去甲雄三烯醇酮檢測(cè)技術(shù)研究

王淑云

（河南科技學(xué)院新科學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000）

去甲雄三烯醇酮（17β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one）的商品名稱(chēng)是A-群勃龍（Trenbolone，TRE），是一種人工合成的甾類(lèi)雄性激素。TRE作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，能夠提高瘦肉產(chǎn)出率和飼料轉(zhuǎn)化率，在動(dòng)物飼養(yǎng)中被大量使用。運(yùn)動(dòng)員服用TRE可提高體內(nèi)雄性激素的含量，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)。為避免人類(lèi)因長(zhǎng)期攝入激素殘留物或其代謝物而引起發(fā)育、神經(jīng)、遺傳毒性和癌癥問(wèn)題[1]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件中規(guī)定TRE在動(dòng)物性食品中不得檢出[2]。

本文就TRE及其同類(lèi)蛋白同化激素的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行闡述，為T(mén)RE檢測(cè)試紙條和蛋白質(zhì)芯片等最新技術(shù)的探索提供參考。

1 理化分析方法

TRE樣品具有基質(zhì)復(fù)雜、效應(yīng)明顯、干擾物較多、濃度水平低等特點(diǎn)，為了準(zhǔn)確定性且精確定量其殘留量，檢測(cè)方法必須靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)。目前TRE樣品的理化檢測(cè)檢測(cè)方法主要包括:高效液相色譜法（HPLC）、薄層層析法（TLC）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）等。

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法具有分離效能高、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、分析速度快等特點(diǎn)，適合高溫不穩(wěn)定、沸點(diǎn)高的大分子物質(zhì)的分析檢測(cè)，其缺點(diǎn)是檢測(cè)中用到的一些有機(jī)試劑對(duì)人體有害。19世紀(jì)80年代，HPLC開(kāi)始應(yīng)用于蛋白同化激素的分析檢測(cè)。2008年湯艷榮[3]等介紹了另一種用于激素和抗生素檢測(cè)的新方法“超高效液相色譜法”。與傳統(tǒng)高效液相色譜法相比，超高效液相色譜法在速度、靈敏度及分離度方面分別是高效液相色譜法的9倍、3倍及1.7倍，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果或產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

1.2 薄層層析法

薄層層析法是一種快速且微量的層析檢測(cè)方法，具有高分辨能力、分析速度快、技術(shù)簡(jiǎn)單、操作容易、結(jié)果直觀(guān)、不需昂貴儀器設(shè)備就可以分離較復(fù)雜混合物等特點(diǎn)。這種方法可用于復(fù)雜物的分離、提純以及含量測(cè)定，適用于殘留物的檢測(cè)。1989年VanLook[4]用薄層層析法檢測(cè)牛體內(nèi)包含TRE等30多種激素，檢測(cè)限達(dá)到1～10μg/kg。

1.3 氣相色譜法

氣相色譜是20世紀(jì)50年代出現(xiàn)的一項(xiàng)分離、分析技術(shù)，具有樣品用量小、檢測(cè)速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品安全、競(jìng)技場(chǎng)興奮劑的檢測(cè)等方面都有廣泛的應(yīng)用。1965年，Beckett第一次用GC檢測(cè)到運(yùn)動(dòng)員濫用藥物；1972年，Donike[5]用氣相層析儀檢測(cè)鴉片和興奮劑類(lèi)等蛋白同化激素；1991年Bagnati[6]用氣相色譜法檢測(cè)TRE等蛋白同化激素，其檢測(cè)限達(dá)到0.02～0.06μg/kg，回收率為35%～87%。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜-質(zhì)譜法是20世紀(jì)50年代開(kāi)發(fā)的一種結(jié)合氣相色譜和質(zhì)譜特性的分析檢測(cè)方法。該方法具有定性準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，主要用于鑒別揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性強(qiáng)的物質(zhì)，是目前檢測(cè)蛋白同化激素殘留的最常見(jiàn)方法。GC-MS最早用于檢測(cè)蛋白同化激素是在1983年委內(nèi)瑞拉舉辦的泛美運(yùn)動(dòng)會(huì)上。1988年，Shih Hsu[9]用GC-MS檢測(cè)牛組織中的TRE，在牛肉和牛內(nèi)臟中的檢出限為0.5μg/kg。2007年，韓麗[8]用GC-MS法檢測(cè)TRE在動(dòng)物組織中的殘留，定量限達(dá)1.0 μg/kg。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜-質(zhì)譜法可以有效分離和檢測(cè)那些不易揮發(fā)、易分解的復(fù)雜化合物，并且不需要像GC-MS進(jìn)行衍生化。Hong[9]在2009年采用LC-MS檢測(cè)牛肝臟中TRE殘留，其平均回收率是62%～69%，檢測(cè)限是1μg/kg 。呂惠卿等用LC-MS測(cè)定牛奶中TRE殘留，其檢測(cè)限為0.3 μg/L，添加回收率為59.2%～90.7%。LC-MS與GC-MS比較，有效提高了檢測(cè)限，是復(fù)雜化合物檢測(cè)分析的有效手段。

色譜/質(zhì)譜分析法是檢測(cè)TRE殘留的主要方法，但檢測(cè)前樣品的處理比較復(fù)雜，需要在專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室由專(zhuān)業(yè)工作人員操作，且儀器價(jià)格昂貴，檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)，平均需要2 d以上，不能滿(mǎn)足養(yǎng)殖戶(hù)自檢和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。

2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫分析方法（Immunnoanalysis，IA）是以抗原抗體的特異性、敏感性、可逆性反應(yīng)為基本原理，以不同的抗原抗體反應(yīng)載體為技術(shù)建立起來(lái)的分析方法。其優(yōu)點(diǎn)是試樣體積小、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單且價(jià)格低廉，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大批量檢測(cè)[10]。免疫學(xué)檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、放射性免疫分析法（radioactive immunoassay，RIA）、膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immunochromatography assay，CGICA）和化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）等方法。

2.1 酶聯(lián)免疫檢測(cè)

ELISA是一種固相吸附免疫測(cè)定技術(shù)，其原理是將已知的抗原（或抗體）包被到固相載體表面，保留包被物、酶標(biāo)記物免疫活性，利用抗原抗體的特異性反應(yīng)使酶與待檢物結(jié)合，然后根據(jù)酶與底物的催化顯色程度，進(jìn)行定性定量測(cè)定。

2004年，F(xiàn)itzpatrick J[11]等采用基于TRE多克隆抗體的ELISA法對(duì)牛膽汁中TRE的殘留進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為3 ng/mL；2010年周成林[12]等研究了TRE的化學(xué)修飾及其免疫原性的構(gòu)建，并用ELISA檢測(cè)得到TRE特異性抗體，其效價(jià)為l∶3.2×105。ELISA免疫學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展很快，尤其是使用了標(biāo)記的抗原和抗體的分析技術(shù)，在特異性和敏感性方面都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于經(jīng)典的分析技術(shù)，這使得ELISA檢測(cè)法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大。

2.2 放射性免疫分析法

放射性免疫分析法于1960年創(chuàng)立，是以放射性核素為標(biāo)記物的一種免疫分析法，其基本原理是標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）對(duì)特異性抗體（Ab）的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，最早被用于測(cè)定糖尿病人血漿中胰島素的含量。放射性免疫分析法特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣品用量少、操作簡(jiǎn)單、精密度高，且大小分子量的物質(zhì)都可以測(cè)定，在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用十分廣泛，也常常被用來(lái)檢測(cè)蛋白同化激素的殘留量。例如，1976年加拿大奧運(yùn)會(huì)上采用RIA來(lái)檢測(cè)蛋白同化激素（包含TRE）的殘留[13]。但是，RIA的缺點(diǎn)是使用了放射性的核素，有損工作人員的健康，且需要專(zhuān)業(yè)操作人員在專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。此外，核素還有半衰期，造成試劑盒有效期較短，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)和交叉反應(yīng)，因此大大限制了RIA的使用性。從科技發(fā)展前景來(lái)看，放射性免疫分析技術(shù)將逐步被其他標(biāo)記免疫分析技術(shù)取代。

2.3 化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)

化學(xué)發(fā)光免疫分析是將具有高特異性的免疫反應(yīng)與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)相結(jié)合，用于抗原、半抗原、抗體、激素、維生素等定性或定量的分析檢測(cè)。2003年，Roda[14]報(bào)道了一種靈敏、快速、簡(jiǎn)單的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法，該方法可以在幾分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，不僅試劑用量只有96孔酶標(biāo)板的1/5，且檢測(cè)費(fèi)用較低，非常適合大批量檢測(cè)。2015年，沈克強(qiáng)[15]用CLIA檢測(cè)TRE，TRE多克隆抗體對(duì)TRE的50%抑制濃度（IC50）和15%抑制濃度（IC15）分別為0.094 μg/L和0.00330μg/L，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附分析方法相比,靈敏度提高了5-8倍。近年來(lái)，CLIA由于其適用面廣、特異性強(qiáng)、靈敏度高、所需設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際中應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越廣泛。

2.4 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)就是以膠體金為顯色媒介，利用免疫學(xué)原理，在層析過(guò)程中完成抗原抗體的特異性結(jié)合，從而達(dá)到檢測(cè)目的的一種方法。1971年，F(xiàn)aulk[16]把膠體金顆粒與兔抗沙門(mén)氏菌抗血清結(jié)合形成金標(biāo)抗體，用于檢測(cè)抗原在細(xì)菌表面的分布，這標(biāo)志著免疫學(xué)研究領(lǐng)域又增加了一種新型的有色標(biāo)記物——膠體金。2007年，Liu[17]研制出一種免疫層析試紙條，這種試紙條不僅能夠快速定性，在10min內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果；且無(wú)需設(shè)備、靈敏度高，可以用肉眼直觀(guān)判定陰性/陽(yáng)性結(jié)果，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。隨著免疫層析技術(shù)的快速發(fā)展，其在疾病診斷、食品安全、藥物檢測(cè)等領(lǐng)域?qū)⒌玫礁訌V泛的應(yīng)用。

2.5 蛋白芯片技術(shù)

蛋白芯片技術(shù)是一種微型、靈敏度高、特異性強(qiáng)的新興技術(shù)。原理是把已知蛋白固定在玻璃等載體上，形成高濃度的分子排列，當(dāng)芯片上的探針?lè)肿优c標(biāo)記物的靶分子結(jié)合后，通過(guò)激光共聚焦掃描或光耦合元件（CCD）對(duì)標(biāo)記信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。2009年，Kloth[18]把蛋白芯片技術(shù)應(yīng)用到食品中藥物污染的檢測(cè)中。

3 展望

目前在TRE的檢測(cè)方法中，氣相色譜法、液相色譜法等理化檢測(cè)方法是定量法，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定等免疫學(xué)檢測(cè)方法是篩選法。但隨著TRE高靈敏度、高親和力的單克隆抗體的獲得，免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果與理化檢測(cè)方法的相關(guān)度越來(lái)越高。免疫學(xué)檢測(cè)方法與理化檢測(cè)方法相比具有操作便捷、節(jié)約時(shí)間、費(fèi)用低廉、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，在TRE殘留的檢測(cè)中擁有更廣闊的發(fā)展空間，特別是膠體金免疫層析技術(shù)和蛋白芯片技術(shù)已經(jīng)成為T(mén)RE殘留檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)。