Mn-SOD的提取及其應(yīng)用研究進展

秦 松,何雨峰,況嘉鈾,范淑敏,黃邵培,王偉平

(發(fā)酵工程教育部重點實驗室,湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北武漢 430068)

超氧化物歧化酶(SOD)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶,是良好的超氧陰離子自由基清除劑,能夠催化細胞體內(nèi)的超氧陰離子自由基,生成氧和過氧化氫。SOD主要存在于動物植物及微生物中[1]。根據(jù)其所含金屬輔基的種類,可分為CuZn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD。Fe-SOD主要存在于原核細胞及一些植物中;CuZn-SOD主要存在于真核細胞細胞漿、葉綠體和過氧化物酶體內(nèi);而Mn-SOD主要存在于真核細胞線粒體和原核細胞內(nèi)[2]。Mn-SOD是由約203個氨基酸殘基構(gòu)成的四面體,結(jié)構(gòu)簡單[3],其在原核生物中多為二聚體,在真核生物中多為四聚體,各亞基基本相同,每個亞基的相對分子質(zhì)量一般為23 kDa,平均每個亞基含0.5～1個Mn原子。線粒體是細胞呼吸的主要場所,而氧化呼吸鏈的電子傳遞過程是機體形成自由基的重要方式之一。因此,位于線粒體內(nèi)的Mn-SOD作為清除超氧陰離子的第一道防線,它在生物體內(nèi)的表達和調(diào)控對于平衡機體的氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持起著十分重要的作用。近年來,關(guān)于Mn-SOD的研究不斷深入,Mn-SOD的生理特性引起了人們的濃厚興趣,與其相關(guān)研究也日趨活躍。本文就Mn-SOD的動植物以及微生物來源、基因工程菌生產(chǎn)及其應(yīng)用進展進行綜述。

1 Mn-SOD的提取

Mn-SOD是一種具有生物活性的酶,其本質(zhì)是蛋白質(zhì)。因此,Mn-SOD的生產(chǎn)提取本質(zhì)是蛋白質(zhì)的提取分離。然而,和一般蛋白質(zhì)的提取相比,由于在細胞內(nèi)含量很少,生產(chǎn)提取Mn-SOD較為復(fù)雜;同時,Mn-SOD作為具有生物活性的大分子物質(zhì),在提取純化的過程中需要選取恰當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

1.1 從動物中提取Mn-SOD

Mn-SOD在動物肝臟[4-5]、心臟[6]、肌肉[7]等中含量豐富。提取動物組織中Mn-SOD的普遍做法是以動物的肌肉、內(nèi)臟為材料,進行機械勻漿,然后經(jīng)過有機溶劑、鹽類沉淀或?qū)游鲋蛛x得到Mn-SOD。

Mn-SOD首先是以無活性形式從雞肝中分離得到的,當(dāng)時被稱為“禽錳素”[5]。隨后,又從人肝中分離到該蛋白質(zhì),即Mn-SOD[4]。任美鳳等[6]將雞心用機器破碎成勻漿并進行抽提,用正丁醇除脂,然后丙酮分級沉淀,得到Mn-SOD。該酶的比活是1633 U/mg,純化倍數(shù)139.16,全分子相對分子質(zhì)量為103.7 kDa,其亞基相對分子質(zhì)量23.6 kDa。Makoto Ikebuchi等[7]通過扇貝肌肉組織分離得到Mn-SOD,并測得扇貝Mn-SOD的相對分子質(zhì)量約為93～95 kDa,其由四個相同的分子量約為24～25 kDa的亞基組成。姚翠鸞[8]將使用熱處理、硫酸銨分級鹽析和柱層析等方法,從日本沼蝦肌肉組織分離得到Mn-SOD,其亞基分子量約為20 kDa。

以上可以看出,一般動物源所得到的Mn-SOD相對分子質(zhì)量較大,約為100 kDa左右,且都具有分子量約為20 kDa的亞基。

1.2 從植物中提取Mn-SOD

從植物中分離Mn-SOD,一般是以植物的葉片為材料[9-12],經(jīng)破胞沉淀得到均一Mn-SOD。除此之外,采用金屬螯合親和層析并結(jié)合離子交換層析同樣可以得到Mn-SOD。

楊雄等[9]通過對韭菜線粒體進行硫酸銨沉淀經(jīng)硫酸、柱層析和凝膠過濾,將韭菜線粒體SOD純化到均一程度,得到韭菜Mn-SOD,分子量為82 kDa,由四個相同分子量約為22 kDa亞基組成,酶比活力達1200 U/mg蛋白。鄒國林等[10]通過小白菜線粒體成功獲取Mn-SOD,其亞基相對分子質(zhì)量為21.8 kDa,酶比活力為1289 U/mg。趙曉瑜等[11]利用金屬螯合親和層析,結(jié)合DEAE-纖維素離子交換層析,從玉米勻漿液中分離純化到電泳純的Mn-SOD組分,通過雙向電泳和SDS-PAGE分析表明,玉米Mn-SOD的亞基分子質(zhì)量26.2 kDa,等電點為5.3。程光宇等[12]從朱桔葉分離得到Mn-SOD,分子量為54.0 kDa,該酶在SDS-PAGE圖譜上呈現(xiàn)單一區(qū)帶,其亞基分子量為26.6 kDa,酶比活性為1249 U/mg。饒麗莎等[13]采用qRT-PCR技術(shù),分析杉木不同組織部位Mn-SOD基因的表達量差異發(fā)現(xiàn),Mn-SOD在杉木葉片中表達較高,而根和莖表達量相對較低,這也為主要采用植物葉片作為原材料來提取植物Mn-SOD提供了依據(jù)。

可以看出,不同植物來源的Mn-SOD相對分子質(zhì)量有所不同,但都具有亞基,酶活均為1300 U/mg左右。然而,一般而言,通常在植物組織中富含有機酸、維生素、微量元素及酚類和黃酮類物質(zhì),在提取Mn-SOD的過程中需要注意選擇恰當(dāng)?shù)姆椒?避免酶活性的喪失。

1.3 從微生物中提取Mn-SOD

由于動植物的資源相對有限,工藝較為繁雜,為了得到大量的Mn-SOD,許多研究學(xué)者將Mn-SOD獲取來源轉(zhuǎn)向微生物。從微生物中分離Mn-SOD,以微生物菌體為材料,一般采用硫酸銨進行分級沉淀、柱層析以及離子交換的方法。

侯玉艷等[14]采用熱擊法和硫酸銨分級沉淀法對所提取的黑脈羊肚菌SOD進行純化,對純化后酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、敏感性及同工酶類型等進行研究。該熱擊法最佳熱擊溫度為60 ℃,最佳熱擊時間為15 min;而硫酸銨分級沉淀法最佳鹽溶條件是采用40%飽和度硫酸銨,最佳鹽析條件是采用85%飽和度硫酸銨,用鄰苯三酚自氧化法檢測酶活得到比活力為306.29 U/mg的Mn-SOD,且在60 ℃保溫30 min仍能保留80%的酶活,在pH6～9的條件下仍能表現(xiàn)較高的酶活,具有很好的穩(wěn)定性。武金霞等[15]采用硫酸銨分級鹽析、離子交換柱層析、分子篩柱層析分離純化,得到雙孢蘑菇子實體Mn-SOD,其分子量為43 kDa,亞基分子量為21 kDa,鄰苯三酚自氧化法檢測酶活酶活高達5512.6 U/mg?？梢钥闯?直接從微生物菌體分離得到Mn-SOD主要采用硫酸銨分級沉淀等方法。除此之外,陸玲等[16]以金針菇液體發(fā)酵菌絲為材料,用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳及抑制劑處理法,得到比活力為120 U/mL的Mn-SOD粗酶液,為分離提取MnSOD提供了一種新的方法思路。

以微生物為原材料較為廉價,相比動植物來源的Mn-SOD,由微生物中獲取的Mn-SOD活性較高[15],且對外界環(huán)境有著良好的耐受性[14],在工業(yè)應(yīng)用上前景較好。

1.4 利用基因工程菌提取Mn-SOD

近年來,隨著科技發(fā)展,構(gòu)建基因工程菌生產(chǎn)Mn-SOD已成為國內(nèi)外的研究熱點。利用基因工程菌提取Mn-SOD發(fā)展迅速,研究成果較多,該方法主要是首先通過PCR等方法獲得動物[17-19]、植物[20-21]和微生物細胞[22-25]的Mn-SOD基因,然后構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)移至畢赤酵母、大腸桿菌或乳酸乳球菌等目標菌體中表達。利用基因工程菌產(chǎn)Mn-SOD具有產(chǎn)出快、產(chǎn)量高的優(yōu)點,是動植物提取法所無法比擬的。

1.4.1 動物來源的Mn-SOD基因在細胞中的表達 直接從動物組織提取MnSOD,產(chǎn)率低、產(chǎn)出慢,因此不少學(xué)者利用基因工程手段,獲得動物基因表達的Mn-SOD。張慶利等[17]采用PCR方法擴增編碼中國明對蝦線粒體Mn-SOD成熟肽的基因,并克隆到大腸桿菌表達載體中進行體外重組表達,將所得重組蛋白通過金屬鰲合柱進行純化,進而透析、復(fù)性,獲得了活性高達2373 U/mg的重組蛋白。凌敏等[18]以人肝細胞株(L02)總RNA為模板,用RT-PCR擴增出人Mn-SOD cDNA,構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21,獲得了產(chǎn)Mn-SOD的重組蛋白菌株,其酶活達216.13 U/mg。而王峰等[19]以小鼠肝臟cDNA為模板,利用PCR方法克隆小鼠Mn-SOD基因,PCR擴增了1個長600 bp左右的基因片段,將其插入pET15b載體中,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta-gami,獲得Mn-SOD比活力為531.7 U/mg的工程菌。

可以發(fā)現(xiàn),與直接從動物組織中獲取MnSOD,通過重組動物來源的MnSOD基因在基因工程菌中表達得到的MnSOD,酶活較高[17],且能利用基因工程菌大量表達獲取高產(chǎn)量的動物來源的Mn-SOD。

1.4.2 植物來源的Mn-SOD基因在細胞中的表達 由于提取植物中Mn-SOD工藝相對復(fù)雜,一些學(xué)者導(dǎo)入植物來源的Mn-SOD到基因工程菌中,通過基因工程菌表達提取植物源MnSOD。馬紅丹等[20]將克隆的大豆Mn-SOD基因開放閱讀框序列重組到經(jīng)改造的質(zhì)粒pNZS上,分泌表達載體pNZS-SOD,以電穿孔法轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌L.lactis NZ3900,獲得能夠分泌表達外源Mn-SOD的基因工程菌。徐龍等[21]以茄子葉片cDNA為模板,擴增出帶有SpeI和BglII酶切位點的ORF全長,然后分別用內(nèi)切酶SpeI和BglII酶切擴增產(chǎn)物Mn-SOD基因和pCAMBIA 1302植物表達載體,回收酶切產(chǎn)物并用T4 DNA連接酶在4 ℃條件下連接6 h,獲得轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,其所編碼蛋白的分子量為25.63 kDa。

通常在植物組織中富含有機酸、維生素、微量元素及酚類和黃酮類物質(zhì),在提取Mn-SOD的過程中會導(dǎo)致酶活性的部分喪失。而通過重組植物來源的Mn-SOD基因在基因工程菌中表達提取Mn-SOD,能很好避免這一問題。

1.4.3 微生物來源的Mn-SOD基因在細胞中的表達 不僅是動物植物,一些研究者也對微生物Mn-SOD基因進行克隆表達。張麗青等[22]通過克隆嗜熱毛殼菌錳超氧化物歧化酶基因,進行畢赤酵母真核表達,獲得重組菌株,并純化重組蛋白,該工程菌酶活力達906.23 U/mL;該重組酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃,最適pH為6.0;在70 ℃的條件下保溫30 min后仍具有71%的酶活力。趙怡[23]以枯草芽孢桿菌ATCC 9372基因組為模板,PCR擴增獲得Mn-SOD基因,并在大腸桿菌BL21中首次成功表達。該研究得到的蛋白分子量約為26 kDa,菌體可溶性總蛋白SOD比活為51.09 U/mg。王黎明等[24]以蠟樣芽孢桿菌M22的Mn-SOD基因構(gòu)建了畢赤酵母表達質(zhì)粒pPICZA-Mn-SOD,質(zhì)粒線性化后通過電激法導(dǎo)入畢赤酵母GS115,得到高拷貝重組菌株,其表達蛋白的相對分子量約為23 kDa。鄧盾等[25]從南海沉積物中分離到一株耐高溫菌Bacillussp. SCSIO 15029,從其基因組中克隆了一個編碼超氧化物歧化酶的基因BaSOD,并在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)了可溶性異源表達,發(fā)現(xiàn)所表達的MnSOD的最適pH為7.5,最適反應(yīng)溫度為40 ℃,酶活為5511.46 U/mg,具有良好的熱穩(wěn)定性,在60 ℃處理30 min酶活基本沒有變化,在70 ℃下處理30 min,剩余酶活為71%,具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

基因工程菌具有生長快、培養(yǎng)周期短的特點,其發(fā)酵產(chǎn)品具有高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的優(yōu)點。與直接從微生物中獲取MnSOD,通過重組微生物來源的MnSOD基因,在基因工程菌中表達提取MnSOD,能有效地縮短MnSOD的產(chǎn)出時間,并提高MnSOD的產(chǎn)量。

2 Mn-SOD的應(yīng)用

基于Mn-SOD良好的抗氧化和防御疾病等作用,近年來科學(xué)工作者在農(nóng)業(yè)[13,26-27]和臨床醫(yī)學(xué)[28-39]上進行了廣泛的應(yīng)用研究。

2.1 Mn-SOD在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的研究

在農(nóng)業(yè)上,研究發(fā)現(xiàn)Mn-SOD能夠提高農(nóng)作物的抗逆性,如抗寒、抗旱、抗鹽害等特性。Bowler C等[26]通過轉(zhuǎn)基因的方法,使煙草和玉米植株表達Mn-SOD水平提升,發(fā)現(xiàn)Mn-SOD在煙草和玉米葉綠體中的過量表達能夠增強轉(zhuǎn)基因煙草和玉米對質(zhì)膜的保護作用和對除草劑引起的氧脅迫的耐受性;還有報道稱,杉木在低溫、干旱、鋁、鹽脅迫等逆境條件下均能快速誘導(dǎo)Mn-SOD的表達,并且分別在12、24、48 h達到峰值,且分別是對照組的47.94、3.29、22.21、33.88倍[13]。鄧婷婷[27]用Mn-SOD基因的表達載體轉(zhuǎn)染SOD缺陷型大腸桿菌并誘導(dǎo)其表達后發(fā)現(xiàn)該大腸桿菌在耐鹽、耐輻射和抗寒方面的耐受性均有明顯提高。這些研究發(fā)現(xiàn)為Mn-SOD在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用和發(fā)展提供了有利依據(jù)。

2.2 Mn-SOD在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用研究

在醫(yī)學(xué)上,Mn-SOD的應(yīng)用研究成果頗豐。近年來,有報道稱Mn-SOD在治療高血壓[28]、糖尿病視網(wǎng)膜病變[29]、抗輻射[30]、急性肺損傷[31]、癌癥研究領(lǐng)域[32-38]等方面均有應(yīng)用。

2.2.1 在治療糖尿病上的應(yīng)用 糖尿病和高血壓被稱為同源性疾病,兩種疾病無論是病因、互相影響還是危害上都存在共通性,常常合并發(fā)作,形成糖尿病高血壓。近年來有報道稱,Mn-SOD能夠在高血壓和糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療中發(fā)揮作用。如Case等[28]研究發(fā)現(xiàn),在大鼠穹窿下器官中過度表達Mn-SOD可顯著降低血壓,為Mn-SOD在高血壓的臨床治療提供了新的思路。Kanwar等[29]研究發(fā)現(xiàn),線粒體超氧化物歧化酶(Mn-SOD)能對糖尿病視網(wǎng)膜線粒體氧化損傷提供保護,該實驗研究了超氧陰離子和GSH水平對糖尿病的影響,探討錳超氧化物歧化酶在小鼠體內(nèi)表達Mn-SOD和視網(wǎng)膜線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng),證實了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病與錳超氧化物歧化酶的相關(guān)作用。這些研究為Mn-SOD治療糖尿病提供了新思路。

2.2.2 在癌癥上的應(yīng)用 Oberley[30]提出細胞癌變假設(shè),認為正常細胞超氧陰離子生成與Mn-SOD活性保持動態(tài)平衡;其研究發(fā)現(xiàn),Mn-SOD的活性與癌癥的發(fā)生有著密切的關(guān)系。

2.2.2.1 在前列腺癌上的應(yīng)用 王明臣等[31]分析了Mn-SOD基因在前列腺癌(PCa)及良性前列腺增生(BPH)組織中的mRNA表達情況,揭示了氧化應(yīng)激損傷在PCa發(fā)生過程中的作用,證明了Mn-SOD基因表達低下導(dǎo)致的氧化應(yīng)激加劇可能在前列腺癌的發(fā)生中起著重要作用。

2.2.2.2 在腎癌上的應(yīng)用 在腎癌的研究領(lǐng)域,Zhao等[32]報道了應(yīng)用數(shù)據(jù)依賴的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法對腎癌細胞(Rcc)進行氧化修飾,通過本體分類、相互作用網(wǎng)絡(luò)和Western blotting分析表明,腎癌細胞介導(dǎo)的蛋白質(zhì)與Mn-SODn密切相關(guān)。當(dāng)Mn-SOD表達水平正常時,癌組織相對的Mn-SOD酶活性降低,提示腎癌組織中Mn-SOD酶活性因修飾而受損。同時,Zhao等[33]還對Mn-SOD在透明細胞癌(CcRCC)組織中的表達情況進行研究,研究結(jié)果顯示透明細胞腎細胞癌中Mn-SOD mRNA的表達高于正常組織,且Mn-SOD蛋白的表達與正常腎細胞癌的表達呈負相關(guān);并且發(fā)現(xiàn),低Mn-SOD表達與腫瘤特異性生存預(yù)后較差有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明,MnSOD是腎透明細胞癌的一個有前景的預(yù)后指標,提示氧化應(yīng)激可能參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

2.2.2.3 在骨癌上的應(yīng)用 樓列名等[34]探討了錳型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因轉(zhuǎn)染對人骨肉瘤細胞的誘導(dǎo)凋亡作用,采用電穿孔方法將反義和正義Mn-SOD cDNA表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染OS-732骨肉瘤細胞,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Mn-SOD質(zhì)?？烧T導(dǎo)OS-732細胞凋亡,研究結(jié)果表明,Mn-SOD有望成為新的骨肉瘤細胞抑制劑。

2.2.2.4 在其他癌癥上的應(yīng)用 田剛等[35]利用同源重組的方法在痘苗病毒VG9的中插入Mn-SOD基因,構(gòu)建出重組溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,并將重組溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD及VG9分別轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株7901;轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn),MnSOD蛋白可在胃癌細胞中呈高表達,且重組溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD對胃癌細胞具有明顯的殺傷作用。研究表明,MnSOD能夠通過誘導(dǎo)細胞凋亡來產(chǎn)生抗癌作用的。此外,Zhang等[36]發(fā)現(xiàn)Mn-SOD表達對溶瘤腺病毒有抑制作用,Mn-SOD是結(jié)直腸癌患者最有效的輔助治療。

2.2.3 在其他疾病研究上的應(yīng)用 在其他的疾病防御上,研究表明Mn-SOD有著重要作用。例如,郭洪亮等[37]應(yīng)用復(fù)制缺陷型單純皰疹病毒(HSV)作為錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和綠色熒光蛋白(GFP)基因載體轉(zhuǎn)染小鼠小腸上皮實驗,結(jié)果表明Mn-SOD的過度表達具有顯著的放射性保護作用。Arcaroli等[38]發(fā)現(xiàn),細胞外SOD是一種強有力的抗氧化劑,在控制氧化劑介導(dǎo)的應(yīng)激和炎癥中起著重要的作用,急性肺損傷在感染患者中經(jīng)常發(fā)生,而在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷動物模型中Mn-SOD水平對肺損傷的嚴重程度有明顯的調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)語與展望

本文介紹了從動植物、微生物以及基因工程菌中分離獲取Mn-SOD及其應(yīng)用研究。Mn-SOD作為一種氧化還原酶,常存在于真核細胞的線粒體和原核生物中,最早獲取Mn-SOD的方法就是主要是從動物的肌肉肝臟和植物的葉片中直接提取得到Mn-SOD。這類獲取Mn-SOD的方法操作簡單,工藝條件成熟,但是存在著產(chǎn)率較低和活性較低的缺點。而通過發(fā)酵培養(yǎng)微生物,得到大量菌體,再進行提取純化,提取得到Mn-SOD產(chǎn)品,產(chǎn)出快,產(chǎn)量高,極好地克服了動植物直接提取法的缺點。

近幾年,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展,Mn-SOD已大多由原來的動植物提取過渡到基因工程技術(shù)來生產(chǎn),產(chǎn)率與活性得到進一步提高。傳統(tǒng)的Mn-SOD穩(wěn)定性較差,很難在商品中長期保存。而利用基因工程菌得到耐熱性較高的Mn-SOD,解決了其穩(wěn)定性問題,也為今后Mn-SOD的開發(fā)提供了新思路。此外,國內(nèi)外在Mn-SOD的應(yīng)用等方面的研究報道頗多。尤其是在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,其用于疾病機理的研究及診斷已成為當(dāng)前的研究熱點。這也表明,Mn-SOD在醫(yī)學(xué)研究上有著其良好的特性。隨著研究的深入,利用基因工程菌生產(chǎn)Mn-SOD逐步實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,相信其在藥品、食品等領(lǐng)域可以發(fā)揮巨大的潛力。