非變性Ⅱ型膠原蛋白改善骨關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展

王海燕,孫君社,劉愛青,劉 爽,鄒國(guó)慶

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院,北京 100125;2.北京盛美諾生物技術(shù)有限公司,北京 100062;3.海南盛美諾生物技術(shù)有限公司,海南文昌 571924)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病,又稱骨關(guān)節(jié)病、退行性骨關(guān)節(jié)病,影響全身大部分關(guān)節(jié)包括頸腰椎、膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)和指間關(guān)節(jié)等。骨關(guān)節(jié)炎是逐漸進(jìn)展加重性的疾病,目前的治療以延緩病情發(fā)展,以減輕疼痛和改善關(guān)節(jié)功能為目的[1]。薛慶云等[2]選擇了六個(gè)中心城市進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果顯示中國(guó)40歲以上人群原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎總體患病率為46.3%,隨年齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)增高的趨勢(shì),且女性(50.4%)高于男性(41.6%)。預(yù)計(jì)到2050年,我國(guó)60歲以上老年人將達(dá)4.8億,占總?cè)丝诘?4.1%,將成為全球老齡化最嚴(yán)重的國(guó)家,骨關(guān)節(jié)炎患者數(shù)量將會(huì)急劇增加,嚴(yán)重影響國(guó)人的身體狀況和生活質(zhì)量。

目前改善骨關(guān)節(jié)炎常用的膳食補(bǔ)充劑有氨基葡萄糖、硫酸軟骨素、乳香、姜黃和魚油等,但是這些膳食補(bǔ)充劑都存在一定局限性,學(xué)者們對(duì)氨基葡萄糖和硫酸軟骨素改善OA效果存在爭(zhēng)議[3],乳香會(huì)引起腸道不適,姜黃生物利用率低,魚油有不耐受和腹瀉的報(bào)道[4],因此開發(fā)安全有效的功能性原料十分必要。上世紀(jì)90年代,非變性Ⅱ型膠原蛋白用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,此后又開展了其改善骨關(guān)節(jié)炎的研究。研究結(jié)果表明非變性Ⅱ型膠原蛋白具有方便、安全無(wú)毒及抗原特異性等優(yōu)點(diǎn),將會(huì)成為預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的革命性功能原料。

1 非變性Ⅱ型膠原蛋白的特點(diǎn)和作用機(jī)理

1.1 非變性Ⅱ型膠原蛋白的特點(diǎn)

關(guān)節(jié)軟骨是覆蓋在滑液關(guān)節(jié)內(nèi)骨質(zhì)表面的一層軟骨組織,呈淺藍(lán)白色,半透明,光滑而有光澤,厚1～5 mm,由少量的軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。膠原纖維占成人關(guān)節(jié)軟骨干重的2/3。目前已知正常成人關(guān)節(jié)軟骨中含有Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型、Ⅸ型、X型、Ⅺ型、Ⅻ型和XIV型膠原,由Ⅱ型、Ⅸ型和XI型膠原組成的異聚體構(gòu)成軟骨纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu),其中Ⅱ型膠原占膠原總數(shù)的80～90%[5]。Ⅱ型膠原蛋白(collagen typeⅡ,CII)發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)70年代初,由MILLER從雞軟骨組織分離得到[6]。CII是由3條相同的al(II)鏈構(gòu)成的同型三聚體超螺旋結(jié)構(gòu),與其他成纖膠原蛋白如I型和Ⅲ型在氨基酸組成上有一個(gè)主要區(qū)別,即CII中羥賴氨酸的含量是后兩者的2～4倍,且大部分羥賴氨酸都被糖基化[7]。

非變性Ⅱ型膠原蛋白是以動(dòng)物軟骨為原料,采用低溫提取技術(shù),得到的完整保留大分子膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化的膠原蛋白產(chǎn)品,分子量在300000 Da左右。與目前市場(chǎng)上的膠原蛋白產(chǎn)品相比,最大的區(qū)別在于目前的膠原蛋白產(chǎn)品實(shí)質(zhì)上都是大分子膠原蛋白經(jīng)酶解后,三四級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全破壞的膠原蛋白肽,平均分子量在10000 Da以下。

1.2 非變性Ⅱ型膠原蛋白的作用機(jī)理

非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠改善骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理為口服免疫耐受(Oral tolerance,OT),是指口服某種蛋白質(zhì)抗原后,導(dǎo)致局部腸相關(guān)淋巴組織特異免疫,從而抑制全身免疫應(yīng)答,是一種外周免疫耐受形式[8],該反應(yīng)最早報(bào)道于1911年,距今已有100年的歷史[9]。

細(xì)胞因子在骨關(guān)節(jié)炎軟骨病變中起了重要作用。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí),IL-1、IL-6和TNF-α等促炎癥細(xì)胞因子增多,影響胞核內(nèi)基因(如PGE2、NO、MMP、蛋白多糖酶、膠原酶等)轉(zhuǎn)錄,引起軟骨基質(zhì)降解和軟骨細(xì)胞損傷;而抗炎細(xì)胞因子有TGF-β、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1和IL-4、IL-10、IL-13等,抗炎細(xì)胞因子可以增強(qiáng)軟骨組織的修復(fù)能力,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成,抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,降低軟骨組織的損傷[10-12]。據(jù)研究報(bào)道,非變性Ⅱ型膠原蛋白的作用機(jī)理是口服后在胃蛋白酶和胃酸作用下,其三螺旋結(jié)構(gòu)部分解螺旋,變成可溶性大分子結(jié)構(gòu),到達(dá)小腸Peyer’s淋巴結(jié),經(jīng)腸道內(nèi)的抗原肽細(xì)胞APC在細(xì)胞內(nèi)將外源性抗原非變性Ⅱ型膠原蛋白進(jìn)行加工、處理,并形成MHC-抗原肽復(fù)合體,然后遞呈在APC的表面,激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生抗炎癥因子TGF-β、IL-4、IL-10,下調(diào)T細(xì)胞攻擊關(guān)節(jié)內(nèi)膠原活性,從而減輕疼痛和炎癥[13-15]。此外還有研究發(fā)現(xiàn),非變性Ⅱ型膠原蛋白的主要抗原區(qū)域分別為末端區(qū)域、螺旋區(qū)域和a鏈的中心位點(diǎn),其抗原肽表位大多數(shù)定位于250～273這一段序列[11,16]。

2 非變Ⅱ型膠原蛋白改善骨關(guān)節(jié)炎的研究

早在上個(gè)世紀(jì)90年代,已經(jīng)有美國(guó)學(xué)者研究了非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎的研究,近年來(lái)國(guó)內(nèi)也開展了Ⅱ型膠原蛋白的相關(guān)研究。

2.1 國(guó)內(nèi)外關(guān)于非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

2.1.1 國(guó)內(nèi)關(guān)于非變性Ⅱ性膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 中國(guó)最早研究非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎的是朱平等[17],他們于1999年采用牛軟骨Ⅱ型膠原蛋白飼喂佐劑關(guān)節(jié)炎SD大鼠,發(fā)現(xiàn)其可以推遲佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠發(fā)病,降低發(fā)病率,明顯減輕病變關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)和縮短病程,并在此后實(shí)驗(yàn)中證明了口服CII能夠誘導(dǎo)小腸派爾淋巴結(jié)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[18]。徐東紅等[19]2005年對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠灌胃雞CII,從大鼠OA軟骨降解、基質(zhì)金屬蛋白酶13和組織蛋白酶K水平三項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)比較其對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎改善。結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療性灌胃雞CII不能完全阻止,但可顯著延緩大鼠OA軟骨降解,并能降低基質(zhì)金屬蛋白酶13和組織蛋白酶K水平,預(yù)防性灌胃雞CII效果比治療性用藥更佳;而對(duì)照組布洛芬對(duì)軟骨降解及基質(zhì)金屬蛋白酶13和組織蛋白酶K水平無(wú)明顯影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,作者得出雞CII可能成為治療OA藥物的結(jié)論。陳麗娟等[20]2013年用大青鯊CII灌胃佐劑關(guān)節(jié)炎SD大鼠,發(fā)現(xiàn)其能通過(guò)灌胃誘導(dǎo)免疫耐受,減少遲發(fā)型超敏反應(yīng),使循環(huán)免疫復(fù)合物呈陰性,顯著提高IL-10的水平,修復(fù)踝關(guān)節(jié)軟骨表面損傷,顯著增加CD4+T淋巴細(xì)胞Fas/Apo-1的數(shù)量。

2.1.2 國(guó)外關(guān)于非變性Ⅱ性膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 國(guó)外對(duì)非變性Ⅱ型膠原蛋白改善動(dòng)物關(guān)節(jié)炎研究也很多。Carin等[21]2004年將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組:殼聚糖組1 mg,牛CII組1 mg,殼聚糖+牛CII組各1 mg,研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖可以減少胃蛋白酶對(duì)CII的降解,殼聚糖+CII組提高了Peyer’s淋巴結(jié)和脾中的IL-10含量,降低了IL-2含量,提高了TGF-β、IL-4、IL-10的mRNA水平,證實(shí)了非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠通過(guò)改變免疫因子改善關(guān)節(jié)炎癥狀。

Peal等[22]2007年以骨關(guān)節(jié)炎犬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行了研究,飼喂非變性Ⅱ型膠原蛋白120 d和停止飼喂后30 d分別進(jìn)行評(píng)估。從總體疼痛、跛行時(shí)疼痛、運(yùn)動(dòng)時(shí)跛行評(píng)分結(jié)果顯示,安慰劑組無(wú)效果,而實(shí)驗(yàn)組可以顯著降低骨關(guān)節(jié)炎造成的疼痛;但停止飼喂后30 d,疼痛恢復(fù)至原來(lái)水平。

Gupta等[16]2009年以骨關(guān)節(jié)炎馬為研究對(duì)象,探討雞非變性Ⅱ型膠原蛋白改善骨關(guān)節(jié)炎的效果。實(shí)驗(yàn)分為安慰劑組,雞非變性Ⅱ型膠原蛋白320、480、640 mg/d,氨糖+硫酸軟骨素(5.4+1.8) g,實(shí)驗(yàn)時(shí)間150 d。從總體疼痛、跛行和運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分結(jié)果顯示,安慰劑組無(wú)效果,雞非變性Ⅱ型膠原蛋白組能夠明顯減低關(guān)節(jié)疼痛,其中480 mg和640 mg組效果相同;氨糖和硫酸軟骨素組也可以降低關(guān)節(jié)疼痛,但效果不如雞非變性Ⅱ型膠原蛋白組。

此后Gupta等[23]2011年研究了雞非變性Ⅱ型膠原蛋白對(duì)中度骨關(guān)節(jié)炎犬的改善。實(shí)驗(yàn)分為安慰劑組,雞非變性Ⅱ型膠原蛋白40 mg/d,氨糖(2000+1600) mg硫酸軟骨素/d,雞非變性Ⅱ性膠原蛋白+氨糖+硫酸軟骨素/d,實(shí)驗(yàn)時(shí)間150 d。觀察結(jié)果顯示,三個(gè)給藥組都能夠降低疼痛,但只有雞非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠降低由骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的疼痛,這說(shuō)明其作用機(jī)理與氨糖和硫酸軟骨素不同,值得注意的是雞非變性Ⅱ性膠原蛋白+氨糖+硫酸軟骨素組也不具有降低由骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致疼痛的作用。

Lorenzo等[24]2013年研究了豬Ⅱ型膠原蛋白對(duì)關(guān)節(jié)炎模型鼠的作用,劑量分別為1、3和10 mg(kg·d),實(shí)驗(yàn)時(shí)間13 d。通過(guò)足壓試驗(yàn)和痛覺測(cè)量顯示,實(shí)驗(yàn)組可以顯著降低骨關(guān)節(jié)炎疼痛,且劑量越低,效果越明顯;能夠緩解姿勢(shì)不平衡,全面改善運(yùn)動(dòng)靈活性,降低血液和尿液中的CTX-Ⅱ水平。

Bagi等[25]2017年研究了雞非變性Ⅱ型膠原蛋白對(duì)半月板切除后骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的作用,實(shí)驗(yàn)分為正常組,對(duì)照組,假手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)組雞CII 0.66 mg/d,實(shí)驗(yàn)時(shí)間8 w。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組對(duì)比,雞非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠保護(hù)脛骨干骺端網(wǎng)狀骨質(zhì)的完整性,抑制骨贅形成和關(guān)節(jié)的退化。

2.2 國(guó)內(nèi)外非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎的人體試驗(yàn)

世界上最早關(guān)于非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)發(fā)表于1993年的《Science》。哈佛醫(yī)學(xué)院的David等[26]1993年采用隨機(jī)雙盲方法評(píng)價(jià)雞胸軟骨非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎效果,關(guān)節(jié)炎患者60人,實(shí)驗(yàn)周期3個(gè)月。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與安慰劑組相比,實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)腫脹、疼痛的癥狀明顯減輕,15米步行時(shí)間明顯縮短。

此后David等[27]2009年分別采用WOMAC法、VAS法和Lequesne法評(píng)價(jià)雞胸軟骨非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎效果,實(shí)驗(yàn)周期90 d,關(guān)節(jié)炎患者52人,每天服用雞胸軟骨非變性Ⅱ型膠原蛋白40 mg或者氨糖(1500+1200) mg硫酸軟骨素,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,非變性Ⅱ型膠原蛋白組與氨糖和硫酸軟骨素組改善骨關(guān)節(jié)炎有效率分別為33%/14%、40%/15.4%、20%/6%,可以看出非變性Ⅱ型膠原蛋白效果明顯好于氨糖和硫酸軟骨素。Robert等[12]2015年采用開放實(shí)驗(yàn),共17名關(guān)節(jié)炎患者參加,每天口服雞胸軟骨非變性Ⅱ型膠原蛋白20 mg+來(lái)自啤酒花的THIAAs 300 mg,實(shí)驗(yàn)時(shí)間12 w。調(diào)查問(wèn)卷結(jié)果顯示,服用2 w后即有明顯改善效果,12 w后所有人疼痛改善明顯。James等[28]2016年采用隨機(jī)雙盲多中心,并用WOMAC法,VAS法和Lequesne法評(píng)價(jià)雞胸軟骨非變性Ⅱ型膠原蛋白對(duì)關(guān)節(jié)炎的作用,實(shí)驗(yàn)分為非變性Ⅱ型膠原蛋白組40 mg/d,氨糖(1500+1200) mg硫酸軟骨素組/天,安慰劑組,關(guān)節(jié)炎患者191人,實(shí)驗(yàn)周期180 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示非變性Ⅱ型膠原蛋白組的WOMAC值與安慰劑組和氨糖+硫酸軟骨組相比有顯著差異,療效明顯好于安慰劑組和氨糖+硫酸軟骨素組,并且疼痛、晨僵和生理功能改善效果也十分明顯。

中國(guó)也開展了非變性膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎的人體試驗(yàn)。徐建華等[29]2006年采用隨機(jī)雙盲實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)口服雞Ⅱ型膠原蛋白對(duì)關(guān)節(jié)炎患者的作用,關(guān)節(jié)炎患者55人,口服雞Ⅱ型膠原膠囊90 μg/d或甲氨蝶呤10 mg/w,試驗(yàn)24 w。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),口服CII能明顯改善患者的休息痛、晨僵、壓痛關(guān)節(jié)指數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)指數(shù)、患者評(píng)價(jià)、日常生活能力、血沉和C反應(yīng)蛋白。

有文獻(xiàn)報(bào)道適量運(yùn)動(dòng)具有顯著促進(jìn)正向免疫調(diào)節(jié)的作用[30],但如果長(zhǎng)期從事大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的運(yùn)動(dòng)性免疫抑制現(xiàn)象[31]。為了評(píng)價(jià)非變性Ⅱ型膠原蛋白對(duì)健康人群關(guān)節(jié)是否有作用,James等[32]2013年采用隨機(jī)雙盲方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每天服用非變性Ⅱ型膠原蛋白40 mg或安慰劑,健康人數(shù)55人,實(shí)驗(yàn)120 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn),健康人服用非變性Ⅱ型膠原蛋白90 d后,膝關(guān)節(jié)伸展角度從基礎(chǔ)值(73.2±1.9) °提高到了(78.8±1.9)°(p=0.045),120 d后實(shí)驗(yàn)組膝關(guān)節(jié)伸展角度提高到了(81.0±1.3) °(p=0.002),而安慰劑組120 d后膝關(guān)節(jié)伸展角度為(74.0±2.2) °,與基礎(chǔ)值統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,作者認(rèn)為非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠延長(zhǎng)健康人群的劇烈運(yùn)動(dòng)無(wú)痛時(shí)間,并能夠降低健康人群由于運(yùn)動(dòng)造成關(guān)節(jié)疼痛的可能性。

通過(guò)以上研究可以發(fā)現(xiàn),無(wú)論是動(dòng)物模型還是臨床試驗(yàn),都可以證明非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠降低關(guān)節(jié)疼痛,提高運(yùn)動(dòng)靈活性,減輕關(guān)節(jié)炎癥狀,且其作用機(jī)理是口服免疫耐受,不同于氨基葡萄糖和硫酸軟骨素。非變性Ⅱ型膠原蛋白主要通過(guò)調(diào)節(jié)免疫因子來(lái)抑制炎癥發(fā)生,修復(fù)受損關(guān)節(jié),實(shí)驗(yàn)效果也好于氨基葡萄糖和硫酸軟骨素。

3 非變性Ⅱ型膠原蛋白的前景展望

2016年國(guó)家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)非變性Ⅱ型膠原蛋白(又更名為含Ⅱ型膠原蛋白軟骨粉)以雞胸軟骨為原料,經(jīng)清洗、消毒、粉碎后加入氯化鉀,在低溫條件下烘干后得到的含膠原蛋白的軟骨粉,可作為普通食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)。該產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)按照企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行,衛(wèi)生安全指標(biāo)按照GB2762、GB29921執(zhí)行。2017年盛美諾公司通過(guò)了非變性Ⅱ型膠原蛋白的SC許可,成為目前國(guó)內(nèi)唯一一家能夠規(guī)?；a(chǎn)非變性Ⅱ型膠原蛋白的企業(yè)。在美國(guó),由Lonza集團(tuán)控股Interhealth公司生產(chǎn)的UC-Ⅱ?非變性Ⅱ型膠原蛋白已經(jīng)在維骨力、鈣爾奇等產(chǎn)品中得到了應(yīng)用,在日本非變性Ⅱ型膠原蛋白作為關(guān)節(jié)支撐的功能性食品宣稱已經(jīng)得到了批準(zhǔn)[33]。

年齡是OA發(fā)病的最主要危險(xiǎn)因素,隨著中國(guó)老齡化程度日益加劇,骨關(guān)節(jié)炎患者將明顯增加,亟需改善骨關(guān)節(jié)炎癥狀的功能性原料。非變性Ⅱ型膠原蛋白已經(jīng)被批準(zhǔn)作為普通食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng),降低了市場(chǎng)準(zhǔn)入門檻,便于產(chǎn)品推廣應(yīng)用。該產(chǎn)品有助于加強(qiáng)關(guān)節(jié)健康,緩解關(guān)節(jié)疼痛,促進(jìn)關(guān)節(jié)靈活性,預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生,提高骨關(guān)節(jié)炎患者的生活質(zhì)量和身心健康,必將會(huì)成為改善關(guān)節(jié)炎的革命性功能原料,市場(chǎng)開發(fā)前景廣闊。