富血小板血漿制備技術(shù)及其抗菌效應(yīng)的研究進展*

劉泉體，蘭 婷 綜述，吳佳奇審校

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)傷外科，四川瀘州 646000)

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是指全血經(jīng)過離心、分離而得到的高度濃縮的產(chǎn)物，其血小板水平通常為正常全血的4～5倍以上。JMARX[1]對PRP中血小板的有效濃度定義為1×106個/μL，并指出較低的濃度不能改善創(chuàng)面愈合，更大的濃度并未顯示更好的效果。根據(jù)其所含血小板、纖維蛋白和白細胞濃度的不同，進一步分為：純PRP(P-PRP),含白細胞PRP(L-PRP)，純富血小板纖維蛋白(P-PRF)，含白細胞的PRF(L-PRF)這4大類別。人們常說的PRP，是指的L-PRP。隨著研究的逐漸深入，其組織修復(fù)效應(yīng)和獨特的抗菌效果逐漸被認識，在臨床上將其運用于手術(shù)中預(yù)防術(shù)后感染及某些難治感染性創(chuàng)面[2]。不過，PRP的制備方法較多，并無統(tǒng)一標準[3]。導(dǎo)致其成品中所含成分的比例各不相同，對其抗感染的具體機制尚不明確，對其所含成分的抗感染作用尚有爭議。因此，本文就PRP的制備技術(shù)及抗菌效應(yīng)的研究進展進行論述。

1 PRP的制備技術(shù)

1.1制備原理 目前為止，PRP制劑形態(tài)除了液狀和凝膠狀外，還有粉末狀[4]，目前仍以液狀居多。其制備方法主要是密度梯度離心法及血漿分離置換法，后者利用多功能醫(yī)用血成分自動分離設(shè)備采集并濃縮血小板，應(yīng)用于血庫血小板的采集和臨床成分輸血，雖然其制備的血小板濃度和純度較高，但其設(shè)備昂貴，限制了其在臨床上的應(yīng)用。實驗研究及臨床上許多商業(yè)化PRP設(shè)備采用密度梯度離心法，其原理是根據(jù)血液中的各組分沉降系數(shù)不同，在離心狀態(tài)下各自分層，從而易于提取。

1.2離心血的采集，抗凝劑、離心管的選擇 血液的選擇通常分為新鮮與冷凍血，自體血與異體血，血液質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到PRP的質(zhì)量。臨床上制備PRP多使用新鮮的自體血，通常這是最優(yōu)的選擇。但當患者有某些血液系統(tǒng)疾患、大量失血或輸液導(dǎo)致自身血小板濃度異常時，參照普通制備方法可能導(dǎo)致最終血小板濃度不能滿足治療需求，需要調(diào)整制備方法或者使用異體血。另外，冷凍的異體血不可避免地存在細胞的破壞和血小板的損傷，其制備的PRP效果不如新鮮全血。還有學(xué)者認為，使用較粗的針頭采血效果會更好。

離心管的選擇，決定于PRP的使用目的，需要量大小，血小板基線水平及所采用方法的血小板回收率。目前尚沒有哪項技術(shù)條件能夠達到百分百的血小板回收率。所以，當需要1 mL的PRP時，需要的全血量可能會是5～10 mL或者更多。若采用的離心力較大，一次性使用塑料采血管是不錯的選擇。不過，臨床上所使用的采血管容量均較小，對于需要大量使用PRP的患者，需要大容量的離心管。另外，還有一些商業(yè)化設(shè)備配套離心管，如醫(yī)療美容所用的Tubex管，優(yōu)化了分離裝置，能夠使紅細胞徹底清除，制備PRP時簡單易操作，但價格較貴，尚未普及?？傊?，不管是哪種離心管，都應(yīng)強調(diào)無菌觀念。

離體的血液會自發(fā)啟動凝血過程,為了避免血小板在使用前的過早激活，通常會使用抗凝劑。常在乙二胺四乙酸鹽(EDTA)和枸櫞酸鹽中選擇，通常EDTA用于全血細胞計數(shù)，枸櫞酸鹽用于凝血或者血庫血的保存?？紤]到EDTA可能損害血小板膜，因此，制備PRP時選擇枸櫞酸鈉或枸櫞酸葡萄糖(ACD)制劑[5]，其原理是通過與血液中的鈣離子形成螯合物，終止其凝血途徑而防止血小板聚集。研究發(fā)現(xiàn)，枸櫞酸鈉和ACD-A溶液在pH值上差異較大，ACD-A的pH值為4.9，3.8%的枸櫞酸鈉pH值為7.8。而PRP的pH和細胞外鈣離子濃度的改變可影響體外血小板聚集，聚集通常在酸性pH和低鈣時減少[6]。此外，某些存在于血小板中的抗菌肽在較低pH值時，能夠發(fā)揮更大的抗菌效應(yīng)。

1.3離心設(shè)備的選擇及溫度的設(shè)定 由于離心方法的不同，各實驗室的條件差異，目前無統(tǒng)一的離心機標準。通常而言，低速離心機已滿足離心要求，值得注意的是，常溫的臺式離心機離心的速度越大，采血管表面的溫度越高，可達到(40±3)℃。而血小板的常規(guī)保存溫度是(22±2)℃，過高的溫度會導(dǎo)致血小板的提前激活，所以，美國血庫學(xué)會(AABB)推薦PRP的離心溫度為21～24 ℃。此外，許多學(xué)者在離心過程中使用了12～16 ℃的溫度水平獲得了最佳血小板回收率[7]。所以，恒溫離心機是較優(yōu)的選擇。

1.4離心力、次數(shù)、轉(zhuǎn)速、時間的選擇 離心力的大小與轉(zhuǎn)速和離心半徑相關(guān)。公式表達為：相對離心力(RCF)=1.118×10-6×R×W2(R為離心半徑，單位為cm；W為每分鐘轉(zhuǎn)速，單位為r/min)。國內(nèi)有些文章在描述制備PRP的過程時，只提到了離心的轉(zhuǎn)速及時間，沒有提及其離心半徑，無法知曉其離心力的大小，這種表達方式是不規(guī)范的。對于一個固定的離心機而言，離心半徑大多是固定的，所以，離心力的數(shù)值是不能隨意設(shè)置的。離心力大小的選擇，還取決于離心次數(shù)，目前仍無統(tǒng)一標準。

通常制備PRP可以分為一次離心法，二次離心法及三次離心法。一次離心法雖然操作簡單，但血小板回收率不足限制了其應(yīng)用；并且，一次離心法往往會使用較大的離心力。研究發(fā)現(xiàn)，當離心力大于250×g時，會造成血小板破壞過多。如果治療所需的PRP量少而采集的血液較多時，為了提高血小板的富集倍數(shù)，增大離心力是可行的。此外，三次離心法相比二次離心法而言，操作繁瑣，雖然可以提取到濃度更純的PRP，但也會導(dǎo)致血小板回收率的下降。因此，二次離心法更適合制備新鮮PRP[8]。

經(jīng)典的二次離心法包括：PETRUNGARP法(第1次1 500×g離心6 min，第2次1 000×g離心6 min)、LANDESBERG法(兩次均為200×g離心10 min)、 AGHALOO法(第1次215×g離心10 min，第2次863×g離心10 min)。由于都是手工制備，影響因素較多，哪種方法更優(yōu)無明確結(jié)論，目前國際上也沒有統(tǒng)一的標準。不斷有學(xué)者在此基礎(chǔ)上進行探索，如SHIN等[9]以比格犬靜脈血制備PRP的研究方法發(fā)現(xiàn)，第1次離心1 000×g離心5 min，血小板回收率最高；第2次1 500×g離心15 min，可以回收到血小板濃縮率達到6倍的PRP。YIN等[10]抽取80名健康志愿者新鮮全血，分別設(shè)計研究了第1次及第2次離心的最佳條件，發(fā)現(xiàn)在第1次160×g離心10 min，第2次250×g離心15 min的離心條件下，血小板和生長因子的保存及濃縮效果明顯提高，是制備P-PRP的最佳方法。王淑君等[8]探討了離心血量和制備方法的關(guān)系并認為，200 mL全血采用第1次850×g離心8 min，第2次4 650×g離心5 min；300 mL全血第1次1 000×g離心6 min，第2次4 650×g離心5 min；400 mL全血第1次1 220×g離心5 min，第2次4 650×g離心6 min，是制備PRP最佳條件。AMABLE等[11]研究了溫度變化對PRP的影響，認為離心血量為4.5 mL時，第1次離心控制溫度為18 ℃，300×g離心5 min；第2次離心時18 ℃，700×g離心17 min是制備PRP的最佳條件。PEREZ等[12]使用3.5 mL人血制備PRP時，第1次離心100×g離心10 min，第2次離心400×g離心10 min，丟棄2次離心后2/3的上清液，血小板回收率可達到70%～80%，濃度提高5倍，并且維持了血小板的完整性和活性。該作者認為時間和加速度是確定第1步離心后PRP樣品成分的關(guān)鍵，血小板大小[13]、個體間的生物差異、紅細胞容積變異等因素對血小板濃度均有影響。離心后手動混合的時間短，難以完全重懸血小板，大約20%的血小板仍然吸附在紅細胞顆粒中，因此容易出現(xiàn)血小板計數(shù)時變異較大的情況。

由于眾多的研究并無統(tǒng)一的實施標準，且大多數(shù)研究沒有提供足夠的信息來允許該實驗被重現(xiàn)，所以，研究之間缺乏可比性，讀者能獲取的有效信息仍不足[14]。張長青等[15]研究認為，盲目采取文獻中報道的離心力和離心時間是不可取的，必須根據(jù)實際情況，制訂出與設(shè)備相配套的離心方法，才能制備出有效的PRP。本文認為，制備PRP的影響因素較多，在許多醫(yī)療機構(gòu)并不具備實施相關(guān)研究的條件下，參考文獻中的方法仍是獲得技術(shù)指導(dǎo)的重要途徑，第1次離心時選擇較小離心力(200×g左右)可以減少血小板在紅細胞間隙的沉積和第1次轉(zhuǎn)移時的損耗，第2次離心力可以稍大(700×g左右)，可以提高血小板回收率和避免血小板在高離心力的作用下大量被破壞激活而影響使用效果。

2 PRP的抗菌效應(yīng)

2.1抗菌機制 近年來，越來越多的文獻證實，PRP無論在體內(nèi)和體外均具有抗菌和抗炎活性，目前對PRP的抗菌效應(yīng)研究，集中在其所含的高濃度血小板和白細胞方面。血小板具有直接和間接的抗菌效應(yīng)，一方面，血小板最早參與微生物病原體的識別，激活并招募其他免疫細胞參與宿主防御，使感染迅速控制在局部。另一方面，血小板分泌抗菌肽和細胞因子源性肽(Kinocidins),其獨特的分子結(jié)構(gòu)和攜帶的表面電荷，是其發(fā)揮直接抑菌作用的重要基礎(chǔ)[16]。一些抗菌肽可以通過破壞細菌細胞膜，抑制微生物RNA合成、脂質(zhì)絡(luò)合、蛋白合成或蛋白折疊，滅活細菌毒素，激活細菌的自溶系統(tǒng)，進而發(fā)揮抗菌效應(yīng)[17-18]。由于血小板特殊的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，其介導(dǎo)炎性細胞的趨化和免疫細胞的調(diào)節(jié)也在其抗菌效應(yīng)中發(fā)揮一定作用。

對于PRP所含白細胞的抗菌效應(yīng)，目前仍有爭議[19]。在人體血液系統(tǒng)中，白細胞在天然宿主防御中起著重要作用，其可以介導(dǎo)細胞免疫，通過各種細胞因子和生物蛋白趨化、聚集和活化巨噬細胞、中性粒細胞，吞噬病原微生物，所以很多人都認為白細胞增加了PRP的抗菌作用[20]。然而，事實可能并非如此。如MARIANI等[21]通過體外抗菌實驗研究了含不同白細胞的PRP制劑對一些細菌的抗菌效應(yīng)，得出結(jié)論，認為白細胞的存在并不會增加血小板在體外的殺菌活性。

2.2PRP抗菌譜 目前已有一些體外抑菌實驗驗證PRP或者富血小板凝膠(platelet-rich gel，PRG)對某些細菌的抗菌作用，這些研究認為PRP及PRG對包括甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大埃希桿菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯桿菌、白色念珠菌、口腔鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌等可能存在抗菌效應(yīng)。此外，近期研究顯示PRP對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)也有抗菌活性；不過，由于研究者技術(shù)的差異、細菌菌種、毒力、濃度的差異，在抑菌實驗中即便是對同種細菌也可能顯示出不同結(jié)果。如MAGHSOUDI等[22]體外抑菌實驗表明，二次離心法制備的PRP對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、無乳鏈球菌、志賀菌屬有抑菌效應(yīng)，對銅綠假單胞、肺炎克雷伯桿菌、沙雷菌屬無抑菌作用,全血和PPP對上述細菌無任何抑菌效果。該作者認為血小板發(fā)揮的是抑菌而非殺菌作用，并且血小板含量越高，效果越強。而CETINKAYA等[23]研究表明，PRP和PPP在體外對MRSA、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌有抑制作用。因此，目前為止，PRP及其衍生制品的抗菌譜仍需進一步探索。

2.3抗菌效應(yīng)臨床研究 血小板可以通過脫顆粒作用釋放包括血小板源性生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮樣生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)在內(nèi)的多種生長因子，以及趨化因子、黏蛋白、抗纖維溶蛋白等物質(zhì)，在組織的修復(fù)、血管的生成、細胞的誘導(dǎo)分化等方面發(fā)揮重要作用。臨床上將其應(yīng)用于軟組織的修復(fù)已不少見，但是，鑒于PRP在促進組織修復(fù)的同時所展現(xiàn)出來的獨特抗菌效應(yīng)，逐漸有人將其運用于各種感染性創(chuàng)面的臨床研究中。如CHEN等[2]以60例難治性下肢傷口感染患者為研究對象，以自體PRG和生理鹽水作對比處理傷口，通過7 d的治療及隨訪患者的治愈時間，發(fā)現(xiàn)自體PRG可減少創(chuàng)面面積，減少創(chuàng)面細菌的數(shù)目，縮短創(chuàng)面愈合時間，減少并發(fā)癥的發(fā)生。SERRAINO等[24]為了研究PRP能否在心臟外科手術(shù)中降低胸骨切口淺部及深部感染的概率，以1 093例接受了胸骨正中切開的心臟手術(shù)的患者為研究對象，將患者分為A、B兩組，A 組患者在手術(shù)完成切口關(guān)閉時不使用PRP，而 B組患者在關(guān)閉切口前使用PRP。實驗數(shù)據(jù)表明，A 組患者的深部切口感染明顯比 B 組要高(1.5%vs. 0.20%，P<0.05);并且A組患者的淺表切口感染也明顯高于B組(2.8%vs. 0.5%，P<0.05)，由此得出結(jié)論，認為PRP的應(yīng)用明顯地降低了胸骨切口淺表和深部的感染率。此外，另外一項納入2 000例行了開胸手術(shù)的患者的研究也證實了PRP可以有效降低術(shù)后傷口感染等并發(fā)癥的發(fā)生率，并建議所有接受胸骨切開術(shù)的患者，應(yīng)考慮常規(guī)使用PRP[25]。不過，并非所有研究都能驗證PRP的抗感染效果，一項薈萃分析納入了完全隨機對照和非完全隨機對照試驗，共1 316例行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者以評估PRP的使用價值和安全性，卻發(fā)現(xiàn)PRP與安慰劑的感染發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)[26]。SANGIOVANNI等[27]比較納入了500例足踝手術(shù)患者的前瞻性對照研究也發(fā)現(xiàn)，術(shù)中應(yīng)用PRP并不能降低術(shù)后感染或傷口延遲愈合的發(fā)生率。所以，PRP的抗感染效應(yīng)需要更多大型的隨機對照試驗研究以證實。不過，也不能因此而拒絕使用PRP技術(shù)，畢竟，其強大的組織修效應(yīng)才是人們更應(yīng)關(guān)注的內(nèi)容。

3 結(jié) 語

綜上所述，目前對于PRP的制備仍然缺乏一個統(tǒng)一的標準，影響其最終成品的因素較多，包括離心力、離心時間、離心溫度、采血管、抗凝劑的選擇、供血者的個體差異、人員的操作技術(shù)、離心設(shè)備條件等。PRP有其獨特的抗菌譜并逐漸完善，并且PRP中所含成分復(fù)雜，在某些體外抑菌實驗中表現(xiàn)出的抗菌效應(yīng)背后有極多的內(nèi)容需要探索。此外，隨著臨床上耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，PRP與抗生素的聯(lián)合使用可能會成為新的方向，相信PRP這項極具實用價值的技術(shù)最終會在臨床上普及并造福人類。