中華蹄蓋蕨抗番茄潰瘍病菌活性物質(zhì)提取工藝優(yōu)化及其抑菌作用研究

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(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006; 2.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所,山西太原 030006)

中華蹄蓋蕨(Athyriumsinense)屬于真蕨目、蹄蓋蕨科、蹄蓋蕨屬,在我國(guó)的華北地區(qū)多有分布[1-3]。蹄蓋蕨屬包含蕨類植物160余種,是真蕨植物主要的藥用科屬之一。早有研究表明蹄蓋蕨屬的中華蹄蓋蕨具有驅(qū)蟲(chóng)、消腫、利尿、清熱解毒的功效[3]。番茄潰瘍病是目前番茄生產(chǎn)中危害性最為嚴(yán)重的病害之一,該病由密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種(番茄潰瘍病菌Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)感染番茄所致。番茄潰瘍病菌于幼苗期至坐果期均可侵染番茄,且一經(jīng)感染發(fā)病面積會(huì)訊速擴(kuò)展,導(dǎo)致番茄大量減產(chǎn)且品質(zhì)降低[4]。目前針對(duì)于番茄潰瘍病菌的抗菌藥物仍以化學(xué)殺菌劑為主[5],但化學(xué)殺菌劑在抑菌過(guò)程中存在藥物殘留和超標(biāo)問(wèn)題,同時(shí)還會(huì)破壞土壤平衡體系[6-8]。由于大眾食品安全意識(shí)的覺(jué)醒,人們不僅對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)要求有所提高,對(duì)農(nóng)產(chǎn)品生長(zhǎng)、成熟、運(yùn)輸過(guò)程中所施農(nóng)藥、激素等物質(zhì)的殘留也有所關(guān)注[9-10]。在解決病害的同時(shí),尋找更為安全、健康的殺菌劑是目前研究的趨勢(shì)。孟邵禮等[11]進(jìn)行了擬銀杏殺菌劑的研究,最終研發(fā)出了更為高效、安全、環(huán)保的擬銀杏抑菌劑并申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專利。因此,本研究以開(kāi)發(fā)植物源殺菌劑為出發(fā)點(diǎn),旨在研究一種新型、綠色、環(huán)保的抗番茄潰瘍病菌的植物源殺菌劑。

目前國(guó)內(nèi)外僅有少數(shù)學(xué)者對(duì)植物源活性物質(zhì)抗番茄潰瘍病菌的抑菌效果進(jìn)行了研究。楊鶴[12]和Govindappa等[13]分別對(duì)人參總皂苷和南美蟛蜞菊水提物的抗菌活性進(jìn)行了普查,結(jié)果表明二者對(duì)番茄潰瘍病菌均具有抑菌效果。張秀娟[14]測(cè)定了梓樹(shù)中抗菌活性物質(zhì)對(duì)多株病原菌的抑制作用,結(jié)果表明其對(duì)番茄潰瘍病菌有相對(duì)較弱的抑制效果。Kotan等[15]對(duì)牛至精油的抑菌活性進(jìn)行了廣譜抑菌篩查,結(jié)果表明牛至精油對(duì)番茄潰瘍病菌具有抑菌作用。可見(jiàn),目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物抑菌物質(zhì)抗番茄潰瘍病菌的研究?jī)H僅停留在抗菌活性普查這一階段,并未進(jìn)行進(jìn)一步深入探索。本課題組前期研究結(jié)果[16]表明中華蹄蓋蕨對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌有較強(qiáng)的抑菌作用。由于馬鈴薯環(huán)腐病菌與番茄潰瘍病菌同屬于棒狀細(xì)菌屬,課題組推測(cè)中華蹄蓋蕨對(duì)番茄潰瘍病菌也具有抑菌效果。

因此,本研究以番茄潰瘍病菌為供試菌,以中華蹄蓋蕨為材料,對(duì)其抗番茄潰瘍病菌活性物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并且分析該活性物質(zhì)對(duì)番茄潰瘍病菌體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、胞內(nèi)及胞外可溶性蛋白含量的影響,以期為中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)應(yīng)用于番茄潰瘍病菌的綠色防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華蹄蓋蕨(A.sinense) 由山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物實(shí)驗(yàn)室鑒定,采自山西省呂梁市龐泉溝自然保護(hù)區(qū);番茄潰瘍病菌(C.michiganensissubsp.michiganensis，cgmcc 1.1909) 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供;供試培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,吐溫-80 50 mg,牛肉膏2.0 g,酪蛋白氨基酸5.0 g,酵母提取物5.0 g,甘油2.0 g,麥芽提取物5.0 g,瓊脂15～20 g,蒸餾水1000 mL,pH=7.2) 以上試劑均為分析純,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2,7-二氫二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA)、可溶性蛋白檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程公司；二甲基亞砜(DMSO) 分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

F-280型熒光分光光度計(jì) 天津港東科技股份有限公司;JY92-Ⅱ超聲波破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;TGL-16G-C冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抑菌物質(zhì)提取工藝流程 中華蹄蓋蕨→反復(fù)清洗,置于暗處→自然晾干→粉碎成粉末→過(guò)50目篩→乙醇回流提取→過(guò)濾、合并濾液→減壓濃縮、干燥→得到干膏樣物質(zhì)

操作要點(diǎn):取一定量中華蹄蓋蕨,粉碎過(guò)50目篩,以乙醇為溶劑,在一定的料液比、一定溫度和一定時(shí)間下回流提取，干燥后(30 ℃下烘干)的粉末。提取液在2500 r/min下離心15 min。所得液體真空條件下減壓濃縮得到抑菌活性物質(zhì)。采用40%的DMSO將其溶解,使最終濃度達(dá)到20 mg/mL。各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下所得中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)的抑菌效果以其對(duì)番茄潰瘍病菌的抑菌圈直徑大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.2 活性物質(zhì)抑菌效果的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[17]采用平板打孔法進(jìn)行抑菌效果的檢測(cè),具體操作如下:將菌液均勻涂布于平板培養(yǎng)基上,每板打三個(gè)孔(直徑10 mm)。除去孔內(nèi)培養(yǎng)基,并向每孔內(nèi)加入各提取條件下所得活性物質(zhì)0.2 mL。設(shè)置對(duì)照組為每孔內(nèi)加入0.2 mL 40%的DMSO溶液。各處理組與對(duì)照組于28 ℃條件下培養(yǎng)24 h,測(cè)量每組抑菌圈的直徑。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 采用上述1.2.1法,固定提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為6 h,考察不同料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL對(duì)抑菌能力的影響;固定料液比為1∶10 g/mL、提取時(shí)間為6 h,考察不同提取溫度40、50、60、70、80、90 ℃對(duì)抑菌能力的影響;固定料液比為1∶10 g/mL、提取溫度為60 ℃,考察不同提取時(shí)間6、8、10、12、14 h對(duì)抑菌能力的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選用正交試驗(yàn)優(yōu)化中華蹄蓋蕨抑菌活性物質(zhì)的提取條件。選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素,每個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平,分別采用1、2、3進(jìn)行編碼,如表1所示。按照表2進(jìn)行L27(313)的正交試驗(yàn)。并按上述1.2.2法進(jìn)行抑菌效果的檢測(cè)。

表1 提取工藝的變量及水平Table 1 Extraction variables and levels

1.2.5 抑菌物質(zhì)對(duì)菌體活性氧水平的影響

1.2.5.1 待測(cè)樣品的制備 將上述正交試驗(yàn)最優(yōu)水平下的中華蹄蓋蕨提取物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至膏狀,加入到滅菌后的液體培養(yǎng)基中(以1% DMSO助溶),使活性物質(zhì)的終濃度分別達(dá)到0.24、0.18、0.12和0.06 mg/mL。向各樣品中均加入200 μL濃度為108CFU/mL的番茄潰瘍病菌懸液,150 r/min,28 ℃下置于搖床培養(yǎng)8 h。以僅加入1% DMSO,而不加入中華蹄蓋蕨提取物的番茄潰瘍病菌懸液為對(duì)照。

1.2.5.2 菌體活性氧水平的測(cè)定 培養(yǎng)8 h后,所有樣品在3000 r/min下離心5 min,棄去上清液,用磷酸緩沖液(PBS)調(diào)整其OD600為0.5。取各樣品2 mL,3000 r/min下離心5 min,棄去上清液,進(jìn)一步使樣品懸浮于500 μL濃度為20 μmol/L的2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)中,避光、室溫條件下孵育30 min。樣品洗滌2次后加入2 mL的PBS,吹散至均勻分布。取完成標(biāo)記的樣品液體100 μL,溶解到1 mL的PBS中。用F-280型熒光分光光度計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行活性氧水平的測(cè)定,以熒光強(qiáng)度表示[18]。具體參數(shù)設(shè)定為:λem為535 nm,λex為488 nm,二者狹縫均為5 nm。

1.2.6 抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)胞外可溶性蛋白的影響 按1.2.5.1進(jìn)行待測(cè)樣品的制備。各樣品培養(yǎng)8 h后,于8000 r/min下離心5 min。取上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行胞外可溶性蛋白含量檢測(cè)。其標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.2493x+0.3173(R2=0.9951)。

1.2.7 抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白的影響 按1.2.5.1進(jìn)行待測(cè)樣品的制備。各樣品培養(yǎng)8 h后,所有樣品在8000 r/min下離心5 min,棄去上清液,并用PBS調(diào)整其OD600為0.5。取各樣品2 mL,用超聲波破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎(200 W,超聲2 s,間隔4 s,共15 min)。用冷凍離心機(jī)以12000 r/min離心5 min,除去細(xì)胞碎片,按照試劑盒說(shuō)明書(shū),以上清液進(jìn)行胞內(nèi)可溶性蛋白含量檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組做三次平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。以SPSS 23.0軟件進(jìn)行ANOVA顯著性差異分析(P<0.05),用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

圖1A表明,中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)的抑菌能力隨料液比的加大,出現(xiàn)先上升后降低的現(xiàn)象。料液比為1∶5 g/mL時(shí),抑菌效果較差,抑菌直徑為14.74 mm。增加溶劑比例,抑菌能力增強(qiáng)。當(dāng)料液比為1∶15 g/mL時(shí),抑菌效果最強(qiáng),抑菌直徑達(dá)到24.87 mm。進(jìn)一步提高料液比,抑菌能力減弱。分析原因可能為,料液比過(guò)低時(shí),中華蹄蓋蕨粉末不能完全溶解于溶劑中,導(dǎo)致抑菌活性物質(zhì)無(wú)法完全提取出,抑菌效果較差。料液比高于1∶15 g/mL時(shí),增加的溶劑延長(zhǎng)了后期減壓濃縮的時(shí)間,活性物質(zhì)遭到破壞。因此根據(jù)差異顯著性分析結(jié)果(圖1A),選取三個(gè)抑菌效果較優(yōu)且有顯著差異(P<0.05)的料液比(g/mL)條件,即1∶10、1∶15、1∶20 g/mL進(jìn)行后續(xù)正交設(shè)計(jì)。

圖1 料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C) 對(duì)活性物質(zhì)抑菌效果的影響Fig.1 Effect of ratio of material to liquid(A),extraction temperature(B)and extraction time(C) on antibacterial effect of active substances注:以不同小寫(xiě)字母表示數(shù)值間 存在顯著差異,P<0.05；圖3～圖6同。

圖1B表明,中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)的抑菌能力隨提取溫度的升高而增強(qiáng)。差異顯著性分析表明,提取溫度在40、50 ℃時(shí),二者所得活性物質(zhì)的抑菌效果無(wú)顯著差異(P>0.05)。提取溫度在60、70 ℃時(shí),所得活性物質(zhì)的抑菌能力亦無(wú)明顯差別(P>0.05)。當(dāng)提取溫度為80、90 ℃時(shí),抑菌效果達(dá)到最佳且二者所得活性物質(zhì)的抑菌效果無(wú)顯著差異(P>0.05)。分析原因可能為,溫度較低時(shí),反應(yīng)體系內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)速度較慢,粒子間空隙較小,導(dǎo)致抑菌活性物質(zhì)無(wú)法完全提取出。溫度較高時(shí),反應(yīng)體系內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)速度較快,粒子間空隙較大,有利于抑菌活性物質(zhì)充分提出?？紤]到本實(shí)驗(yàn)中所用溶劑為乙醇溶液(沸點(diǎn)為78.15～78.5 ℃),當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí),加入沸石等其他防爆沸措施可妥善控制提取條件。但溫度超出乙醇沸點(diǎn)過(guò)多時(shí),反應(yīng)體系的穩(wěn)定性較難控制且溫度過(guò)高反應(yīng)條件下抑菌活性物質(zhì)極易分解,在工業(yè)生產(chǎn)中可行性較差。因此根據(jù)差異顯著性分析結(jié)果(圖1B),選取抑菌效果較優(yōu)且有顯著差異(P<0.05)的溫度條件(相同抑菌效果情況下以成本較低為選擇標(biāo)準(zhǔn)),即40、60、80 ℃進(jìn)行后續(xù)正交設(shè)計(jì)。

圖1C表明,中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)的抑菌能力隨提取時(shí)間的加大,出現(xiàn)先上升后降低的現(xiàn)象。提取時(shí)間6 h,活性物質(zhì)抑菌能力較差,抑菌直徑為16.02 mm。進(jìn)一步增加提取時(shí)間抑菌能力提高,當(dāng)時(shí)間為10 h時(shí),抑菌能力達(dá)到最大(P<0.05),抑菌直徑為25.72 mm。然而,繼續(xù)增加提取時(shí)間,抑菌能力顯著降低(P<0.05)。

表2 L27(313)正交設(shè)計(jì)Table 2 L27(313)orthogonal design

注:抑菌圈直徑等于10 mm,表示沒(méi)有抑菌效應(yīng)。

分析原因可能為,較短的提取時(shí)間無(wú)法充分提取出抑菌活性成分。提取時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)(t>10 h),部分活性成分降解,抑菌能力減弱。因此根據(jù)差異顯著性分析結(jié)果(圖1C),選取三個(gè)抑菌效果較優(yōu)且有顯著差異(P<0.05)的時(shí)間條件,即8、10、12 h進(jìn)行后續(xù)正交設(shè)計(jì)。

2.2 抑菌物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

本研究采用L27(313)正交設(shè)計(jì)表對(duì)料液比、提取時(shí)間、提取溫度三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),以考察各因素及各因素間的相互作用對(duì)中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)抑菌效應(yīng)的影響并分析出最佳提取工藝。表2給出了料液比、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)影響因素的不同提取條件下中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)對(duì)番茄潰瘍病菌的抑菌效果。直觀分析如下,不同提取條件下中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)對(duì)番茄潰瘍病菌的抑制效果表現(xiàn)出明顯差異,其抑菌圈直徑數(shù)值變動(dòng)范圍介于18.05～28.73 mm之間,二者的差值為10.68 mm,最大值約為最小值的1.6倍。直觀分析結(jié)果說(shuō)明,中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)抑菌圈直徑大小與其提取條件密切相關(guān)。因此,欲獲得具有高效抑菌能力的活性物質(zhì),優(yōu)化提取條件十分重要。極差表示各因素及因素間交互作用對(duì)提取液抑菌效果影響的主次順序。極差越大,影響越強(qiáng),通常起主要作用;極差越小,影響越弱,通常起次要作用;表2表明,料液比(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)所產(chǎn)生的極差值(R)分別為:2.59、7.15和0.65。A×B、A×C、B×C所產(chǎn)生的R值分別為:1.52、0.95、0.38。因而,不同因素和因素間交互作用影響抑菌效應(yīng)的順序?yàn)?B>A>A×B>A×C>C>B×C。

本研究考慮到各因素和因素間的相互作用對(duì)中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)抑菌效應(yīng)的影響。在方差分析過(guò)程中,需要把三個(gè)因素及其相互作用對(duì)應(yīng)列的均方差與誤差列均方差進(jìn)行比較,將其中小于2倍誤差列均方差的作用列求得的變差平方和合并進(jìn)誤差列的變差平方和,重新進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。如表3,所考查的三個(gè)工藝條件因素中,料液比和提取溫度對(duì)中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)的抑菌強(qiáng)度均有極顯著影響(F=51.60>F0.01(2,16)=6.23;F=312.90>F0.01(2,16)=6.23),而提取時(shí)間對(duì)活性物質(zhì)抑菌強(qiáng)度的影響不顯著(F=2.89F0.05(4,16)=3.01),而提取溫度與提取時(shí)間、提取時(shí)間與料液比間的交互作用可忽略不計(jì)。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

由圖2可知,料液比(A)的最優(yōu)水平為A1,提取溫度(B)的最優(yōu)水平為B3。方差分析表明提取溫度和料液比間交互效應(yīng)對(duì)抑菌直徑有顯著影響(表3),進(jìn)一步確定A、B因素間不同水平如何組合對(duì)于獲得高效抑菌活性物質(zhì)十分重要。因而,將此二者不同水平組合下的抑菌效果做出分析(圖2)。A1B3組合下的抑菌圈直徑平均值為27.65 mm,優(yōu)于其它水平組合的抑菌效果,為最佳水平組合,與直觀分析結(jié)果一致。由于方差分析結(jié)果(表3)表明提取時(shí)間對(duì)中華蹄蓋蕨提取物抑菌強(qiáng)度的影響不顯著,基于經(jīng)濟(jì)、效率、可行等方面考慮最終確定優(yōu)選工藝條件為A1B3C1,即提取比例1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間8 h,抑菌圈直徑為27.33 mm(表2)。此工藝所得抑菌圈直徑數(shù)值僅次于提取比例1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間10 h條件下所得抑菌圈直徑數(shù)值(28.73 mm,表2)。然而,差異顯著性分析結(jié)果表明二者間并無(wú)顯著性差異(圖3,P>0.05)。由于提取時(shí)間縮短,可進(jìn)一步節(jié)約成本。故生產(chǎn)上可采用提取比例1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間8 h的工藝進(jìn)行提取。該提取條件具有操作簡(jiǎn)便,效果明顯的特點(diǎn)。

圖2 料液比(A)和提取溫度(B) 相應(yīng)水平組合下的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activities of different material to liquid(A) and extraction temperature(B)combinations

圖3 A1B3C1和A1B3C2提取條件下抑菌效果Fig.3 The antibacterial effects under the conditions of A1B3C1 and A1B3C2注:對(duì)照為40% DMSO的抑菌效果;抑菌圈直徑 等于10 mm,表示沒(méi)有抑菌效應(yīng)。

2.3 抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

ROS通常指一類細(xì)胞內(nèi)的含氧化合物[19]。當(dāng)外施藥物、或其他極端環(huán)境刺激下[20-21],細(xì)菌釋放的ROS量迅速升高,出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象,造成細(xì)胞內(nèi)多數(shù)大分子物質(zhì)損傷,進(jìn)而達(dá)到殺滅細(xì)菌的效果[22-24]。

本研究采用DCFH-DA法測(cè)定菌體內(nèi)ROS水平。與傳統(tǒng)ROS測(cè)定方法相比,選用該種方法便于實(shí)驗(yàn)操作,效果明顯且能夠降低實(shí)驗(yàn)成本[25]。DCFH-DA的本質(zhì)為脂溶性探針,具有可穿過(guò)細(xì)胞膜的特性,且其自身不發(fā)熒光。DCFH-DA穿過(guò)細(xì)胞膜后可產(chǎn)生不能透過(guò)細(xì)胞膜的2,7-二氯氫化熒光素(DCFH)。圖4反映了不同濃度中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)對(duì)番茄潰瘍病菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。如圖4所示,與對(duì)照組相比,在加入中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)濃度分別為0.06、0.12、0.18 mg/mL時(shí),處理組ROS水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。說(shuō)明當(dāng)濃度低于0.18 mg/mL時(shí),番茄潰瘍病菌自身清除活性氧的能力仍可以使菌體內(nèi)的ROS水平保持平衡。持續(xù)升高處理液濃度,當(dāng)加入活性物質(zhì)濃度為0.24 mg/mL時(shí),ROS水平顯著(P<0.05)升高。Becerra等[26]研究表明,ROS的大量產(chǎn)生是細(xì)菌死亡的重要因素。因此,0.24 mg/mL的中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)可能使番茄潰瘍病菌本身代謝產(chǎn)生的ROS超出了菌體自身清除活性氧能力的范圍,導(dǎo)致細(xì)胞積累大量的ROS,損傷細(xì)胞內(nèi)蛋白,達(dá)到殺滅細(xì)菌的效果。這一研究結(jié)果與何芳[24]對(duì)苦豆子堿、苦參堿作用于產(chǎn)膜表皮葡萄球菌后菌體內(nèi)ROS水平變化一致。

圖4 不同濃度中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)作用后 番茄潰瘍病菌內(nèi)ROS的水平Fig.4 Reactive oxygen species(ROS)levels in Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis treated with different concentrations of active substances from Athyrium sinense注：對(duì)照組中不加入中華蹄蓋蕨活性物質(zhì) 僅加入體積分?jǐn)?shù)為1%的DMSO，圖5～圖6同。

2.4 抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)胞外蛋白含量的影響

細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的選擇性輸送及重要生化代謝的進(jìn)行都離不開(kāi)細(xì)胞膜的作用和支持[27]。當(dāng)細(xì)胞膜完整性遭到破壞時(shí),其對(duì)物質(zhì)的選擇性運(yùn)輸也會(huì)受到影響。此時(shí),細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)外漏,影響了細(xì)菌的正常代謝,從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[28]。

不同濃度中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)處理番茄潰瘍病菌后,泄露于菌體外的蛋白質(zhì)含量如圖5所示。未經(jīng)活性物質(zhì)處理時(shí),檢測(cè)到菌體外有極少量的蛋白質(zhì)存在。持續(xù)提高活性物質(zhì)的濃度,與對(duì)照組相比,泄露于菌體外的蛋白質(zhì)含量顯著(P<0.05)增加。但當(dāng)處理液濃度為0.06、0.12、0.18 mg/mL時(shí),三個(gè)處理組間胞外蛋白含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。繼續(xù)增加處理液濃度為0.24 mg/mL時(shí),菌體外蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大為0.33 mg/mL,且與其他處理組間存在顯著(P<0.05)差異。這一研究結(jié)果與劉夢(mèng)茵等[29]使用烏梅提取物作用于蠟狀芽孢桿菌后胞外蛋白含量變化一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著活性物質(zhì)濃度的增加,胞內(nèi)蛋白質(zhì)外漏的程度增強(qiáng),細(xì)胞膜通透性變大,影響了細(xì)菌的正常代謝。

圖5 不同濃度中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)作用后 番茄潰瘍病菌細(xì)胞外蛋白含量Fig.5 Extracellular protein contents of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis treated with different concentrations of active substances from Athyrium sinense

2.5 抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白含量的影響

胞內(nèi)蛋白質(zhì)是細(xì)胞結(jié)構(gòu)及酶系的重要組成成分,與核酸、無(wú)機(jī)離子等其他物質(zhì)共同組成細(xì)胞內(nèi)容物。細(xì)胞內(nèi)容物的完整性是其維持正常生理代謝的前提[30-31]。圖6反映了中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)對(duì)番茄潰瘍病菌細(xì)胞內(nèi)蛋白含量的影響。與對(duì)照組相比,經(jīng)中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)處理后的細(xì)胞內(nèi)蛋白含量顯著(P<0.05)降低。當(dāng)提取液濃度為0.06、0.12、0.18 mg/mL時(shí),三個(gè)處理組間胞內(nèi)蛋白含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。繼續(xù)增加處理液濃度為0.24 mg/mL時(shí),菌體外蛋白質(zhì)含量達(dá)到最小,為0.48 mg/mL。說(shuō)明當(dāng)?shù)蜐舛戎腥A蹄蓋蕨活性物質(zhì)作用于菌體時(shí),就可以使胞內(nèi)蛋白大量減少。分析其原因,中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)極有可能從兩方面作用于番茄潰瘍病菌的胞內(nèi)蛋白。一方面,活性物質(zhì)導(dǎo)致番茄潰瘍病菌細(xì)胞膜受到損壞,胞內(nèi)蛋白質(zhì)大量外漏。另一方面,活性物質(zhì)從破壞的細(xì)胞膜進(jìn)入番茄潰瘍病菌內(nèi)部,直接作用于胞內(nèi)大分子蛋白質(zhì),導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量顯著減少。這一蛋白含量變化結(jié)果與張赟彬等[28]對(duì)肉桂醛作用下大腸桿菌和金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白含量變化一致。

圖6 不同濃度中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)作用后 番茄潰瘍病菌細(xì)胞內(nèi)蛋白含量Fig.6 Intracellular protein contents in Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis treated with different concentrations of active substances from Athyrium sinense

通過(guò)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量、細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,推測(cè)中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)可以促使細(xì)菌產(chǎn)生的ROS含量劇增,從而破壞菌體自身清除活性氧能力與菌體內(nèi)產(chǎn)生ROS的平衡。同時(shí)過(guò)量的ROS也會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的損傷,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量減少,細(xì)胞外蛋白質(zhì)含量增加的現(xiàn)象,最終導(dǎo)致番茄潰瘍病菌的死亡。

3 結(jié)論

本研究從“食品安全”的指導(dǎo)思想出發(fā),以獲得高效抗番茄潰瘍病菌的植物源活性物質(zhì)為目的,以中華蹄蓋蕨為材料,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行了提取條件的優(yōu)化及抗菌指標(biāo)的測(cè)定。優(yōu)化過(guò)程中考察了三個(gè)與提取抑菌活性物質(zhì)密切相關(guān)的因素,采用考慮到交互作用的多因素多水平正交試驗(yàn),最終確定優(yōu)選提取條件為:料液比1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間8 h,此時(shí)的抑菌直徑為27.33 mm。采用優(yōu)化后的提取條件,有利于提取到中華蹄蓋蕨中更高效的抑菌活性物質(zhì),獲取更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。另外,通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞外蛋白質(zhì)含量三個(gè)指標(biāo)的變化,可推測(cè)中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)極有可能通過(guò)刺激菌體內(nèi)ROS的釋放,同時(shí)破壞菌體細(xì)胞壁,增加細(xì)胞膜的通透性,減少細(xì)胞內(nèi)蛋白含量來(lái)抑制番茄潰瘍病菌的生長(zhǎng),造成其死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為中華蹄蓋蕨活性物質(zhì)應(yīng)用于番茄潰瘍病菌的綠色防治及番茄的食用安全提供新的途徑。