通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶K消化時(shí)長(zhǎng)優(yōu)化DNA提取方法

吳松芳，陸宜雋

（1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200031；2.上海市位育中學(xué)，上海 200231）

蛋白酶K在多種環(huán)境下都能夠具有一定的活性，同時(shí)化學(xué)性質(zhì)也較為穩(wěn)定，因此在生物工程中的應(yīng)用較為廣泛。蛋白酶K可以用來(lái)進(jìn)行DNA提取操作，也可以用于對(duì)蛋白的修飾。由于蛋白酶K屬于酶類(lèi)的一種，其活性相對(duì)較高，可以用于對(duì)蛋白的降解。另外，DNA提取是生物工程和生物技術(shù)中較為常用的一種重要的操作，應(yīng)該采用重要的方法和措施保證DNA提取的質(zhì)量，保證生物工程的質(zhì)量。利用蛋白酶K進(jìn)行DNA的提取就是重要的方法之一，并可以通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶K的消化時(shí)長(zhǎng)，從而對(duì)DNA的提取過(guò)程進(jìn)行干預(yù)，這樣能夠在很大程度上提高DNA的提取質(zhì)量，本文對(duì)此進(jìn)行了較為詳細(xì)的分析。

1 DNA提取概述

1.1 DNA提取原則

采用物理及化學(xué)方法提取組織DNA，主要遵循以下提取原則：(1)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；(2)保證其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子的污染應(yīng)降低到最低程度；(3)核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；(4)其他核酸分子如RNA等，也應(yīng)盡量去除。

1.2 DNA提取原理

較為常見(jiàn)的是研溶法提取DNA。首先研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使得核蛋白和RNA釋放出來(lái)；再利用DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液而RNA溶于0.14mol/L的NaCl溶液的性質(zhì)，將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品破碎細(xì)胞液中分開(kāi)；最后將蛋白的雜質(zhì)除去。

1.3 DNA提取鑒定方法

1.3.1 分光光度法

在260nm和280nm處測(cè)定DNA溶液的光吸收，A260與A280之比應(yīng)在1.75-1.80之間。低于此值表明制備物中殘留蛋白質(zhì)成分較高或含有酚，高于此值表明有RNA的殘留。

1.3.2 凝膠電泳分析

影響瓊脂糖凝膠電泳DNA遷移率的因素：①DNA分子大小，DNA分子越大遷移速度越慢。②遷移率與瓊脂糖濃度成反比。③DNA構(gòu)象：a.相同分子量的超螺旋環(huán)狀（Ⅰ型），切口環(huán)狀（Ⅱ型），線(xiàn)狀（Ⅲ型）DNA，以不同速率通過(guò)凝膠。b.一般情況下，遷移率Ⅰ型＞Ⅲ型＞Ⅱ型。④電壓：遷移率與所加電壓成正比，但是電壓過(guò)大有效分離范圍減小。⑤電場(chǎng)方向：?jiǎn)我环较蛩俾示?，改變方向，極大分子DNA遷移更慢。通過(guò)脈沖電場(chǎng)凝膠電泳分離極大DNA。

在DNA提取的過(guò)程中，為了保證DNA的提取質(zhì)量，應(yīng)該遵循一定的原則[1]。DNA提取的原則相對(duì)較多，應(yīng)該對(duì)各種原則合理準(zhǔn)確把握，保證DNA的提取質(zhì)量符合相關(guān)的要求，對(duì)于DNA標(biāo)本指的是標(biāo)本的采集、標(biāo)本的保存、標(biāo)本的運(yùn)輸。實(shí)驗(yàn)前的質(zhì)量控制是整個(gè)基因檢測(cè)后續(xù)運(yùn)行的保障，其中任何一環(huán)出現(xiàn)問(wèn)題都將影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行，甚至讓實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。DNA提取實(shí)驗(yàn)是將合格樣本的DNA提取出來(lái)的一系列操作，實(shí)驗(yàn)中質(zhì)量控制是DNA提取的核心。

此外，DNA提取全程都要注意防止樣品污染（環(huán)境與樣品的污染和樣品與樣品的污染），這將關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。在DNA提取的實(shí)驗(yàn)后，則是對(duì)DNA的保存。DNA的完整保存可以用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），進(jìn)行特殊DNA片段的體外擴(kuò)增，從而制造特定的DNA序列滿(mǎn)足特定反應(yīng)。DNA的保存是對(duì)PCR的完善[2]，可以隨時(shí)查找樣本DNA進(jìn)行DNA擴(kuò)增。一般DNA提取出來(lái)后，根據(jù)特定的DNA應(yīng)用進(jìn)行不同程度的保存，制備保存液進(jìn)行保存內(nèi)置DNA保存液，短期內(nèi)使用將放置于4℃進(jìn)行保存，長(zhǎng)期保存將放置于-20℃下進(jìn)行保存，減緩DNA降解速度。

2 蛋白酶K的反應(yīng)原理及消化時(shí)長(zhǎng)

蛋白酶在生物工程中具有重要的應(yīng)用，是一種常用的酶類(lèi)，尤其在DNA的提取操作中具有重要的應(yīng)用。蛋白酶的種類(lèi)也很多，可以應(yīng)用在不同的場(chǎng)合中，同時(shí)不同酶的反應(yīng)原理和作用原理也存在一定的差異，對(duì)此應(yīng)該進(jìn)行差別對(duì)待。有些酶是從內(nèi)部將蛋白質(zhì)分子切斷，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的提取，而有些酶則是將蛋白質(zhì)分解為各個(gè)游離的分子，這樣也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的提取[3]。

另外，采用蛋白酶在DNA的提取中，蛋白酶的反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)對(duì)于DNA的提取具有較大的影響，對(duì)此應(yīng)該重點(diǎn)加以對(duì)此。在實(shí)際的DNA提取中，可以通過(guò)調(diào)整和改變蛋白酶的相應(yīng)的消化時(shí)長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA提取過(guò)程中的干預(yù)，達(dá)到提高相應(yīng)的提取質(zhì)量。蛋白酶K是由多種氨基酸所組成的，并具有兩個(gè)不同的結(jié)合點(diǎn)，這樣的分子結(jié)構(gòu)也決定了這種蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，也使得蛋白酶K能夠在多種場(chǎng)合中都能得到廣泛的采用。目前，蛋白酶K醫(yī)藥、食品等行業(yè)中得到了較為廣泛的應(yīng)用，制備不同材料以應(yīng)用到各領(lǐng)域中。對(duì)于改善相應(yīng)的勞動(dòng)環(huán)境也具有一定的價(jià)值。

蛋白酶對(duì)于保證的環(huán)境和反應(yīng)的環(huán)境也具有一定的要求，對(duì)此在實(shí)際的操作過(guò)程中，應(yīng)該加以注意。對(duì)于培養(yǎng)基的選取，應(yīng)該充分保證培養(yǎng)基的溫度在合理的范圍內(nèi)，同時(shí)培養(yǎng)液的pH值也要在一定的范圍之內(nèi)，這樣才可以發(fā)揮出蛋白酶的相應(yīng)作用，同時(shí)也有利于蛋白酶在生物工程中的實(shí)際應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白酶的產(chǎn)量已經(jīng)有了較大的提高，也具有相當(dāng)?shù)氖袌?chǎng)。

3 DNA提取的優(yōu)化方法

3.1 常見(jiàn)的DNA提取方法

在提取DNA的過(guò)程中，蛋白酶K的消化時(shí)長(zhǎng)對(duì)于DNA的提取質(zhì)量有著直接的影響，應(yīng)對(duì)蛋白酶K的消化時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行合理控制，達(dá)到成功提取DNA的目的。DNA提取是基因克隆等研究的第一步，現(xiàn)有的方法主要是CTAB方法，此外還可以采用不同的方法，如玻璃珠法、研磨法、凍融法等物理方式，異硫氰酸胍法、堿裂解法等化學(xué)方式，酶法等生物方式。根據(jù)核酸分離純化方式的不同，有硅質(zhì)材料、陰離子交換樹(shù)脂等。這些方法種類(lèi)繁多，提取質(zhì)量各有不同，還不能完全滿(mǎn)足使用需求。通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶K的消化時(shí)長(zhǎng)，可以很好地優(yōu)化DNA的提取，提高DNA的提取質(zhì)量，保證DNA提取具有較高的純度，同時(shí)DNA自身也沒(méi)有受到損壞。

在現(xiàn)代疾病診斷中，核酸占據(jù)著非常重要的地位，其中DNA的作用更顯突出，而血液跟組織則是獲取的DNA重要來(lái)源。但是，組織提取與血液提取相比較而言，采集動(dòng)物組織操作簡(jiǎn)單、不需要抗凝劑，便于保存和攜帶運(yùn)輸。所以組織提取DNA更具優(yōu)勢(shì)。但在PCR分子診斷過(guò)程中，獲得的DNA的總拷貝數(shù)和質(zhì)量會(huì)直接影響到后續(xù)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所以，獲得有效、可靠的DNA是PCR分子診斷的關(guān)鍵。雖然傳統(tǒng)的液氮研磨和酚氯仿提取核酸的方法能夠獲得質(zhì)量較好的核酸，但是其中用到的化學(xué)物質(zhì)卻有著一定的毒性，而且整個(gè)提取過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，浪費(fèi)大量的時(shí)間和人力物力。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，現(xiàn)在普遍使用的柱提法核酸提取試劑也能獲得質(zhì)量很好的核酸，毒性也可以忽略，但是耗費(fèi)的時(shí)間長(zhǎng)。除去毒性和時(shí)間的因素以外，這兩種試劑提取核酸的操作當(dāng)中免不了各種洗滌液的添加和丟棄，這個(gè)過(guò)程極其容易導(dǎo)致樣本之間的交叉污染。當(dāng)樣本量較多的情況下，還容易出錯(cuò)，致使工作效率低下。

3.2 DNA提取的影響因素

蛋白酶K的應(yīng)用范圍較廣，應(yīng)用于各種生物材料制備工程中能夠在不用的生物工程中都能得到應(yīng)用，也是重要的蛋白酶類(lèi)，同時(shí)該種酶的活性也十分高，在生物學(xué)中具有重要的價(jià)值和意義，此外能夠分解多種不同的蛋白質(zhì)，在采用蛋白酶進(jìn)行DNA的提取中，首先應(yīng)該分析各種可能影響DNA提取質(zhì)量的影響因素，之后對(duì)DNA提取的質(zhì)量進(jìn)行分析。在分析出各種不同的影響因素之后，應(yīng)該對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行采用合理的措施加以處理，保證DNA的提取質(zhì)量，這樣在生物工程中也具有一定的意義。DNA的提取質(zhì)量受到影響的因素通常也相對(duì)較多，如設(shè)備、提取方式都會(huì)影響到實(shí)際的DNA的質(zhì)量，故應(yīng)該對(duì)DNA的提取加以重視，這樣才可以保證DNA的提取質(zhì)量。目前，采用蛋白酶對(duì)DNA提取的技術(shù)也相對(duì)較為成熟，可以在實(shí)際的工程中加以推廣。蛋白酶K在高溫(達(dá)65℃)和寬pH范圍（pH7.5～12.0）具有高穩(wěn)定性。在脲、SDS等變性劑存在下其活性得以提高。上述性質(zhì)使得蛋白酶K在要求非特異性蛋白質(zhì)降解的生物技術(shù)領(lǐng)域中具有很好的應(yīng)用，特別是從粗提取液中分離核酸（DNA或RNA）以及在DNA分析中預(yù)制備樣品，另外蛋白酶K也可應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域，例如結(jié)構(gòu)釋析。其中，用于DNA提取的試液包括鹽酸胍、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸和2-丁氧乙醇，pH值為6.8～7.2。本發(fā)明所述的洗滌液能夠廣泛去除不同植物在基因組純化過(guò)程中的多糖、多酚等污染，提高純化所得DNA的純度與濃度，有利于下游應(yīng)用，提高檢測(cè)靈敏度。

3.3 DNA提取的優(yōu)化方法

DNA的提取方法較多，不同的提取方法具有不同的特點(diǎn)，對(duì)此應(yīng)該合理差別化對(duì)待。采用蛋白酶K進(jìn)行DNA的提取，其反應(yīng)的原理不復(fù)雜，一般是通過(guò)蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)，從而將DNA加以分離將DNA分解出來(lái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的提取。但蛋白酶不同的反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)，對(duì)于DNA的提取具有較為顯著的影響，對(duì)此應(yīng)引起重視，同時(shí)在實(shí)際的DNA提取操作中，也可以通過(guò)調(diào)整和改變時(shí)長(zhǎng)，通過(guò)采用不同的反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)，達(dá)到對(duì)DNA提取操作過(guò)程中的實(shí)際控制，提高對(duì)DNA提取的實(shí)際控制。蛋白酶K應(yīng)在真空或37℃溫箱或室溫干燥，加TE緩沖液20μL。溶解后，取3～8μL 用于PCR擴(kuò)增，或放-20℃保存，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。但操作繁復(fù)，技術(shù)要求高。用于蛋白酶K保存的緩沖液，所述緩沖液中，除水外，還包括下列組分：Tris 10 mmol/T-500 mmol/LCa2+2 mmol/L-50 mmol/LHCl調(diào)節(jié)pH值至7.5-8.4，甘油30%～60%。在提取DNA時(shí)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶K的消化時(shí)長(zhǎng)，以提高對(duì)DNA的提取質(zhì)量。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，生物產(chǎn)品的質(zhì)量也會(huì)得到較為明顯的提高，本文主要對(duì)DNA的提取進(jìn)行了分析。在DNA的提取過(guò)程中，采用不同的提取方法對(duì)于提取的DNA的產(chǎn)品質(zhì)量具有較為明顯的影響，當(dāng)采用蛋白酶K對(duì)DNA進(jìn)行提取時(shí)，應(yīng)該對(duì)蛋白酶的消化時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行控制，保證DNA的提取具有較高的質(zhì)量，這樣才可以達(dá)到對(duì)DNA成功提取的目的，保證產(chǎn)品的質(zhì)量符合相關(guān)的要求。

蛋白酶K在生物工程中具有重要的應(yīng)用，在DNA的提取中常采用蛋白酶K進(jìn)行輔助操作。在提取DNA時(shí)，如不加蛋白酶K的話(huà)細(xì)胞是很難裂解釋放DNA的，DNA濃度會(huì)很低，除非使用煮沸法或超聲破碎法，本文對(duì)通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶K消化時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行DNA提取的方法進(jìn)行了詳細(xì)的分析，對(duì)于提高DNA的提取工藝具有一定的價(jià)值。