn)的第一個人類細(xì)胞表面的TLRs受體蛋白,也是最復(fù)雜的,幾乎分布于所有細(xì)胞中[39]。

2.2 TLRs介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路

圖1 TLRs信號通路活化機(jī)制Fig.1 Mechanism of TLRs signaling pathway activation注:P13K:磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase);Akt:絲/蘇氨酸蛋白激酶B(serine/threonine kinase B);TAK-1:轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶(TGF-β-activated kinase-1);MAPK:絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase);IκB:抑制劑-κB(inhibitor-κB);IKK:IκB激酶(IκB kinase);JNK:c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase);p38:p38蛋白(p38 protein);NF-κB:核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B);AP-1:激活蛋白-1(activating protein-1);IRF-3:干擾素調(diào)節(jié)因子-3(interferon regulatory factor-3)。

TLRs信號通路如圖1[40]所示,TLRs在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中起著重要的作用。凝集素與細(xì)胞表面的TLRs受體結(jié)合,激活TLRs,啟動下游信號,激活細(xì)胞內(nèi)MAPK信號通路和NF-κB信號通路,調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、干擾素等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[41]。TLR受體與凝集素結(jié)合并激活TLR,激活后的TLR可以與MyD88結(jié)合,也可以與TRIF結(jié)合。

當(dāng)TLR與MyD88結(jié)合后,可以啟動MyD88依賴途徑。MyD88募集IRAK家族成員并激活I(lǐng)RAK4、IRAK1、IRAK2和IRAKM[34]。IRAK4最初被激活,并且在MyD88下游的NF-κB和MAPK的激活中具有重要作用[42]。IRAK活化導(dǎo)致與TRAF6的相互作用,TRAF6是一種E3連接酶,其催化與靶蛋白上的K63(Lys63)連接的多聚泛蛋白的合成,包括TRAF6本身和IRAK1,以及二聚體E2遍在蛋白綴合酶Ubc13和Uev1A[43]。然后,K63連接的多聚泛蛋白鏈與TAB-2的新的鋅指型泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激酶TAK-1復(fù)合物的調(diào)節(jié)組分TAB-3結(jié)合,以激活TAK-1[44]。TAK-1通過誘導(dǎo)MAPK激酶的磷酸化,同時激活ERK、p38和JNK,然后MAPK激酶激活各種轉(zhuǎn)錄因子(包括AP-1),并影響翻譯[45]。同時,K63連接的多聚泛蛋白鏈還可以與NEMO的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合,NEMO是NF-κB活化所需的IKK復(fù)合物的必需調(diào)節(jié)組分[46]。因此,K63多聚泛蛋白鏈可能是負(fù)責(zé)募集TAK-1以與IKK形成復(fù)合物,從而允許TAK-1通過其與IKK復(fù)合物的緊密接近來磷酸化IKKβ,其通過磷酸化和隨后的IκB蛋白降解導(dǎo)致NF-κB活化[47]。

當(dāng)TLR與TRIF結(jié)合后,可以啟動TRIF依賴途徑。TRIF與P13K結(jié)合,誘導(dǎo)NF-κB的活化;TRIF與TRAF6結(jié)合,誘導(dǎo)IRF-3的活化,引起ITF-β的表達(dá)[48]。TRIF依賴途徑的下游有TRAF3和TRAF6兩個腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子。研究結(jié)果表明,在缺少TRAF3時Ⅰ型干擾素產(chǎn)生量減少;缺少TRAF-6時Ⅰ型干擾素產(chǎn)生量沒有減少,這說明,TRAF-3在TRIF依賴途徑發(fā)揮重要的作用[49]。TRIF依賴途徑主可以調(diào)節(jié)干擾素相關(guān)蛋白的表達(dá)、誘導(dǎo)樹突細(xì)胞成熟和誘導(dǎo)ITF-β的表達(dá)等。

3 凝集素通過TLRs信號通路的免疫調(diào)節(jié)作用

3.1 微生物凝集素

大型真菌凝集素可以通過TLRs信號通路刺激免疫細(xì)胞的增殖提高巨噬細(xì)胞的吞噬作用以及增強(qiáng)細(xì)胞因子和炎性因子的分泌,并且TLRs在腫瘤免疫監(jiān)視中也可能發(fā)揮作用[33]。大多數(shù)大型真菌凝集素是通過TLRs信號通路調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的。如姬松茸刺激T細(xì)胞上的樹突狀細(xì)胞,作用CLRs凝集素受體指導(dǎo)T細(xì)胞實現(xiàn)內(nèi)吞過程,分泌TNF-α,完成免疫調(diào)節(jié)作用[50]。靈芝凝集素在體外可以激活小鼠脾細(xì)胞,在體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)作用,能促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞有絲分裂[28]。表1列舉了幾種食用真菌凝集素通過TLRs信號通路的免疫調(diào)節(jié)作用[51]。

表1 幾種大型真菌凝集素誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子Table 1 Some large fungus lectins that induce cytokines production

表2 幾種植物凝集素誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子Table 2 Several plant lectins that induce cytokines production

3.2 植物凝集素

植物凝集素的免疫調(diào)節(jié)活性是它們與聚糖的相互作用,激活免疫細(xì)胞表面的受體有關(guān),其相互作用可能觸發(fā)TLRs信號通路,產(chǎn)生某些細(xì)胞因子,相關(guān)細(xì)胞因子見表2[52]。因此,具有免疫調(diào)節(jié)作用的凝集素存在潛在的藥用價值。樹菠蘿凝集素與TLR2的糖基結(jié)合誘導(dǎo)IL-12的表達(dá)[53]?？嗍w麥凝集素可以刺激樹突細(xì)胞的成熟,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[54]。洋蔥凝集素可以刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7,通過MAPK和NF-κB信號通路刺激促炎性因子TNF-α、IL-12和IFN-γ的表達(dá)[20]。扁豆凝集素與甘露糖/半乳糖特異結(jié)合能夠誘導(dǎo)鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。

3.3 動物凝集素

隨著對動物凝集素的深入研究,發(fā)現(xiàn)動物凝集素也可以通過TLRs信號通路進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)作用。貽貝凝集素與N-乙酰半乳糖胺/半乳糖特異性結(jié)合后分別處理鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7、鼠骨髓巨噬細(xì)胞、人巨噬細(xì)胞THP-1,通過活性氧ROS、絲裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶C-α/δ和NF-κB等途徑使得NO、TNF-α、IL-6的釋放量均明顯增加[55]。蛇毒C型凝集素通過MAPK和NF-κB信號通路激活巨噬細(xì)胞,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[56]。家蛹凝集素可以通過TLR4/NF-κB信號通路,使iNOS表達(dá)和NO合成與釋放[57]。

4 展望

凝集素在自然界分布廣泛,且具有多種生物活性。存在于免疫細(xì)胞表面的凝集素和聚糖物質(zhì)之間的相互作用可能引發(fā)分化免疫調(diào)節(jié)作用,包括細(xì)胞增殖和激活以及細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激[58-59]。先天免疫系統(tǒng)是保護(hù)人體免受微生物、過敏原和癌癥侵害的核心。TLR家族及其下游細(xì)胞內(nèi)信號分子在先天免疫中起著重要作用,這些信號通路的激活導(dǎo)致各種抗炎和促炎癥分子的表達(dá),這些分子調(diào)節(jié)代謝和體內(nèi)平衡[60]。通過TLRs可調(diào)控炎性反應(yīng),為以后疾病的預(yù)防和治療提供新的治療策略[61]。凝集素通過TLRs信號通路,可以誘導(dǎo)白細(xì)胞介素、干擾素等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,還可以刺激巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等免疫細(xì)胞的增殖與分化。大型真菌凝集素能刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞,可以通過檢測淋巴母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況,反應(yīng)細(xì)胞免疫水平,監(jiān)視免疫調(diào)節(jié)情況。

利用凝集素的免疫調(diào)節(jié)作用預(yù)防治療疾病將成為凝集素的最重要的研究方向。凝集素的快速發(fā)展也為開發(fā)保健性食品或藥物提供了重要的依據(jù)。雖然凝集素對的免疫調(diào)節(jié)已經(jīng)研究了很多,但是由于凝集素的種類眾多,所以對于每種凝集素具體的調(diào)節(jié)作用還需具體研究,不能以偏概全。