基質(zhì)固相分散-乙腈/鹽雙水相萃取結(jié)合高效液相色譜法檢測蔬菜中的苯脲類農(nóng)藥殘留

徐尉力,馬銘揚(yáng),李守志,趙 洋,付 壯,王志兵

(長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130012)

苯脲類除草劑(Phenylurea herbicides,Pus)是脲類除草劑中主要的一類,廣泛用于一年生寬葉雜草的芽前和芽后階段,主要通過抑制光合作用中的希爾反應(yīng)以減弱葉綠體的活性,從而達(dá)到控制雜草的目的[1-2]。由于其在環(huán)境水[3-5]、土壤[6-8]中降解較慢,可通過生物富集作用殘存于水果[9]、蔬菜[10-12]、茶葉[13]、稻谷[14]以及奶制品[15-17]中,繼而對人體健康產(chǎn)生不利影響。相關(guān)研究[18-19]表明:滅草隆和利谷隆對野生動(dòng)物和人類具有潛在的致癌作用,而其它苯脲類衍生物也具有一定的生態(tài)和遺傳毒性。目前,歐盟、日本等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)已對食品中苯脲類農(nóng)藥殘留做出了相關(guān)規(guī)定,我國規(guī)定綠麥隆在麥類、玉米和大豆中的最高殘留限量為0.1 mg/kg[2,20-21]。因此,建立一種檢測食品中苯脲類農(nóng)藥殘留的方法顯得尤為重要。

圖1 基質(zhì)固相分散鹽析誘導(dǎo)乙腈/鹽雙水相萃取流程圖Fig.1 Schematic procedure of matrix solid phase dispersion followed by acetonitrile-salt based aqueous two-phase extraction

目前,常見的農(nóng)殘檢測方法有毛細(xì)管電泳法[22]、氣相色譜法[23]、酶聯(lián)免疫法[24]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[25]以及高效液相色譜法[17]等,其中高效液相色譜法具有檢測靈敏度高,選擇性強(qiáng),分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用?；|(zhì)固相分散是在固相萃取的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型樣品處理方法,可用于固體、半固體及高粘性樣品的制備[26]。它集樣品分散、提取、凈化于一體,有效提高了目標(biāo)物的提取性能[27-28],但基質(zhì)固相分散法仍使用較多的萃取溶劑,當(dāng)處理復(fù)雜的基質(zhì)樣品時(shí),會造成目標(biāo)分析物在后續(xù)的旋蒸、濃縮、回溶等環(huán)節(jié)大量損失,從而使萃取回收率大大降低。雙水相(Aqueous two phase systems,ATPs)是一種簡單、高效的液-液分離萃取技術(shù)[29],在臨界濃度下將兩種溶液混合,當(dāng)加入一種成相物質(zhì)時(shí),組分因疏水作用、范德華力以及表面張力等作用而發(fā)生相分離,逐漸形成穩(wěn)定且互不相容的兩相[30],由于目標(biāo)物在兩相中具有不同的分配系數(shù),因此可以起到富集目標(biāo)物的作用[31]。雙水相萃取憑借作用條件溫和,分離效果明顯,環(huán)境友好無污染等優(yōu)勢在萃取、濃縮、分離過程中發(fā)揮著重要作用。

因此,本法選用乙腈水溶液為洗脫劑,采用基質(zhì)固相分散法對蔬菜樣品進(jìn)行前處理,隨后向洗脫劑中加入K2HPO4,使之發(fā)生鹽析效應(yīng),形成穩(wěn)定的乙腈/鹽雙水相體系,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的進(jìn)一步萃取、凈化與富集。本研究首次將基質(zhì)固相分散與乙腈/鹽雙水相萃取相結(jié)合，用于蔬菜中苯脲類化合物的提取、分離和富集,并通過高效液相色譜對目標(biāo)物進(jìn)行定性、定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃瓜、西紅柿、馬鈴薯、辣椒、西蘭花(分別編號1～5) 購于當(dāng)?shù)爻?綠麥隆、滅草隆、利谷隆、敵草隆標(biāo)準(zhǔn)品 純度均>99%,阿拉丁試劑公司;硅膠(200～300目)、硅藻土(200～300目)、弗羅里硅土(60～100目)、酸性氧化鋁(100～200目,pH4.0～5.0)、中性氧化鋁(200～300目,pH6.5～7.5)和堿性氧化鋁(200～300目,pH9.0～10.0) 中國藥品生物制品檢定所。

Agilent LC-1100高效液相色譜儀(配有四元泵、真空脫氣機(jī)以及二極管陣列檢測器)、Zorbax SB-C18色譜柱(3.5 μm,4.6 mm×150 mm)、C18預(yù)柱(5 μm,7.5 mm×2.1 mm) 美國安捷倫科技公司;KQ-100DE超聲波清洗器 江蘇昆山超聲儀器公司;Allegra 64R高速離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取綠麥隆、滅草隆、利谷隆和敵草隆標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg置于10 mL棕色容量瓶中,用乙腈定容至10 mL,混勻后得到500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃環(huán)境中避光保存。后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用工作溶液均由標(biāo)準(zhǔn)儲備液經(jīng)乙腈稀釋得到。

1.2.2 樣品預(yù)處理 將所有新鮮蔬菜樣品洗凈后瀝干,用攪拌機(jī)切碎后保存于-20 ℃冰箱中備用。加標(biāo)樣品通過向樣品中加入一定量的工作溶液攪拌均勻后得到。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,除回收率和實(shí)際樣品分析外,其余實(shí)驗(yàn)結(jié)果均由樣品1(黃瓜)獲得。

1.2.3 基質(zhì)固相分散-乙腈/鹽雙水相萃取 如圖1所示,首先向瑪瑙研缽中準(zhǔn)確加入0.3 g加標(biāo)樣品和0.9 g硅膠,充分研磨5 min,使樣品與硅膠完全混勻,將混合物轉(zhuǎn)移到底層鋪有脫脂棉的萃取柱中,在混合物上方再放置一層脫脂棉,并用玻璃棒輕輕壓實(shí)。隨后,用20%的乙腈水溶液(自然pH)作洗脫劑,在重力作用下對目標(biāo)物進(jìn)行洗脫,隨后用10 mL離心管收集洗脫液。收集3 mL后,向離心管中加入0.9 g K2HPO4,并在200 W下超聲10 min,然后在8000 r/min下離心5 min,則乙腈/鹽雙水相體系形成,上層溶液為富集有目標(biāo)物的乙腈相。最后取100 μL上相,用100 μL乙腈稀釋后,過0.22 μm濾膜,進(jìn)行色譜分析。

1.2.4 色譜條件 流動(dòng)相由水(A)和乙腈(B)組成,梯度洗脫條件為:0 min,30%(B);0～10 min,30%～40%(B);10～18 min,40%～50%(B);18～25 min,50%～65%(B),25～27 min,65%～30%(B);27～30 min,30%(B)。流動(dòng)相流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;柱溫:35 ℃;檢測波長:245 nm。

1.2.5 加標(biāo)回收率、萃取率和相比計(jì)算

萃取率(%)=[上相體積(mL)×上相中目標(biāo)物濃度(μg/mL)]/[加標(biāo)體積(mL)×加標(biāo)濃度(μg/mL)]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

萃取條件優(yōu)化與方法學(xué)的數(shù)據(jù)均通過Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并通過Origin 8.0.6軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 分散劑的影響 不同的分散劑對樣品組織的破碎能力以及對目標(biāo)物的吸附能力有所不同。當(dāng)使用酸性氧化鋁、中性氧化鋁和堿性氧化鋁作分散劑時(shí)。一方面,由于它們對目標(biāo)分析物的吸附能力較強(qiáng)[28],使目標(biāo)分析物不易從萃取柱中被洗脫出來,從而使各目標(biāo)分析物的回收率相對較低(見圖2A)。另一方面,由于它們的吸水性差,易粘結(jié),不利于高水分含量蔬菜樣品的研磨。當(dāng)使用硅膠和硅藻土做分散劑時(shí),由于其具有較大的網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu),對目標(biāo)物具有較大的接觸面積,其吸水性好,從而使蔬菜樣品的分散效果較好,回收率較高。但使用硅藻土作分散劑時(shí),由于粘性較大,使后續(xù)洗脫時(shí)間較長。而弗羅里硅土略有吸水性,無沙性,不利于樣品的分散。因此,本研究選用硅膠作為分散劑。

此外,本研究還考察了樣品與分散劑的質(zhì)量比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5)對目標(biāo)物回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示,當(dāng)樣品與硅膠的質(zhì)量比為1∶3時(shí),目標(biāo)分析物的回收率最高。所以,本研究將樣品與硅膠的質(zhì)量比定為1∶3。

圖2 分散劑種類(A)和樣品與分散劑的 質(zhì)量比(B)對回收率的影響Fig.2 Effect of type of dispersant(A)and mass rotio of sample to dispersant(B)on recovery

2.1.2 乙腈濃度的影響 在本研究中,通過向10 mL水溶液中加入不同體積的乙腈溶液配制出不同體積比(20%、22%、24%、26%、28%、30%、32%,v/v)的乙腈水溶液,乙腈水溶液作為基質(zhì)固相分散的洗脫劑和乙腈/鹽雙水相體系的成相溶劑,乙腈濃度決定了上相體積和富集效果,對萃取率和回收率均產(chǎn)生影響。一方面,乙腈作為基質(zhì)固相分散的洗脫劑,其濃度越高,從萃取柱中提取和分離的目標(biāo)物分子越多,萃取率越高,如圖3A所示,當(dāng)乙腈濃度達(dá)到28%時(shí),各目標(biāo)物的萃取率達(dá)到最大值。另一方面,乙腈作為雙水相體系的成相溶劑,不僅影響后續(xù)雙水相體系的形成,也影響目標(biāo)分析物的富集效果。當(dāng)乙腈濃度低于20%時(shí),萃取體系無法觀察到明顯的濁點(diǎn)現(xiàn)象,雙水相體系不能形成,當(dāng)乙腈濃度高于20%時(shí),濁點(diǎn)現(xiàn)象產(chǎn)生，靜置后雙水相體系形成,且隨著乙腈濃度的增加,相比顯著升高。從圖3B可以看出,當(dāng)乙腈濃度為20%時(shí),各目標(biāo)分析物的回收率達(dá)到最大值。此時(shí),目標(biāo)物的萃取率盡管只有50%左右,但相比最小(見圖3A),上相溶液(即乙腈相)體積僅為200 μL,富集效果最佳。綜合考慮,本研究選用濃度為20%的乙腈水溶液作為洗脫劑。

圖3 乙腈濃度對萃取率、相比(A)和回收率(B)的影響Fig.3 Effect of acetonitrile concentration on extraction yield,phase ratio(A)and recovery(B)

2.1.3 洗脫劑pH的影響 通過向水溶液加入pH=1的HCl溶液和pH=14的NaOH溶液以調(diào)節(jié)洗脫劑的pH,改變了目標(biāo)分析物的解離狀態(tài)和雙水相體系的電荷分布,繼而影響目標(biāo)分析物的回收率。因此,本研究考察了不同pH的洗脫溶劑對各目標(biāo)物回收率的影響,由于乙腈濃度和體積均固定,雙水相中上相體積不會發(fā)生變化,因而并未考察不同pH的洗脫劑對各目標(biāo)物萃取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,當(dāng)洗脫劑pH由1逐漸增加到12時(shí),各目標(biāo)物回收率基本不變,這說明pH對回收率沒有明顯的影響,這與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致[32]。因此,為了簡化實(shí)驗(yàn)操作,本研究選擇不調(diào)節(jié)洗脫劑的pH。

圖4 洗脫劑pH對回收率的影響Fig.4 Effect of pH value of elution solution on recovery

2.1.4 洗脫液體積的影響 本研究考察了不同洗脫液體積(1、2、3、4、5、6、7和8 mL)對目標(biāo)物回收率及萃取率的影響。由于樣品中目標(biāo)物含量一定,乙腈水溶液用量越大,相比越大,目標(biāo)物萃取率隨洗脫液體積的增加而增大,當(dāng)收集的洗脫液達(dá)到3 mL時(shí)萃取率趨于平衡,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5A所示。但實(shí)驗(yàn)既考慮上相體積增大對目標(biāo)物的提取效果的影響也要考慮對富集效果的影響,通過分析上相中各目標(biāo)物的回收率,發(fā)現(xiàn)當(dāng)洗脫液體積由 1 mL 增加到 3 mL時(shí),各目標(biāo)物回收率明顯提升且達(dá)到最大值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5B所示。這說明3 mL左右的洗脫液足以將目標(biāo)物從基質(zhì)固相分散萃取柱中洗脫出來,但隨著收集的洗脫液體積的繼續(xù)增加,目標(biāo)物回收率反而大幅度下降,造成這種現(xiàn)象的原因是當(dāng)收集的洗脫液體積體積達(dá)到3 mL時(shí)目標(biāo)物萃取率趨于穩(wěn)定,但上相體積增大,起到一定的稀釋作用,目標(biāo)物回收率逐漸下降,富集效果變差。因此,本研究選擇收集3 mL洗脫液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 洗出液體積對萃取率、相比(A)和回收率(B)的影響Fig.5 Effect of volume of elution solvent on extraction yield,phase ratio(A)and recovery(B)

2.1.5 成相鹽種類的影響 當(dāng)樣品用基質(zhì)固相分散法處理后,獲得了由乙腈水溶液組成的樣品洗脫液,向其中加入成相鹽后,鹽離子與水分子間產(chǎn)生較強(qiáng)的離子水合作用,使乙腈溶液不斷失去水分子,當(dāng)乙腈聚集到一定程度時(shí)與鹽水相發(fā)生分離,雙水相體系形成,目標(biāo)分析物則通過疏水作用、氫鍵和范德華力等分配到上相溶液(乙腈相)中,從而達(dá)到分離富集的目的[33]。由于不同種類的鹽溶于水后會產(chǎn)生不同的鹽析效果,因此本研究考察了K2HPO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3、KH2PO4、Na2SO4、NaCl(添加量均為0.9 g)等7種成相鹽對回收率的影響,由圖6A中可以較為直觀的看出,KH2PO4、Na2SO4無法誘導(dǎo)乙腈/鹽雙水相體系的形成,NaCl上相體積過少,無法定量取出,而K2HPO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3這四種鹽則可形成穩(wěn)定的乙腈/鹽雙水相體系。因此,

圖6 鹽的種類對相比(A)和回收率(B)的影響Fig.6 Effect of salt type on phase ratio(A)and recovery(B)

表1 線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 1 Linear regressions,LODs and LOQs for the analytes

表2 日內(nèi)和日間精密度(n=6)Table 2 Intra-day and inter-day precision for the analytes(n=6)

本研究又選取了K2HPO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3等四種鹽進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6B所示,當(dāng)乙腈濃度為20%,洗脫液體積為3 mL,成相鹽用量為0.9 g時(shí),選用K2HPO4作為成相鹽所獲得的目標(biāo)分析物的回收率最高。因此,本研究選用K2HPO4作為成相鹽。

2.1.6 鹽用量的影響 成相鹽的用量會影響目標(biāo)物解離狀態(tài)以及離子強(qiáng)度,進(jìn)而影響雙水相體系的上相/下相體積比和對目標(biāo)分析物的富集效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示,當(dāng)鹽的用量少于0.8 g時(shí),不能形成雙水相體系;當(dāng)鹽用量由0.8 g增加到0.9 g時(shí),雙水相體系形成,目標(biāo)分析物被乙腈富集到上相溶液中,其回收率逐漸增加,且達(dá)到最大值;當(dāng)繼續(xù)增加鹽的用量時(shí),目標(biāo)物回收率先略有下降,后逐漸趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)辂}的用量不斷增加,使得鹽離子與乙腈競爭水分子的能力不斷增強(qiáng),從而導(dǎo)致更多的乙腈被聚集,上相體積略有增加,進(jìn)而對目標(biāo)物產(chǎn)生一定的稀釋作用。所以,本研究選擇成相鹽的質(zhì)量為0.9 g。

圖7 成相鹽用量對回收率的影響Fig.7 Effect of salt amount on recovery

2.2 方法評價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限 配制含有4種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)乙腈梯度稀釋后加入到樣品1中,得到含有系列濃度的加標(biāo)樣品,在最優(yōu)條件下對加標(biāo)樣品進(jìn)行提取分析。以加標(biāo)濃度(c)為橫坐標(biāo),以峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制工作曲線,得到線性回歸方程。通過分析11組低濃度空白加標(biāo)樣品,計(jì)算方法檢出限和定量限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各目標(biāo)物線性關(guān)系良好(r>0.9988),檢出限和定量限分別為0.9～1.5和2.9～4.9 μg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

2.2.2 精密度 本研究測定了樣品加標(biāo)濃度分別為5.0、50.0和150.0 μg/kg時(shí)的方法精密度,并用重復(fù)分析測定所得回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示日內(nèi)和日間精密度。日內(nèi)精密度指1 d內(nèi)對加標(biāo)樣品連續(xù)分析6次所得回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差;日間精密度指每天分析2次，連續(xù)分析3 d所得回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表2所示,日內(nèi)和日間精密度分別為1.7%～8.6%和4.0%～9.8%。

2.2.3 回收率 為了檢驗(yàn)本法的準(zhǔn)確度,本研究分析了加標(biāo)濃度為5.0和50.0 μg/kg的5種蔬菜樣品,各目標(biāo)物的回收率在84.3%～118.8%之間,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～10.1%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本法具有良好的準(zhǔn)確度,可用于蔬菜中苯脲類化合物的檢測。結(jié)果如表3所示。

表3 實(shí)際樣品分析(n=3)Table 3 Analysis of real samples(n=3)

注:“-”表示空白樣品;“ND”表示未檢出。

表4 化合物的穩(wěn)定性(n=5)Table 4 Stability analysis of spiked samples(n=5)

2.2.4 穩(wěn)定性 為了考察蔬菜樣品中苯脲類化合物的穩(wěn)定性,將加標(biāo)濃度為5.0和50.0 μg/kg的蔬菜樣品每隔1周分析一次。結(jié)果如表4所示,各目標(biāo)物回收率在95.3%～110.8%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～8.6%。結(jié)果表明,苯脲類化合物在28 d內(nèi)是相對穩(wěn)定的,樣品基質(zhì)對目標(biāo)物影響不大。

2.3 實(shí)際樣品分析

為了考察本法的適用性,本研究分析了5種蔬菜樣品,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,所有實(shí)際樣品中均未檢出苯脲類除草劑。色譜圖如圖8所示,各目標(biāo)物保留時(shí)間內(nèi)無明顯雜質(zhì)干擾峰。因此,本法可用于檢測不同種類蔬菜中的苯脲類除草劑殘留。

圖8 加標(biāo)樣品(A)和空白樣品(B)的色譜圖Fig.8 Chromatograms of spiked sample(A) and blank sample(B)注:1：滅草隆;2：綠麥隆;3:敵草隆;4:利谷隆。

2.4 方法比較

本研究構(gòu)建了一種新的基質(zhì)固相分散-乙腈/鹽雙水相萃取體系,用于蔬菜中苯脲類農(nóng)藥殘留的提取、凈化、濃縮與富集,如表5所示。與基質(zhì)固相分散法和固相萃取法相比,本法有機(jī)試劑用量少(僅為1 mL),不需旋蒸、離心等操作,可直接用于色譜分析,簡化了實(shí)驗(yàn)步驟,并且在檢出限和回收率等方面也表現(xiàn)出優(yōu)良的性能。

表5 本方法與其它方法比較Table 5 Comparison between the proposed method and other methods

3 結(jié)論

本研究將基質(zhì)固相分散與乙腈/鹽雙水相萃取法相結(jié)合,通過高效液相色譜同時(shí)測定蔬菜中的4種苯脲類化合物,建立了一種簡單、高效的農(nóng)殘分析方法。本研究采用基質(zhì)固相分散法對蔬菜樣品進(jìn)行前處理,并通過乙腈/鹽雙水相體系對目標(biāo)物進(jìn)一步提取、凈化與富集,減少了樣品基質(zhì)的干擾,使得提取過程變得更加簡單、高效。各目標(biāo)化合物在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r>0.9988),檢出限與定量限分別為0.9～1.5 μg/kg 和 2.9～4.9 μg/kg。日內(nèi)和日間精密度分別為1.7%～8.6%和4.0%～9.8%,加標(biāo)回收率在84.3%～118.8%之間。與其他方法相比,該法具有試劑用量少,凈化效果好,提取過程簡單、高效等優(yōu)勢,可用于蔬菜中苯脲類化合物的提取與分析。