多重位點(diǎn)特異性PCR快速檢測牛肉中常見摻假動物源性成分

，*3,

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林吉林 132013; 2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林吉林 132013; 3.北華大學(xué)吉林省中藥DNA指紋檢測技術(shù)科技創(chuàng)新中心,吉林吉林 132013; 4.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林吉林 132013; 5.吉林雷寧科技有限公司,吉林吉林 132013)

“民以食為天,食以安為先”,食品安全已經(jīng)成為世界性公共衛(wèi)生問題。從歐洲的“馬肉風(fēng)波”事件[1]到中國的“鴨肉變羊肉”、“驢肉摻假門”事件,以及層出不窮的“牛肉膏事件”等系列事件,均在不同程度上損害了消費(fèi)者健康。在人們生活水平不斷提高的今天,肉類逐漸成為人們餐桌上的主角,其質(zhì)量的好壞尤其是肉類及肉類產(chǎn)品的真實(shí)性直接關(guān)系到每一個人的身體健康和生命安全,其次以低價肉類偽裝成高價肉類,影響著肉類食品產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此肉類食品動物源性成分的鑒定刻不容緩。但是隨著現(xiàn)代肉類食品工業(yè)的飛速發(fā)展、摻假手段的多樣性,普通消費(fèi)者難以通過感官和性狀對食品中動物源性成分進(jìn)行鑒定。

20 世紀(jì)80年代,國內(nèi)外開始對肉制品摻假進(jìn)行研究,早期的肉品鑒定方法主要基于脂肪酸和蛋白質(zhì)水平[2],主要是電泳技術(shù)[3-4]、免疫學(xué)技術(shù)[5]、光譜技術(shù)[6]。但上述方法在實(shí)際應(yīng)用中存在不同程度的局限性,干擾鑒定的結(jié)果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)中PCR 技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,以PCR為基礎(chǔ)的DNA分析方法已成為國內(nèi)外鑒別肉類物種常見的方法,如Calvo等[7]通過應(yīng)用PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對加工和未加工食品和飼料中的牛肉和牛源物質(zhì)成分的檢測。陳思秀等[8]針對驢源性成分研制出DNA檢測試劑盒。Girish等[9]、Hamzah等[10]和Imaizumi等[11]證明了細(xì)胞色素b(Cytochrome,Cytb)基因、D-loop、16S rDNA和12S rDNA等基因序列均可用于肉類物種的鑒定。Soares等[12]通過實(shí)時熒光PCR測定法定量檢測肉制品中的大豆。Liliana等[13]建立了加工食品中馬肉成分的實(shí)時熒光PCR檢測方法。唐修君等[14]建立了基于實(shí)時熒光PCR法檢測畜禽肉中雞源性成分的研究方法。這些研究雖在一定程度上為動物源性檢測提供了一種常規(guī)、有效的方法,但由于摻雜物種多樣性,導(dǎo)致只針對單一標(biāo)靶基因的PCR反應(yīng)很難一次性進(jìn)行全部檢測。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對引物、探針、使用儀器和操作人員等要求高,使其應(yīng)用受到限制[15]。而以mtDNAcytb為靶基因建立多物種同步檢測的多重PCR技術(shù),可提高檢測效率與檢測通量,如今已成為研究的熱點(diǎn)[16-17]。

mtDNA系母系遺傳,基因組結(jié)構(gòu)高度保守,一級結(jié)構(gòu)有很大的差異,適合于物種的鑒定研究[18]。cytb基因是線粒體內(nèi)編碼蛋白質(zhì)的基因,進(jìn)化速度適中,是作為動物源性成分鑒定的理想分子遺傳標(biāo)記物之一[18-20]。本研究選擇不同動物mtDNAcytb基因作為靶基因,根據(jù)cytb基因多態(tài)性位點(diǎn)的差異,設(shè)計(jì)物種特異性引物,建立用于同時檢測摻入牛肉中豬肉、雞肉動物源性成分的多重PCR分析體系,實(shí)現(xiàn)對肉類食品中摻假動物成分的來源快速、靈敏、高通量地分析,以期肉類市場監(jiān)督部門提供的科學(xué)和高效的檢測技術(shù),保障人們的健康,保障肉類產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的牛肉、豬肉、雞肉、馬肉、羊肉、驢肉 均由長春食品藥品檢測中心提供;鴨肉、狗肉、兔肉等 購自本地某超市;2×Taq PCR MasterMix、100 bp DNA Ladder、20 mg/mL蛋白酶K、10 mg/mL RNase A 天根生物科技有限公司;GelRed Nucleic Acid Gel Stain 美國Biotium公司;瓊脂糖 西班牙BIOWEST公司;Tris-HCl、EDTA-Na2美國Genview公司;SDS Biosharp公司;NaAc結(jié)晶、異丙醇、無水乙醇 分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

H-2050R高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;LX-100手掌型離心機(jī) 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司;9700 GeneAmp PCR System 美國Per-kin-Elmer公司;DYY-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng) Eppendorf公司;HH.S精密恒溫水浴鍋 江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;Q6000超微量紫外-可見分光光度計(jì) 美國Quawell公司;ZF-90型紫外透射反射分析儀 上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取肉樣DNA 基于SDS法進(jìn)行改良[21]:樣品均為鮮品,用生理鹽水洗滌3次后,去除結(jié)締組織和脂肪,儲存在-20 ℃?zhèn)溆?防止DNA降解。稱取前處理樣品0.1 g,放入離心管中,剪碎,加入P1(0.01 mol/L Tris-HCl 500 μL、0.01 mol/L EDTA 500 μL、10% SDS 80 μL、20 mg/mL蛋白酶K 20 μL、10 mg/mL RNase A 2 μL),混勻后56 ℃水浴震蕩2 h,加入P2(飽和NaAc)500 μL,顛倒混勻,12000 r/min離心10 min。取上清液,加入等體積P3(異丙醇)混勻,-20 ℃以下放置1 h,12000 r/min離心10 min,棄去上清液。加入P4(70%乙醇)洗沉淀2次,室溫干燥沉淀后,加入P5(滅菌ddH2O)溶液100 μL,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測DNA的純度和濃度 使用Q6000美國Quawell超微量紫外-可見分光光度計(jì),分別測定每個樣品提取DNA溶液的濃度和純度,以檢測其質(zhì)量。取1 μL微量的核酸樣品進(jìn)行加樣(可重復(fù)測量,樣品體積在0.5～2.0 μL范圍內(nèi)),5 s檢測完成,自動計(jì)算并顯示260/280比值、樣品濃度。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì) 從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載牛種屬cytb基因序列(MH714784.1)、豬種屬cytb基因系列(AF136554.1)、雞種屬cytb基因序列(AF028795.1),利用MEGA7軟件對基因序列進(jìn)行序列同源性比較分析,尋找特異性SNP位點(diǎn)[22],利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)物種特異性引物,使正反向引物3′端位均位于SNP位點(diǎn)上,調(diào)整退火溫度在50～55 ℃范圍內(nèi),并使用Oligo 7軟件分析避免引物間出現(xiàn)二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引發(fā)錯配的情況[23]。設(shè)計(jì)的特異性引物序列(見表1)由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 特異性引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 Specific primer sequences and product size

1.2.4 多重PCR反應(yīng)及條件優(yōu)化 多重PCR反應(yīng)總體積為50 μL,包括:2×Ta Mix 25 μL,不同物種的上游引物(5 μmol/L)、下游引物(5 μmol/L)0.2～1 μL,DNA模板(100 ng/μL)0.5 μL,其余用滅菌ddH2O補(bǔ)齊。將PCR反應(yīng)管置PCR儀,擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性2 min,循環(huán)反應(yīng)30次(94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s),延伸72 ℃ 5 min。以此條件為基礎(chǔ),對多重PCR反應(yīng)的退火溫度(50～55 ℃)、循環(huán)數(shù)(25～35個)和不同引物的添加量(1～0.2 μL,以0.2 μL進(jìn)行梯度遞減)進(jìn)行反應(yīng)體系的條件優(yōu)化。

圖1 不同退火溫度下瓊脂糖凝膠的檢測結(jié)果Fig.1 Agarose gel test results at different annealing temperatures注:M:100 bp DNA Ladder;1:牛肉;2:豬肉;3:雞肉;N:空白;圖2同。

瓊脂糖凝膠濃度為1%,膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed(終濃度0.075 μL/mL);PCR結(jié)束后,取反應(yīng)溶液5 μL上樣,100 bp DNA Ladder上樣量為5 μL,1×TBE緩沖液,80 V,1 h后,在紫外分析儀上檢視并拍照。

1.2.5 引物特異性檢測 使用牛的引物,加入采用1.2.1方法提取的牛、豬、雞、馬、羊、驢、鴨、狗、兔DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;使用豬的引物,以牛、豬、雞、馬、羊、驢、鴨、狗、兔DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;使用雞的引物,以牛、豬、雞、馬、羊、驢、鴨、狗、兔DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,鑒定引物的特異性。并通過將單一物種DNA加入混合引物中進(jìn)行引物特異性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 靈敏性測試 將實(shí)驗(yàn)提取的牛肉、豬肉、雞肉的DNA溶液,運(yùn)用DNA核酸蛋白分析儀定量并稀釋至100 ng/μL。將牛肉DNA、豬肉DNA、雞肉DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋至0.1 pg/μL,作為模板進(jìn)行擴(kuò)增,以此來考察牛肉、豬肉、和雞肉多重PCR方法的靈敏度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜均由紫外透射反射分析儀進(jìn)行成像分析,使用 Photoshop CS6進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉類DNA模板的質(zhì)量

將肉類DNA進(jìn)行濃度和純度測定,反復(fù)測量3次,采用SPSS Statistics V17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,濃度測量差值不超過0.01,說明該儀器測量結(jié)果精確穩(wěn)定。A260/A280均值約為1.88±0.2,純度均在1.80～2.00范圍內(nèi),說明該方法提取獲得的DNA 樣品基本無蛋白質(zhì)污染、純度高(見表2)。

表2 提取的肉類DNA的純度和濃度檢測結(jié)果Table 2 Detection results of purity and concentration of extracted meat DNA

2.2 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

圖2 不同循環(huán)數(shù)的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果Fig.2 Agarose gel test results at different cycle numbers

2.2.1 最適退火溫度和循環(huán)數(shù)的確定 分別在退火溫度為50、52、55 ℃和不同循環(huán)參數(shù)的條件下對牛、豬、雞進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1a～圖1c)表明牛和雞引物的退火溫度范圍較寬,牛的引物在149 bp處出現(xiàn)特異性條帶，雞引物在554 bp處出現(xiàn)特異性條帶。但是豬的引物僅在退火溫度為52 ℃時,于261 bp處出現(xiàn)清晰單一的特異性條帶,50和55 ℃退火溫度下豬的引物出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。所以以單重PCR為基礎(chǔ),確定多重反應(yīng)的最適退火溫度為52 ℃。在25、30、35個循環(huán)參數(shù)條件下對牛、豬、雞進(jìn)行鑒別時,結(jié)果(圖2a～圖2c)表明25個循環(huán)PCR條帶亮度淺,35個循環(huán)PCR結(jié)果中豬出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。考慮到DNA提取質(zhì)量和濃度的區(qū)別以及DNA可能存在降解問題,選擇多重PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為30個。

2.2.2 最適引物量的確定 在多重PCR反應(yīng)中各個引物之間的比列對反應(yīng)有嚴(yán)重影響。加入等量的引物,引物之間存在相互抑制,可能出現(xiàn)某一物種沒有條帶的現(xiàn)象。而通過改變反應(yīng)中各種引物加入量,使得PCR擴(kuò)增結(jié)果不同物種均出現(xiàn)特異性的條帶。以牛、豬引物量為1 μL為基礎(chǔ),梯度減少雞引物加入量(1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μL)對多重反應(yīng)的影響,根據(jù)結(jié)果圖3確定雞的上下游引物用量為0.2 μL;在此基礎(chǔ)上考察豬的引物量,圖4表明豬引物用量為0.8、1 μL時,條帶清晰,考慮到引物間相互影響,確定豬引物加入量為0.8 μL;以此對牛的引物量進(jìn)行摸索,當(dāng)牛引物量為0.6 μL時,多重PCR條帶均清晰且無非特異性擴(kuò)增(見圖5)。確定雞、豬、牛最適引物量分別為0.2、0.8、0.6 μL。

圖3 多重PCR中雞的引物加入量結(jié)果Fig.3 Results of primer addition of chicken in multiplex PCR注:M:100 bp DNA Ladder;1:雞引物1.0 μL; 2:雞引物0.8 μL;3:雞引物0.6 μL; 4:雞引物0.4 μL;5:雞引物0.5 μL;N:空白。

圖4 多重PCR中豬的引物加入量結(jié)果Fig.4 Results of primer addition of pigs in multiplex PCR注:M:100 bp DNA Ladder;1:豬引物1 μL; 2:豬引物0.8 μL;3:豬引物0.6 μL; 4:豬引物0.4 μL;5:豬引物0.5 μL;N:空白。

圖5 多重PCR中牛的引物加入量結(jié)果Fig.5 Results of primer addition of cattles in multiplex PCR注:M:100 bp DNA Ladder;1:牛引物1 μL; 2:牛引物0.8 μL;3:牛引物0.6 μL; 4:牛引物0.4 μL;5:牛引物0.5 μL;N:空白。

2.3 混合肉樣的多重PCR檢測

將提取的3個目標(biāo)物種的肉類DNA、兩兩等比例混合肉樣DNA、3個物種等比例混合肉樣DNA,對多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行考察。電泳圖顯示在相應(yīng)位置的出現(xiàn)目標(biāo)條帶,檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致(圖6)。

圖6 多重PCR檢測結(jié)果Fig.6 Results of multiplex PCR注:M:100 bp DNA Ladder;1:牛肉;2:豬肉;3:雞肉; 4:牛肉和豬肉;5:牛肉和雞肉;6:豬肉和雞肉; 7:牛肉、豬肉和雞肉;N:空白。

2.4 引物特異性驗(yàn)證結(jié)果

電泳結(jié)果如圖7所示,使用單一引物加入多個物種DNA模板反應(yīng)時,均在設(shè)計(jì)位置觀察到特異性條帶,未見明顯非特異性擴(kuò)增,且與其他動物源性物種均無交叉反應(yīng)。從圖8中可以看出,用牛、豬、雞的引物組分別對馬、羊、驢、鴨、狗、兔肉DNA進(jìn)行擴(kuò)增均未出現(xiàn)特異性條帶,表明每個物種引物特異性良好。

圖7 引物特異性結(jié)果Fig.7 Results of primer specificity注:M:100 bp DNA Ladder;1:牛的引物+混合DNA; 2:豬的引物+混合DNA;3:雞的引物+混合DNA; 4:牛、豬、雞的引物+混合DNA;N:空白。

圖8 引物特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.8 Verification results of primer specificity 注:M:100 bp DNA Ladder;1:馬肉DNA+牛、豬、雞引物; 2:羊肉DNA+牛、豬、雞引物;3:驢肉DNA+牛、豬、雞引物; 4:鴨肉DNA+牛、豬、雞引物;5:狗肉DNA+牛、豬、雞引物; 6:兔肉DNA+牛、豬、雞引物;N:空白。

2.5 靈敏性考察結(jié)果

將100 ng/μL牛肉DNA、豬肉DNA、雞肉DNA依次進(jìn)行10倍梯度稀釋,考察方法的靈敏性。由圖9～圖11所示,使用多重PCR體系進(jìn)行檢測時,最低濃度為100 pg/μL時,仍可檢測出目標(biāo)物種的特異性擴(kuò)增條帶。

圖9 牛PCR靈敏性的檢測結(jié)果Fig.9 Detection results of PCR sensitivity in cattles注:M:100 bp DNA Ladder;1:牛100 ng/μL;2:牛10 ng/μL; 3:牛1 ng/μL;4:牛100 pg/μL;5:牛10 pg/μL; 6:牛1 pg/μL;7:牛0.1 pg/μL;N:空白。

圖10 豬PCR靈敏性的檢測結(jié)果Fig.10 Detection results of PCR sensitivity in pigs注:M:100 bp DNA Ladder;1:豬100 ng/μL;2:豬10 ng/μL; 3:豬1 ng/μL;4:豬100 pg/μL;5:豬10 pg/μL; 6:豬1 pg/μL;7:豬0.1 pg/μL;N:空白。

圖11 雞PCR靈敏性的檢測結(jié)果Fig.11 Detection results of PCR sensitivity in chicken注:M:100 bp DNA Ladder;1:雞100 ng/μL;2:雞10 ng/μL; 3:雞1 ng/μL;4:雞100 pg/μL;5:雞10 pg/μL; 6:雞1 pg/μL;7:雞0.1 pg/μL;N:空白。

3 討論與結(jié)論

牛肉是世界第三消耗肉品,約占肉制品市場的25%,含有極高的營養(yǎng)價值,但是市場上常有將低廉肉類代替或摻入牛肉制品的事件出現(xiàn),嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者權(quán)益,是我國食品質(zhì)量安全面臨的嚴(yán)峻問題之一[24]。本實(shí)驗(yàn)成功建立一種能夠同時檢測牛肉中摻入豬、雞源性成分的多重PCR檢測方法,能快速、準(zhǔn)確的篩查食品中動物來源成分。

本實(shí)驗(yàn)通過采用SDS-PK酶法提取DNA避免試劑毒害,提取DNA的濃度高、純度佳,并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明該方法提取DNA的效果穩(wěn)定,保證DNA模板的質(zhì)量。從而減少樣本交叉污染造成假陰性或假陽性的可能性。引物設(shè)計(jì)是整個研究的關(guān)鍵步驟,直接關(guān)系到目標(biāo)物種能夠?qū)崿F(xiàn)成功檢出。本實(shí)驗(yàn)選取牛種屬、豬種屬、雞種屬mtDNAcytb基因序列作為靶基因,利用MEGA7軟件對基因序列進(jìn)行序列同源性比較分析,尋找特異性SNP位點(diǎn),利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)物種特異性引物,使正反向引物3′端位均位于SNP位點(diǎn)上,并調(diào)整退火溫度均在在50～55 ℃范圍內(nèi)。能有效避免引物之間相互反應(yīng),形成引物二聚體,同時也避免引物間的相互干擾對目標(biāo)基因的擴(kuò)增產(chǎn)生影響。

本研究通過單重PCR反應(yīng)為基礎(chǔ),通過引物的特異性實(shí)驗(yàn),篩選出三對引物共同的退火溫度為52 ℃,在52 ℃時,擴(kuò)增出牛源性成分的的特異性片段149 bp,豬源性成分的特異性片段261 bp,雞源性成分的特異性片段554 bp,均沒有非特異性擴(kuò)增。在52 ℃時,對三對引物加入量進(jìn)行優(yōu)化,因?yàn)樵诙嘀豍CR擴(kuò)增時,在一個反應(yīng)體系中,加入等量的引物(1∶1∶1),引物之間存在相互抑制,會出現(xiàn)某一物種沒有條帶的現(xiàn)象,本實(shí)驗(yàn)通過反復(fù)篩選,調(diào)整引物量雞、豬、牛分別為0.2、0.8、0.6 μL時,擴(kuò)增出來的特異性條帶清晰明亮,無非特異性擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)。并且將模板DNA從微克及稀釋到皮克級時,仍可檢測出目標(biāo)物種的特異性擴(kuò)增條帶。并且以不同動物來源的混合DNA(包括牛、豬、雞)為模板分別擴(kuò)增牛、豬、雞引物,結(jié)果分別在149、261、554 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶,無非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn);然后以牛、豬、雞的混合引物來擴(kuò)增不同動物來源的模板DNA(牛、豬、雞除外)來進(jìn)行驗(yàn)證,均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,表明三對引物的特異性好。

本研究建立的動物源性多重PCR方法,可以同時、特異、準(zhǔn)確、快速鑒定出牛源性、豬源性、雞源性成分。同時檢測最低限為100 pg/μL。該方法提高了普通PCR的篩選通量,另外,與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)所使用的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)相比,本研究對試驗(yàn)試劑以及試驗(yàn)儀器要求均較低,便于推廣,且檢測成本較低。對于相關(guān)監(jiān)管部門的檢測具有較大的應(yīng)用價值,可在食品監(jiān)管中實(shí)現(xiàn)普及應(yīng)用。本研究為一次完成更多個物種的摻假檢測提供理論基礎(chǔ)。