血液腫瘤PDX模型的構(gòu)建及應(yīng)用進(jìn)展*

張華青綜述，何遠(yuǎn)橋，李 菲△審校

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，南昌 330006；2.南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心，南昌 330006)

人源腫瘤異種移植(patient-derived tumor xenograft，PDX)模型是將患者來(lái)源的原發(fā)性腫瘤直接移植到免疫缺陷小鼠的體內(nèi)而形成的移植瘤模型，依靠動(dòng)物提供的環(huán)境保留人原代腫瘤的關(guān)鍵特征，如組織病理學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)等；這些特征可以通過(guò)小鼠之間的連續(xù)傳代保留[1]，因此PDX模型為癌癥患者提供了開(kāi)發(fā)抗癌療法和研究個(gè)性化藥物的工具[2]。研究表明PDX模型在移植和傳代擴(kuò)增過(guò)程中不會(huì)改變腫瘤特性，傳代到第三、四代的腫瘤組織和原代腫瘤能夠保持高度一致性并具有一定的穩(wěn)定性，且大多提倡使用低傳代數(shù)(<10)的PDX模型來(lái)保持親代腫瘤的遺傳完整性[2-3]。PDX模型采用一個(gè)模型對(duì)應(yīng)一個(gè)患者的模式，更直觀地反映個(gè)體間腫瘤的差異性；同時(shí)與傳統(tǒng)模型相比，能更好地反映臨床患者的實(shí)際病情變化，而且藥物篩查結(jié)果與臨床結(jié)果具有較高的匹配度[4]。PDX模型的這些特征為腫瘤患者患病機(jī)制的研究和藥物篩選提供了良好的基礎(chǔ)條件，利用PDX模型庫(kù)及其醫(yī)療數(shù)據(jù)庫(kù)可以更加準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)新型藥物的臨床前療效和藥物毒性，也為藥企提供更貼近臨床的新藥轉(zhuǎn)化研究途徑。

近年來(lái)PDX模型逐漸運(yùn)用于血液腫瘤的治療，為腫瘤個(gè)性化用藥提供指導(dǎo)[5]，為實(shí)現(xiàn)血液腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療奠定基礎(chǔ)。本文將就PDX模型在血液腫瘤中的構(gòu)建及應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 血液腫瘤PDX模型的構(gòu)建

1.1 小鼠品系的選擇 (1)Nude小鼠又稱裸鼠，無(wú)毛、胸腺，缺乏成熟T細(xì)胞，但是B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)功能正常。血液腫瘤PDX模型較難在此類小鼠構(gòu)建成功，但是也有少數(shù)惡性程度高的血液腫瘤可在皮下成瘤。(2)重度聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠[6]T、B細(xì)胞缺失，但巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞功能處于正常水平。(3)非糖尿病性肥胖/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠不僅具有T、B細(xì)胞功能缺陷，而且NK細(xì)胞和結(jié)合補(bǔ)體的能力弱，具有更高的免疫缺陷程度[7-8]。(4)缺乏白細(xì)胞介素2受體γ鏈(IL-2Rγ)基因的NOD/SCID小鼠稱為NSG小鼠[9]，缺乏成熟T、B細(xì)胞，NK細(xì)胞的活性幾乎喪失，機(jī)體免疫功能嚴(yán)重降低，是目前國(guó)際公認(rèn)的免疫缺陷程度最高的小鼠，對(duì)人源組織、細(xì)胞幾乎沒(méi)有排斥。小鼠免疫功能缺陷使移植入體內(nèi)的腫瘤組織、細(xì)胞不產(chǎn)生免疫排斥作用，建模更易成功。一般來(lái)說(shuō)，小鼠的免疫缺陷程度越高，移植瘤成活率越高。NSG小鼠雖然是免疫缺陷程度最高的小鼠，但價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)條件要求更嚴(yán)格，一般不作為首選實(shí)驗(yàn)對(duì)象。研究表明NOD/SCID小鼠體內(nèi)雖然保留較弱的NK細(xì)胞功能，但是成瘤率相對(duì)較高，是目前血液腫瘤移植的較理想模型[8]。

1.2 小鼠年齡及性別的選擇 構(gòu)建血液腫瘤模型一般多選用4～12周齡的小鼠，也會(huì)用1～3 d的新生鼠[10]。動(dòng)物性別的選擇取決于實(shí)驗(yàn)的研究目的和性激素對(duì)于實(shí)驗(yàn)藥物、檢測(cè)指標(biāo)等是否存在明顯的影響。為避免處理因素對(duì)單一性別的影響，一般采用雌雄各半的原則。另外因?yàn)榇萍に赜幸欢ǖ拿庖弑Ｗo(hù)作用，在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)多選雌鼠[7,11]。

1.3 小鼠的預(yù)處理 在移植前對(duì)小鼠進(jìn)行免疫抑制預(yù)處理來(lái)提高模型成瘤率，處理的方式包括全身輻照(成年鼠1～1.5 Gy、新生鼠2～4 Gy)、注射用細(xì)胞毒藥物如環(huán)磷酰胺等。由于NSG小鼠NK細(xì)胞功能幾乎喪失，無(wú)預(yù)處理的情況下NSG小鼠中腫瘤的移植成功率也很高[9]。

1.4 腫瘤移植方式及部位 (1)異位移植：皮下接種是最常見(jiàn)的異位移植部位，將腫瘤切成1～4 mm3的小碎片植入小鼠背側(cè)皮下。具有操作簡(jiǎn)單、局部成瘤快、成瘤率高、易觀察腫瘤生長(zhǎng)位置的優(yōu)點(diǎn)，也能更簡(jiǎn)單直觀地觀察和測(cè)量腫瘤大小，但此類模型與臨床患者實(shí)際情況存在較大差異[2,12-14]。肝內(nèi)注射及腎包膜下移植也是血液腫瘤常用的異位移植部位，此處血管豐富，不僅能顯著提高模型的成瘤率，還可以縮短成瘤周期[10,15-16]。但是手術(shù)技術(shù)要求高，對(duì)小鼠的損傷大，增加了小鼠感染的概率。(2)原位移植：通過(guò)ficoll密度梯度離心法將患者骨髓或外周血分離的單個(gè)核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞經(jīng)尾靜脈或骨內(nèi)注射至小鼠體內(nèi)，接種細(xì)胞數(shù)量106～108個(gè)[9-10,17]，腫瘤可通過(guò)小鼠提供的生長(zhǎng)微環(huán)境經(jīng)血液循環(huán)擴(kuò)散至全身并局部浸潤(rùn)靶器官，更準(zhǔn)確地模擬臨床患者體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)特點(diǎn)[18-19]。因此原位移植被認(rèn)為比異位移植更具有移植優(yōu)勢(shì)[2]，但是原位移植模型觀察腫瘤生長(zhǎng)情況不易，需要更高要求的監(jiān)測(cè)手段，給小鼠做成像技術(shù)來(lái)驗(yàn)證腫瘤是否成功移植入體內(nèi)，如外周血涂片、骨髓涂片、流式細(xì)胞分析等[12]。另外，原位模型的移植成功率相對(duì)較低且耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。

1.5 其他影響因素 一般來(lái)說(shuō)移植的腫瘤細(xì)胞惡性程度越高，建模成功率也越高。在將腫瘤移植到小鼠體內(nèi)之前，可與基質(zhì)膠混合，為腫瘤生長(zhǎng)提供更高的生長(zhǎng)效率，提高移植成功率[18]。

2 PDX在血液腫瘤中的應(yīng)用進(jìn)展

常見(jiàn)的血液腫瘤包括白血病、多發(fā)性骨髓瘤(MM)和淋巴瘤等，可以為耐藥復(fù)發(fā)及難治性臨床患者建立對(duì)應(yīng)的小鼠模型，為患者篩選出最適合的治療方案，為臨床治療提供參考意見(jiàn)。

2.1 PDX模型在白血病患者中的應(yīng)用 化療方案的不斷優(yōu)化極大地提高了白血病患者的治愈率，然而部分具有遺傳異?；螂y治復(fù)發(fā)的患者在進(jìn)行常規(guī)藥物化療后仍預(yù)后不良[18,20]。WANG等[21]將來(lái)自急性白血病(acute leukemia，AL)患者的160個(gè)標(biāo)本經(jīng)尾靜脈途徑移植到NSG小鼠中，成功建立119個(gè)AL PDX模型，對(duì)374個(gè)基因和265個(gè)易重排的RNA進(jìn)行靶向測(cè)序，強(qiáng)調(diào)了PDX模型和患者基因組圖譜的重要性。MIN等[22]通過(guò)建立皮下荷瘤鼠模型，驗(yàn)證了組蛋白去乙?；?和2(HDAC1/2)選擇性抑制劑與阿扎胞苷(azacitidine)在急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)治療中具有協(xié)同作用。PASSARO等[23]通過(guò)將AML患者的腫瘤細(xì)胞經(jīng)尾靜脈成功移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)一氧化氮(NO)抑制劑不僅可以降低AML PDX模型中的血管通透性提高化療效率，還可以維持正常造血干細(xì)胞功能(HSC)，保護(hù)正常的殘余HSC。MUNCH等[24]通過(guò)建立兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白血病血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)高表達(dá)并介導(dǎo)ALL腫瘤細(xì)胞進(jìn)入CNS，同時(shí)發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗可捕獲VEGF。這不僅強(qiáng)調(diào)VEGF在介導(dǎo)CNS疾病中的作用，而且為控制CNS白血病提供了新的治療策略。

2.2 PDX模型在多發(fā)性骨髓瘤患者中的應(yīng)用 MM是一種惡性漿細(xì)胞病，特點(diǎn)在于惡性漿細(xì)胞的克隆性增殖并分泌單克隆免疫球蛋白或其片段(M蛋白)，使造血功能受損，并導(dǎo)致以骨質(zhì)疏松、局灶溶解性病變、病理性骨折和高鈣血癥為特征的溶骨破壞[25]。近年來(lái)臨床治療方案不斷優(yōu)化，但MM仍然無(wú)法治愈[26]，仍需要探索新的治療手段。骨髓微環(huán)境對(duì)MM細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用，PDX模型為其保留了生長(zhǎng)的微環(huán)境。但是MM細(xì)胞屬于終末階段的細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，成為MM建模的主要影響因素。PILARSKI等[27]通過(guò)將患者的外周血或胸腔積液分離腫瘤細(xì)胞后經(jīng)心內(nèi)(IC)或骨內(nèi)(IO)途徑注射到NOD/SCID小鼠中，小鼠最終出現(xiàn)骨質(zhì)破壞和紅骨髓的損失，在脾內(nèi)及骨髓中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，成功建立了MM PDX模型。PDX模型準(zhǔn)確地反映了MM的大部分臨床特征，且被證實(shí)可以用于檢測(cè)抗腫瘤和抗骨質(zhì)破壞藥物的療效[25]。

2.3 PDX模型在淋巴瘤中的應(yīng)用 PDX模型在淋巴瘤中也有很大的應(yīng)用前景，通過(guò)模型進(jìn)行藥物篩選為患者帶來(lái)希望。最近的研究表明，PDX是評(píng)估新藥反應(yīng)最穩(wěn)定的模型，可用于預(yù)測(cè)治療方案的臨床療效。淋巴瘤是最常見(jiàn)的血液惡性腫瘤，由于淋巴系統(tǒng)的分布特點(diǎn)使得淋巴瘤屬于全身性疾病，幾乎可以侵犯全身任何組織和器官[28-29]。ZHANG等[28]通過(guò)建立16例B細(xì)胞淋巴瘤PDX模型對(duì)BTK抑制劑依魯替尼的原發(fā)性和獲得性耐藥進(jìn)行了研究，同時(shí)還建立了對(duì)依魯替尼耐藥的模型，闡明依魯替尼耐藥的機(jī)制并確定克服耐藥性的藥物治療方法，為個(gè)性化治療B細(xì)胞淋巴瘤患者提供基礎(chǔ)條件。CORSO等[30]通過(guò)建立淋巴瘤PDX模型，提出利妥昔單抗可以減緩疾病的進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)均表明PDX模型為患者提供了更準(zhǔn)確地治療方案和更堅(jiān)實(shí)的臨床前基礎(chǔ)[31]。另外，在建立淋巴瘤PDX模型過(guò)程中發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射的移植成功率較低。因此TOWNSEND等[32]在腎包膜下移植淋巴瘤組織，成功率達(dá)30.2%，在一些惡性程度較低的淋巴瘤建模中起到了積極作用。

3 PDX模型與免疫治療

免疫療法的興起如：嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(CAR-T)給患者帶來(lái)治愈疾病的新希望，抗B細(xì)胞抗原的單克隆抗體包括CD 22和CD 19在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出了很好的實(shí)驗(yàn)療效，同時(shí)針對(duì)CD19的CAR-T細(xì)胞在經(jīng)過(guò)大量預(yù)處理的ALL或CLL患者中也顯示出明顯的臨床療效[33]。然而腫瘤通過(guò)靶抗原的下調(diào)產(chǎn)生逃逸作用，靶細(xì)胞發(fā)生脫靶效應(yīng)，使患者治療效果差、預(yù)后不良。ZAH等[11]為了解決CD19 CAR-T細(xì)胞抗原逃逸的問(wèn)題，通過(guò)體外和體內(nèi)驗(yàn)證了當(dāng)CD19表達(dá)喪失時(shí)，CD19-OR-CD20 CAR可以通過(guò)CD20靶向惡性B細(xì)胞來(lái)防止抗原逃逸的問(wèn)題。另外，CAR-T療法在腫瘤細(xì)胞清除的過(guò)程中伴隨著大量的細(xì)胞因子釋放，細(xì)胞因子水平顯著提高造成細(xì)胞因子風(fēng)暴(CRS)，癥狀可以從輕微的流感樣癥狀到休克甚至多系統(tǒng)器官衰竭，這無(wú)論對(duì)患者還是對(duì)醫(yī)生來(lái)說(shuō)都是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。利用PDX模型貼近臨床患者情況的優(yōu)勢(shì)與CAR-T療法相結(jié)合，檢驗(yàn)CAR-T的療效并找到解決不良反應(yīng)的方法。另外為缺乏這些抗原的白血病如：急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)[27]探索新的治療方案。

4 PDX模型的局限和挑戰(zhàn)

PDX模型保留了人原代腫瘤的異質(zhì)性并為腫瘤提供生長(zhǎng)微環(huán)境，在腫瘤研究領(lǐng)域是較理想的模型，但仍存在局限性和挑戰(zhàn)性。首先，PDX建模耗時(shí)較長(zhǎng)，用于臨床前研究的PDX模型通常需要2～8個(gè)月，模型不能完全與患者病情進(jìn)展同步，難以針對(duì)患者個(gè)性化治療的實(shí)時(shí)情況進(jìn)行觀察比較。第二，血液腫瘤的PDX模型相對(duì)于其他大部分實(shí)體腫瘤而言，建模成功率相對(duì)較低，應(yīng)努力提高建模成功率。第三，PDX模型缺乏人體的正常免疫環(huán)境及相應(yīng)的免疫靶點(diǎn)，所以對(duì)免疫抑制藥物實(shí)驗(yàn)有一定限制，這也是該模型的一大缺陷。第四，建模是一項(xiàng)成本較高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，特別是在血液腫瘤方面，要求建模的鼠種免疫缺陷程度高，一般選用NOD/SCID小鼠；若是經(jīng)費(fèi)充足的情況下建議使用免疫缺陷程度更高的NSG小鼠，以保證更高的建模成功率。第五，人體基質(zhì)和免疫細(xì)胞在模型傳代過(guò)程中會(huì)不斷損耗，植入的腫瘤中包含的人體基質(zhì)很快會(huì)被鼠基質(zhì)取代。因此在經(jīng)過(guò)3～5次傳代后，腫瘤基質(zhì)本質(zhì)上是鼠基質(zhì)。這種新的鼠基質(zhì)可能導(dǎo)致腫瘤旁分泌調(diào)節(jié)及間質(zhì)等物理性質(zhì)的改變，可能會(huì)限制針對(duì)該腫瘤區(qū)室的藥物研究，也將會(huì)限制腫瘤微環(huán)境和轉(zhuǎn)移等相關(guān)性研究[1]。

5 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，PDX模型已經(jīng)成為血液腫瘤研究的有利工具，理想的PDX模型不僅可以保留原始腫瘤的生長(zhǎng)微環(huán)境，而且其疾病進(jìn)展和對(duì)藥物的反應(yīng)與患者的結(jié)果具有高度一致性。目前血液腫瘤PDX模型成瘤率較低，且原位移植檢測(cè)成瘤手段較復(fù)雜。PDX模型所需的免疫缺陷小鼠價(jià)格昂貴，也限制了PDX模型的大規(guī)模應(yīng)用。其次，隨著免疫治療的推廣流行，可以將CAR-T治療與PDX模型結(jié)合，檢測(cè)免疫治療的臨床前療效及不良反應(yīng)。這對(duì)血液腫瘤新藥研發(fā)和作用機(jī)制研究具有重要意義，促進(jìn)其研究結(jié)果向臨床轉(zhuǎn)化，推進(jìn)血液腫瘤向個(gè)性化治療轉(zhuǎn)變。