結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型研究進(jìn)展*

喬大偉 李玉芳 李勝男 肖 云 姜禮雙 孔桂美 卜 平,3

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225001)(2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病重點(diǎn)防治實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225001) (3.江蘇省蘇北人民醫(yī)院消化內(nèi)科，揚(yáng)州 225001)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球第三大癌癥和癌癥死亡的第四大原因[1]。近年來(lái)我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈逐步上升趨勢(shì), 結(jié)直腸惡性腫瘤在腫瘤發(fā)病率中占據(jù)第5位[2]。肝臟是CRC最常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移(colorectal cancer liver metastases，CRLM)嚴(yán)重影響CRC預(yù)后。約15%～25%CRC病人在確診時(shí)即合并有肝轉(zhuǎn)移，另有15%～25%病人在行CRC原發(fā)灶根治術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，其中80%～90%肝轉(zhuǎn)移灶無(wú)法獲得根治性切除。且只有15%～20%CRLM患者適合手術(shù)切除,術(shù)后5年存活率僅為20%～40%。因此選擇合適的CRLM動(dòng)物模型，對(duì)研究CRC發(fā)生發(fā)展及肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制及正確評(píng)價(jià)各種治療方案的療效，提供與臨床應(yīng)用相關(guān)的證據(jù)等有重要作用。現(xiàn)將CRLM動(dòng)物模型的構(gòu)建方法綜述如下。

1 原位種植模型

CRC的原位種植模型根據(jù)植入的位置分為原位盲腸種植模型和原位直腸種植模型。

1.1 原位盲腸種植模型

原位盲腸種植模型包括癌細(xì)胞直接種植、直接縫合原位植入、盲腸接種OB醫(yī)用膠粘貼法、盲腸造疝原位接種法及結(jié)腸造口移植法等。Goodwin 和Huang[3]通過(guò)盲腸壁植入CT-26 FL3細(xì)胞建立原位CRLM模型，來(lái)評(píng)估藥物的抗癌功效，發(fā)現(xiàn)此種造模方法具有高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性。Tao 等[4]通過(guò)原位盲腸植入HCT-116細(xì)胞，建立原位盲腸種植模型，研究胃腸安(WCA)和5-氟尿嘧啶(5-FU)對(duì)腸癌和肝轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果單獨(dú)WCA治療降低轉(zhuǎn)移率(50%vs 100%，P<0.05)。WCA+5-FU聯(lián)合治療最有效，轉(zhuǎn)移率(40%vs 100%，P<0.01)。表明WCA與5-FU聯(lián)合治療會(huì)顯著抑制結(jié)腸腫瘤生長(zhǎng)和肝轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞直接種植盲腸，與臨床CRC血道和淋巴播散過(guò)程相近;直接縫合比較方便，能夠從整體上觀察CRC成瘤及轉(zhuǎn)移的情況，該模型是一種研究CRC發(fā)展及轉(zhuǎn)移的可靠、有效的觀察模型;盲腸接種OB醫(yī)用膠粘貼，癌組織和腸壁的吻合度較直接縫合先進(jìn)，應(yīng)用前景大;盲腸造疝接種法操作簡(jiǎn)單，成功率高，受其他臟器及腫瘤細(xì)胞影響較小，此法較少縫合到腸壁血管，避免腸壞死以及造成腸瘺等缺點(diǎn)；結(jié)腸造口種植模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存周期較長(zhǎng)，觀察時(shí)間充裕，但增加了感染的機(jī)會(huì)，容易影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2 原位直腸種植模型

原位直腸種植模型包括非手術(shù)經(jīng)肛門直腸注射法、肛門切開(kāi)直腸注射法及肛門直腸癌組織塊種植模型。非手術(shù)經(jīng)肛直腸注射法：麻醉后使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物直腸脫垂，在lO×和100×顯微鏡下將0.1 mL(2.5×104個(gè)/mL)的鼠源性腸癌細(xì)胞CT26注入距肛門>5 cm(超出肛管近端1～2 mm)的遠(yuǎn)端直腸黏膜內(nèi)，進(jìn)針深度為黏膜層下約1 mm,避免穿透腸壁。肛門切開(kāi)直腸黏膜層注射法：用兩個(gè)金屬夾夾緊小鼠肛門部直腸的前壁，在金屬夾之間剪開(kāi)長(zhǎng)6～7 mm直腸壁，再將腫瘤細(xì)胞懸液注射到直腸黏膜層內(nèi)。肛門直腸癌組織塊法：主要步驟用縫針輕輕破壞直腸壁，用6/0吸收線縫針把腫塊縫于該處。Wang等[5]采用自制接種器將0.1 mL細(xì)胞密度為2×107個(gè)/mL的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116接種于BALB/c裸鼠直腸上，成功建立原位移植性直腸動(dòng)物模型，直腸原位接種18只成瘤率為100%，未發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶。優(yōu)點(diǎn)：種植操作簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷較小,能更好地模擬結(jié)直腸癌的臨床生物學(xué)行為，比如腫瘤的局部生長(zhǎng)、腫瘤的浸潤(rùn)、癌細(xì)胞原位脫落穿過(guò)血管壁進(jìn)入門靜脈循環(huán)血運(yùn)轉(zhuǎn)移等過(guò)程。缺點(diǎn)：直腸壁較薄種植成功率較低，不易操作，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 異位種植模型

異位種植模型按植入位置不同可以分為脾臟種植、門靜脈/腸系膜種植、肝臟種植及腹腔擴(kuò)散種植。

2.1 脾臟種植模型

脾臟種植法是目前CRLM模型公認(rèn)的最佳模式之一。腫瘤細(xì)胞從脾內(nèi)種植，植入的細(xì)胞能避開(kāi)大量免疫細(xì)胞攻擊，通過(guò)血管浸潤(rùn)而發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。因此，能較好模擬人體內(nèi)CRC切除后肝臟轉(zhuǎn)移。根據(jù)是否切除脾臟分為脾臟保留法和脾臟切除法。

2.1.1脾臟保留法：在顯微外科鏡下,于小鼠左側(cè)腋后線肋緣下縱行切開(kāi)長(zhǎng)約0.5～1 cm創(chuàng)口，進(jìn)腹后找到柳葉狀脾臟并牽出腹腔外，用1 mL注射器吸取混懸好的單細(xì)胞液0.2～0.5 mL(細(xì)胞數(shù)約為1×106～1×107個(gè)/mL)，從脾下極進(jìn)針，緩慢注射(約2～3 min)入脾內(nèi)，注射區(qū)可見(jiàn)脾被膜變白隆起。緩慢拔針后酒精棉球按壓針眼,使瘤細(xì)胞得經(jīng)脾靜脈進(jìn)入肝臟，防止腫瘤外溢。查無(wú)出血后依次間斷縫合肌肉、皮膚，關(guān)腹。Fleten等[6]通過(guò)脾臟注射HT細(xì)胞株HT29和HCT116，在裸鼠中建立實(shí)驗(yàn)性肝轉(zhuǎn)移。注射后，HCT116和HT29細(xì)胞在所有動(dòng)物中產(chǎn)生肝腫瘤。Xu等[7]為了觀察ART1對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)或肝轉(zhuǎn)移的影響，成功構(gòu)建了BALB/c小鼠CT26細(xì)胞的脾移植腫瘤模型。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)施，且保留了脾臟部分免疫功能即保存了宿主固有的抗腫瘤免疫功能。缺點(diǎn)：肝臟轉(zhuǎn)移瘤形成的同時(shí)發(fā)生脾臟腫瘤，轉(zhuǎn)移灶常為散在癌結(jié)節(jié)，影響小鼠的存活時(shí)間，且脾臟腫瘤通常在肝轉(zhuǎn)移瘤前發(fā)生，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，不適于驗(yàn)證周期較長(zhǎng)的藥物實(shí)驗(yàn)。

2.1.2脾臟切除法：脾臟注入腫瘤細(xì)胞后，約5～10 min，待注射區(qū)蒼白隆起消失后結(jié)扎脾血管及胃短動(dòng)靜脈，切除脾臟，檢查無(wú)出血后逐層關(guān)腹。Fu 等[8]和Márquez 等[9]將CT-26細(xì)胞注入BALB/c小鼠脾囊并切除脾臟，成功建立了CRLM模型。Oshima等[10]建成了一組用熒光素酶和tdTomato穩(wěn)定標(biāo)記的HCT116人CRC細(xì)胞的單克隆衍生物，并具有不同的生長(zhǎng)特性。脾臟注射及脾切除術(shù)后，大部分克隆能夠產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移。該模型提供定量可視化肝臟中個(gè)體腫瘤克隆的發(fā)展的能力，并估計(jì)其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和定殖效率。優(yōu)點(diǎn)：更好地模擬了CRC根治術(shù)后因血行轉(zhuǎn)移而發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的過(guò)程，肝轉(zhuǎn)移率高，模型穩(wěn)定，轉(zhuǎn)移癌向各個(gè)肝葉呈彌漫性轉(zhuǎn)移?？梢詽M足各種檢測(cè)方法的取材需要。缺點(diǎn):腫瘤分泌降解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，形成偽足，浸潤(rùn)血管后進(jìn)入血液等關(guān)鍵步驟不能模擬。一定程度上令免疫系統(tǒng)受損，術(shù)后動(dòng)物死亡率高，操作較復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)者技術(shù)要求較高。主要應(yīng)用于研究腫瘤形成和分析新的治療效果及宿主免疫機(jī)能與癌細(xì)胞的關(guān)系。

2.1.3半脾模型：半脾模型為脾臟保留和脾臟全切的改良造模方法。Bai等[11]利用裸鼠脾臟特殊解剖結(jié)構(gòu)，建成CRLM半脾模型。用一次性鈦夾夾閉脾臟中央并切斷，分成兩個(gè)帶血管蒂的半脾。將HT29細(xì)胞接種到近端半脾被膜下，而遠(yuǎn)端半脾埋入皮下備治療。一共分6組制模，30 d后觀察肝轉(zhuǎn)移評(píng)分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血性腹水等情況。結(jié)果HT29細(xì)胞建立的CRLM半脾模型成瘤率為100%。優(yōu)點(diǎn):既保留了脾臟的部分免疫功能，又大大降低模型建立時(shí)脾臟腫瘤的干擾率。且此模型可以經(jīng)靜脈給藥，更加貼近于臨床，可應(yīng)用于CRLM的生物學(xué)機(jī)制和預(yù)防性肝轉(zhuǎn)移治療的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及抗腫瘤藥物的篩選。缺點(diǎn)在于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作相對(duì)復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)者技術(shù)要求極高。

2.2 門靜脈/腸系膜種植模型

門靜脈/腸系膜種植模型是將結(jié)直腸癌細(xì)胞懸液直接注射入門靜脈/腸系膜靜脈，隨靜脈回流至肝臟后發(fā)生轉(zhuǎn)移。操作要點(diǎn):取正中切口，使用小的鹽水紗條將腸管放至腹腔左側(cè)，顯露門靜脈或者回結(jié)腸靜脈，將濃度為1×105～1×107個(gè)/mL腫瘤懸液0.1 mL經(jīng)門靜脈緩慢注入，用棉簽壓迫注射部位數(shù)分鐘，防止注射部位出血及癌細(xì)胞外滲，造成小鼠死亡或腹腔種植。Bocuk等[12]通過(guò)小鼠門靜脈注射CMT-93細(xì)胞，成功構(gòu)建門靜脈小鼠腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，肝轉(zhuǎn)移率約70%～80%。優(yōu)點(diǎn)：腫瘤轉(zhuǎn)移速度較快，肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，有效模擬腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移，適用于腫瘤藥物的篩選。缺點(diǎn)：不能模擬腫瘤轉(zhuǎn)移全過(guò)程，減少原發(fā)瘤最初侵襲周圍組織及穿入血管等步驟，且手術(shù)操作難度大，手術(shù)中死亡率高。

2.3 肝臟種植模型

肝臟種植模型是將CRC細(xì)胞直接注射到肝臟中，或者在肝臟表面做一小切口，將大小為2 mm3左右的癌組織植入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)。White等[13]用29號(hào)針頭將密度為5×106個(gè)/mL CC-531細(xì)胞懸液注射入同基因WAG/Rij大鼠中肝葉的囊下，成功建立大鼠CRLM模型,發(fā)現(xiàn)24 h內(nèi)，所有植入細(xì)胞的大鼠肝臟都生長(zhǎng)腫瘤。優(yōu)點(diǎn)：腫瘤生長(zhǎng)速度快，轉(zhuǎn)移率高。操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。適用于藥物效果的評(píng)價(jià)。缺點(diǎn)：大部分在注射部位成瘤，周圍很少有轉(zhuǎn)移衛(wèi)星結(jié)節(jié)，不符合臨床上CRLM多發(fā)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。且只涉及CRC轉(zhuǎn)移的晚期過(guò)程，沒(méi)有涉及CRC原位生長(zhǎng)的演進(jìn)過(guò)程，與人體內(nèi)CRC轉(zhuǎn)移觀察模擬度較差，不適合CRC通過(guò)血道及淋巴道為主要轉(zhuǎn)移途徑的腫瘤模型制作。

2.4 腹腔擴(kuò)散種植模型

腹腔擴(kuò)散種植模型是將CRC細(xì)胞通過(guò)微型注射器直接注射入動(dòng)物腹腔內(nèi)，使其播散性生長(zhǎng)，引起腹水，解剖后觀察肝臟轉(zhuǎn)移或其他臟器轉(zhuǎn)移。若將帶瘤腹水移植到下一代動(dòng)物，則構(gòu)建腹水瘤動(dòng)物模型。Miyoshi等[14]通過(guò)將miR-139-5p轉(zhuǎn)染的Caco-2細(xì)胞注射入小鼠腹腔，結(jié)果具有較高的肝臟腹膜轉(zhuǎn)移率，成功建立CRC腹膜轉(zhuǎn)移小鼠模型。優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單，肝臟轉(zhuǎn)移率高。轉(zhuǎn)移周期短，短期內(nèi)可復(fù)制大量模型。缺點(diǎn)：沒(méi)有專一性器官轉(zhuǎn)移，僅僅模擬晚期腫瘤患者轉(zhuǎn)移途徑，對(duì)于淋巴轉(zhuǎn)移及血行轉(zhuǎn)移意義不大。該模型常用于癌癥晚期腹腔廣泛轉(zhuǎn)移和CRC術(shù)后腹腔種植播散的病理生理研究。

3 源于患者原代腫瘤組織的異種移植(Patient-derived tumor xenograft，PDTX)模型

PDTX模型指在手術(shù)期間獲得患者腫瘤組織直接移植或組織經(jīng)原代培養(yǎng)制成細(xì)胞懸液注射到免疫缺陷小鼠來(lái)構(gòu)建。由于該模型能保留原發(fā)腫瘤生物學(xué)特性，在抗腫瘤藥物機(jī)制研究發(fā)揮了重要作用[15]。常用于PDTX模型小鼠類型是裸鼠，SCID小鼠，NOD/SCID小鼠和NSG小鼠。最新報(bào)道B-NSG小鼠，綜合了NOD-SCID-IL2rg 背景特征，具有重度免疫缺陷表型，與NOD/SCID小鼠相比壽命更長(zhǎng)，平均長(zhǎng)達(dá)1.5 年；對(duì)人源細(xì)胞和組織幾乎沒(méi)有排斥反應(yīng)；少量細(xì)胞即可成瘤，依賴于細(xì)胞系或細(xì)胞類型；無(wú)B淋巴細(xì)胞泄漏，B-NSG小鼠是目前國(guó)際公認(rèn)的免疫缺陷程度最高、最適合人源細(xì)胞或組織移植的工具小鼠。Bettenworth等[16]使用內(nèi)窺鏡，在NOD/SCID小鼠結(jié)腸黏膜下注射HT-29細(xì)胞，注射后12 d發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤生長(zhǎng)，且肝轉(zhuǎn)移率28.6%，腹腔轉(zhuǎn)移率14.3%。Ye等[17]用TLR4 scramble或TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞通過(guò)注射到裸鼠皮下，成功建立裸鼠異種移植模型，肝轉(zhuǎn)移率較低。Leuci等[18]用患者肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)獲得轉(zhuǎn)移性CRC樣品。處理后并植入2只不同的4至6周齡雌性NOD/SCID小鼠中。腫瘤形成后，傳代并擴(kuò)增2代，直到產(chǎn)生32只小鼠。成功建立了患者來(lái)源的CRLM小鼠腫瘤移植模型，認(rèn)為PDTX模型可能為預(yù)測(cè)癌癥進(jìn)展提供有效的臨床前工具，可用于進(jìn)一步進(jìn)行個(gè)性化治療的基因組學(xué)和藥理學(xué)研究。Prall等[19]從手術(shù)室收到腸癌新鮮的標(biāo)本，將小立方體(約3 mm3)從皮下異種移植入NSG小鼠，研究CRC轉(zhuǎn)移性相關(guān)的腫瘤出芽和足底形成。優(yōu)點(diǎn)：更準(zhǔn)確地反映腫瘤生物學(xué)，細(xì)胞復(fù)合物和結(jié)構(gòu)，包括基質(zhì)細(xì)胞，更好地反映了原始腫瘤的特征和遺傳多樣性，可以反映每個(gè)患者的特征，有個(gè)性化藥物的前景，并且可用于預(yù)測(cè)對(duì)新療法的反應(yīng)。為臨床前藥效的評(píng)估以及生物標(biāo)志物的鑒定提供了有效的研發(fā)資源。已被證明適用于研究轉(zhuǎn)移和藥物反應(yīng)[20]。因此，這些模型是測(cè)試藥物反應(yīng)的最佳臨床前模型，特別是難治性癌癥患者。缺點(diǎn)：費(fèi)用高，建模周期長(zhǎng)，且移植率和肝轉(zhuǎn)移率較低?；颊呓M織中通常存在的壞死區(qū)域使移植成功更具挑戰(zhàn)性，缺乏在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用的先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。

4 遺傳修飾小鼠模型

遺傳修飾小鼠模型包括兩類：轉(zhuǎn)基因小鼠模型和基因敲除小鼠模型。轉(zhuǎn)基因小鼠指通過(guò)實(shí)驗(yàn)導(dǎo)入方法將外源目的基因?qū)胄∈笤缙谂咛ゼ?xì)胞或受精卵，使之與小鼠本身基因組結(jié)合，產(chǎn)生攜帶外源目的基因小鼠品系，且可以通過(guò)生殖細(xì)胞將外源目的基因傳遞給后代?；蚯贸址Q基因打靶，指將外源DNA與受體細(xì)胞染色體 DNA 上的同源序列之間進(jìn)行重組，使之整合到預(yù)定位點(diǎn)，并代替原有基因，改變細(xì)胞遺傳性的方法。遺傳修飾小鼠模型通過(guò)基因組表達(dá)的改變，提供對(duì)整個(gè)致癌進(jìn)展和特定癌癥相關(guān)基因的研究機(jī)制，可替代PDTX模型，用于了解人類癌癥進(jìn)展[21]。然而，它們通常不能完全模擬人的遺傳復(fù)雜性腫瘤。Roper 等[22]通過(guò)CRISPR-Cas9的編輯結(jié)腸上皮細(xì)胞中Apc和Trp53腫瘤抑制基因并通過(guò)原位移植Apc編輯的結(jié)腸組織誘導(dǎo)自體腫瘤形成。ApcΔ/Δ;KrasG12D/+;Trp53Δ/Δ (AKP)小鼠結(jié)腸組織和人類CRC組織移植到遠(yuǎn)端結(jié)腸并轉(zhuǎn)移到肝臟。證實(shí)建立的結(jié)腸腺瘤中癌基因的順序激活，并重現(xiàn)整個(gè)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。O′Rourke等[23]使用基因工程小鼠模型組織的細(xì)胞，原位移植快速構(gòu)建CRC轉(zhuǎn)移性小鼠模型。在這個(gè)模型中，描述了CRC從腺癌(6周)到局部播散性疾病(11～12周)和自發(fā)轉(zhuǎn)移(>20周)的基因型和時(shí)間依賴性進(jìn)展。因此，該模型提供了快速和靈活的手段用于遺傳和臨床前研究。Atlasi等[24]使用不同的轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠模型分析了S100a4在腸腫瘤起始和進(jìn)展中的體內(nèi)作用。發(fā)現(xiàn)在Apc和Smad4突變小鼠中，S100a4的基因切除或過(guò)表達(dá)不影響腸道中的腫瘤起始。相反，Apc1638 N/+/KRASV12G小鼠中的S100a4上皮基因過(guò)表達(dá)增加了腸腫瘤細(xì)胞向肝臟的傳播，與其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用一致。優(yōu)點(diǎn)：提供腫瘤發(fā)生過(guò)程中特異性基因突變影響的信息，與可移植模型相比，該模型更準(zhǔn)確地表現(xiàn)腫瘤發(fā)展的自然過(guò)程和腫瘤細(xì)胞與組織微環(huán)境之間的相互作用，用于評(píng)估腫瘤發(fā)生的早期步驟，有望引導(dǎo)CRLM患者進(jìn)行靶向治療以延長(zhǎng)其生命。隨著基因操作技術(shù)的不斷開(kāi)發(fā)與改進(jìn)[25]，遺傳修飾小鼠模型在研究CRC及其轉(zhuǎn)移發(fā)病機(jī)理和篩選預(yù)防或治療藥物中扮演著越來(lái)越重要的角色。缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，費(fèi)力，肝轉(zhuǎn)移率較低，造模時(shí)間長(zhǎng)，不利于評(píng)估藥物療效，特異性基因的突變可導(dǎo)致胚胎致死性，嚴(yán)重的發(fā)育缺陷或發(fā)生轉(zhuǎn)移之前的不育。

本文僅概述了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移建模的常用方法，這些動(dòng)物模型為探究人結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的各種特征提供了一定的方便，筆者認(rèn)為理想的CRLM模型是具有可預(yù)測(cè)性和可重復(fù)性，能有效地代表人類CRLM微環(huán)境，并且能用于驗(yàn)證患者新的治療方案。目前研究人類CRLM動(dòng)物模型比較常用且易操作的是種植模型，具有一定研究前景的是PDTX模型和遺傳修飾小鼠模型。