大腸菌群主要檢測(cè)方法研究進(jìn)展

寧倩倩

(1.江西科技師范大學(xué)有機(jī)功能分子研究所，江西 南昌 330013；2.江西省有機(jī)功能分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013)

引 言

公共安全和環(huán)境保護(hù)需要安全飲用水，這意味著它必須不含致病菌。在水源傳播的病原體中，腸道病原體是最常見。因此，人類活動(dòng)水域中的糞便污染源必須嚴(yán)格控制[1]。為了對(duì)水質(zhì)微生物做出及時(shí)性評(píng)價(jià)，致病菌的快速有效檢測(cè)就顯得尤為重要。傳統(tǒng)檢測(cè)方法(包括分離培養(yǎng)和生化鑒定等)對(duì)病原體檢測(cè)的特異性和靈敏性低、操作繁瑣且費(fèi)時(shí)，不能滿足現(xiàn)階段水質(zhì)評(píng)價(jià)需求。近些年來(lái)，酶底物法由于其自身的一些優(yōu)勢(shì)迅速發(fā)展起來(lái)，已經(jīng)廣泛用于水質(zhì)微生物評(píng)價(jià)。

1 酶底物法的研究進(jìn)展

隨著對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其存在一些局限性，包括潛伏期長(zhǎng)等問(wèn)題。酶底物法是基于細(xì)菌的特定酶活性(例如，β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸苷酶)檢測(cè)大腸菌群的一種方法[2]，因?yàn)槠渥陨淼奶禺愋远鴱V受研究者關(guān)注。

2016年，卜曉紅[3]使用酶底物法和多管發(fā)酵法對(duì)大腸菌群進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)比30份樣品的總大腸菌群MPN檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果基本相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同年，蔣玲等[4]在此基礎(chǔ)上對(duì)于同一受試對(duì)象分別接受2種不同處理方法采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，同樣驗(yàn)證了該結(jié)論。隨后，鄧永宏等人[5]分別使用乳糖膽鹽發(fā)酵法、乳糖蛋白胨發(fā)酵法、51孔定量圓盤法、97孔定量圓盤法四種方法檢測(cè)水樣中的大腸菌群含量。結(jié)果顯示：乳糖膽鹽發(fā)酵法的陽(yáng)性檢出率為58.8%，乳糖蛋白胨發(fā)酵法的檢出率為61.8%，酶底物法的檢出率為73.3%。結(jié)果表明：51孔定量圓盤法相比于多管發(fā)酵法的靈敏性更高，但是定量范圍比較窄；97孔定量圓盤法的靈敏性和定量范圍都比多管發(fā)酵法的好。同年，褚福敏等人[6]系統(tǒng)地研究了濾膜法和酶底物法。選取城市供水中不同類別的樣品進(jìn)行腸球菌的檢測(cè)，以加標(biāo)純水和兩種水源水為研究對(duì)象，開展了3組酶底物法和濾膜法的精密度對(duì)比試驗(yàn)，由于腸球菌的含量較低，兩種方法的精密度均不是很好，但是，酶底物法的靈敏度明顯比濾膜法高。

2017年，劉瑞等[7]使用酶底物法、多管發(fā)酵法和快速紙片法這三種方法測(cè)定了糞大腸菌群的含量。這些方法的假陰性率和假陽(yáng)性率都為零。對(duì)比這三種方法質(zhì)控樣品的平均值，結(jié)果顯示三者均在質(zhì)控樣品數(shù)量范圍內(nèi)(180 CFU/mL～1 100 CFU/mL)，而相較于質(zhì)控樣品指定值(580 CFU/mL)，酶底物法略高。因此，酶底物法用于中國(guó)水環(huán)境監(jiān)測(cè)，其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和適用范圍尚需大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加以修正和驗(yàn)證。后來(lái)，李斯婷等[8]6位檢測(cè)人員同時(shí)用酶底物法與平皿計(jì)數(shù)法對(duì)生活飲用水水樣進(jìn)行菌落總數(shù)對(duì)比測(cè)試，并對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示檢測(cè)數(shù)據(jù)存在相關(guān)性，且相關(guān)程度很高，具有一致性和穩(wěn)定性。表明酶底物法可以替代平皿計(jì)數(shù)法。隨后，劉玉紅等[9]又對(duì)比分析了樣品處理過(guò)程、數(shù)據(jù)讀取方法、標(biāo)準(zhǔn)樣品以及實(shí)際水樣檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和準(zhǔn)確性。結(jié)果表明：酶底物法樣品處理時(shí)間只需30 min左右，而且菌落清晰，在紫外燈下分布均勻，標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)量結(jié)果在允許誤差范圍內(nèi)。平板計(jì)數(shù)法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)量結(jié)果同樣在允許誤差范圍內(nèi)，但是使用平板計(jì)數(shù)法處理樣品需要2 h以上，菌落大小有所不同、分布不均勻。另外，楊曉冉等人[10]在無(wú)菌處理室、非無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室以及室外環(huán)境中測(cè)試了大腸菌群。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無(wú)菌性對(duì)酶底物法測(cè)定水中大腸菌群的影響很小。因此，酶底物法可以很好地彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的一些不足，有望替代傳統(tǒng)方法在常規(guī)監(jiān)測(cè)和應(yīng)急污染事故中做出快速評(píng)價(jià)。

2018年，劉寧[11]采用實(shí)際水樣測(cè)試和加標(biāo)測(cè)試方法，通過(guò)酶底物法和多管發(fā)酵法檢測(cè)水樣中大腸菌群的含量。分析對(duì)比了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，大多數(shù)的多管發(fā)酵法使用的都是半成品培養(yǎng)基，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室配置后再用于樣品檢測(cè)，需采取一系列的準(zhǔn)備工作，任何環(huán)節(jié)的任何誤差都可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此，酶底物法可用于大腸菌群的含量測(cè)定，可以更好地替代多管發(fā)酵法用于評(píng)價(jià)水中微生物。

2019年，張會(huì)強(qiáng)等[12]同時(shí)使用多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法在相同的取樣量和培養(yǎng)條件下對(duì)水樣進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)將酶底物法、紙片快速法和濾膜法的檢測(cè)結(jié)果分別與經(jīng)典的多管發(fā)酵法進(jìn)行了對(duì)比分析。從方法的檢出限來(lái)看，紙片快速法的檢出限為20 MPN/L。多管發(fā)酵法和酶底物法的最低檢出限同為3 MPN/L；濾膜法不受取樣量限制，檢出限最低。從實(shí)驗(yàn)操作來(lái)看，多管發(fā)酵法和濾膜法都需要培養(yǎng)基的準(zhǔn)備和復(fù)發(fā)酵過(guò)程，操作繁瑣；然而紙片快速法和酶底物法不需要配制培養(yǎng)基，操作簡(jiǎn)便。因此，多管發(fā)酵法工作量大，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；濾膜法操作強(qiáng)度和耗費(fèi)時(shí)間略低于多管發(fā)酵法；酶底物法和紙片快速法操作簡(jiǎn)便，更適合于大量樣品的快速測(cè)試。從定量菌株檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，酶底物法的準(zhǔn)確性和精密度均優(yōu)于其他三種方法。從相關(guān)性對(duì)比來(lái)看，多管發(fā)酵法與紙片快速法、酶底物法之間無(wú)顯著差異，而與濾膜法存在顯著性差異。

2 酶底物法的優(yōu)缺點(diǎn)

近些年，酶底物法在評(píng)價(jià)水質(zhì)微生物方面起著至關(guān)重要的作用，所以急需清楚了解酶底物法在水質(zhì)微生物檢測(cè)中的優(yōu)缺點(diǎn)。本文從實(shí)驗(yàn)操作、人員配置、檢驗(yàn)成本、靈敏度、精密度等方面對(duì)酶底物法進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。

2.1 實(shí)驗(yàn)操作

多管發(fā)酵法需要通過(guò)初發(fā)酵、鏡檢、復(fù)發(fā)酵等一系列試驗(yàn)，步驟多、時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣，而酶底物法不用配制培養(yǎng)基。

2.2 人員配置

由于基層實(shí)驗(yàn)室的人員配備不夠，需要節(jié)省人力成本，步驟簡(jiǎn)便的酶底物法特別適合在基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

2.3 檢驗(yàn)成本

酶底物法雖然成本貴，但是，該方法是通過(guò)糞便大腸菌群釋放的特異性酶和與其作用的特異性酶底物產(chǎn)生的特異性酶促反應(yīng)來(lái)進(jìn)行大腸菌群含量測(cè)定的，具有快速準(zhǔn)確檢測(cè)的特征，并且實(shí)驗(yàn)操作人員不需要很強(qiáng)的專業(yè)性，檢測(cè)周期短，過(guò)程簡(jiǎn)單，較少受人為污染，能夠準(zhǔn)確判斷水樣的受污染狀況。

2.4 靈敏度、精密度

與傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法相比，酶底物法的假陽(yáng)性和假陰性率較低，操作簡(jiǎn)單快速，時(shí)間較短，重現(xiàn)性較好，加快了分析速度，提高了工作效率。與濾膜法相比，酶底物法的檢驗(yàn)周期以及結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏性具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

酶底物法在檢驗(yàn)周期、設(shè)備設(shè)施投資等方面較濾膜法有明顯優(yōu)勢(shì)，酶底物法實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將一次性取樣瓶更換為可多次重復(fù)使用的玻璃瓶，檢驗(yàn)成本有所降低，但是，單次的檢驗(yàn)成本仍略高于濾膜法。將酶底物技術(shù)與膜技術(shù)相結(jié)合的酶底物濾膜法，其不需要染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵的確認(rèn)測(cè)試，只需24 h的培養(yǎng)過(guò)程即可計(jì)數(shù)特征顏色的細(xì)菌菌落并獲得相應(yīng)結(jié)果，因此，它有助于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)大腸菌。目前，酶底物法在國(guó)內(nèi)正逐步開始推廣，但是由于該方法的成本較高，還沒有被廣泛使用。如果將來(lái)試劑、耗材價(jià)格能有所下降，水樣的測(cè)定范圍能進(jìn)一步提高，一定會(huì)得到更好的推廣。