哈維氏弧菌致病因子檢測(cè)與防治研究進(jìn)展

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(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315211)

近年來(lái),水產(chǎn)品多為集約型養(yǎng)殖,使得養(yǎng)殖水域范圍內(nèi)水質(zhì)極易惡化,水產(chǎn)品頻繁爆發(fā)大規(guī)模的弧菌疾病。哈維氏弧菌作為其中一種主要致病弧菌,曾引起大量養(yǎng)殖水產(chǎn)品染病甚至死亡[1-5]。哈維氏弧菌為發(fā)光的革蘭氏陰性弧菌,呈短桿狀,長(zhǎng)約1～2 μm,極端單鞭毛,可運(yùn)動(dòng),最適宜生長(zhǎng)溫度為20～35 ℃。在TCBS培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成圓形黃色菌落,邊緣整齊,直徑約為1～1.5 mm[6]。哈維氏弧菌有一定嗜鹽性,可以利用葡萄糖,對(duì)O/129敏感。對(duì)環(huán)丙沙星、氯霉素、恩諾沙星、美羅培南、頭孢曲松、多西環(huán)素、頭孢吡肟、諾氟沙星敏感,而對(duì)氨芐西林耐受性強(qiáng)[7]。目前關(guān)于弧菌的檢測(cè)多用免疫學(xué)檢測(cè)方法如免疫層析技術(shù)[8],酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)[9-10],免疫印記技術(shù)[9-11]以及與分子生物學(xué)方法PCR[12]及LAMP[13-15]法等。由于對(duì)其致病機(jī)制的研究尚未成熟,目前所了解的與哈維式弧菌致病性的相關(guān)因素主要有弧菌本身分泌的胞外產(chǎn)物(ECP)如胞外蛋白酶,溶血素[16]、細(xì)胞毒素、鐵載體等,除此之外,還有菌群密度感應(yīng)系統(tǒng)(QS)，也是哈維氏弧菌致病性影響因素之一[17]。并且由于長(zhǎng)期使用抗生素類藥物抑制弧菌疾病,易導(dǎo)致病原哈維氏弧菌產(chǎn)生耐藥性,故現(xiàn)下不適宜用抗生素藥物進(jìn)行抑制,新的抑制弧菌疾病的方法亟待開發(fā)。本文對(duì)哈維氏弧菌的致病因素、檢測(cè)技術(shù)以及防治研究做一綜述,以期為找到診斷及預(yù)防該弧菌疾病的技術(shù)提供有力幫助[16-17]。

1 哈維氏弧菌致病因素

細(xì)菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程種所產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物(ECP)對(duì)宿主存在極大的毒性作用。胞外產(chǎn)物中主要的致病因子有胞外蛋白酶,溶血素(vhh),鐵載體等[18]。

1.1 胞外產(chǎn)物蛋白酶(ECPase)

胞外產(chǎn)物蛋白酶(ECPase)作為哈維氏弧菌胞外產(chǎn)物中的主要毒力因子,表現(xiàn)出很高的絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶活性,且有明顯的菌株特異性。哈維氏弧菌通過(guò)其自身分泌的胞外酶來(lái)干擾宿主機(jī)體的平衡,從而引起病原菌在宿主體內(nèi)繁殖,并隨血淋巴運(yùn)動(dòng)到宿主全身,破壞宿主的凝血系統(tǒng)酶活性,造成血細(xì)胞溶解,最終致使宿主石斑魚身體潰爛而死亡[19]。因此研究人員可以通過(guò)研究控制絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等酶活的相關(guān)方法來(lái)達(dá)到抑制哈維氏弧菌胞外蛋白酶活性,從而抑制弧菌疾病的目的。

1.2 溶血素

溶血素作為主要的致病因子,在致病性弧菌中分布較廣泛[20]。其通過(guò)自身的磷脂酶活性作用于宿主紅細(xì)胞膜的磷脂雙分子層,使宿主紅細(xì)胞膜破裂溶解,血紅蛋白以及其它內(nèi)物質(zhì)大量溢出,造成細(xì)胞溶血?；【娜苎鼗蚨鄬儆赥LH和HLX 溶血素基因家族[21],所以具有兩個(gè)TLH基因的哈維氏弧菌致病能力較強(qiáng)。

1.3 鐵載體

鐵是微生物生長(zhǎng)必不可少的元素,為了維持正常生長(zhǎng),微生物自身便形成了高效的鐵獲取系統(tǒng),最常見的是鐵載體[22]。鐵載體是微生物分泌到胞外的一種可以結(jié)合鐵離子并將其提供給微生物細(xì)胞的離子載體,Kyoungmi等[23]發(fā)現(xiàn)其研究的五株哈維氏弧菌的胞外產(chǎn)物中均檢測(cè)出含有鐵載體。與上述兩種致病因子不同,鐵載體是在當(dāng)宿主的紅細(xì)胞受損時(shí),螯合暴露出來(lái)的含鐵蛋白(血紅蛋白、鐵傳遞蛋白和乳鐵傳遞蛋白等),運(yùn)回病原菌細(xì)胞內(nèi)供其生長(zhǎng)繁殖,并造成宿主細(xì)胞的鐵匱,從而引起宿主的疾病。因此減少水產(chǎn)品的機(jī)械損傷，可以控制其因鐵載體引起的哈維氏弧菌疾病。

1.4 其他

除了上述幾種因素,菌群的密度感應(yīng)系統(tǒng)、細(xì)菌對(duì)宿主體內(nèi)血清的抗性作用以及環(huán)境因素也會(huì)引起宿主疾病。

1.4.1 密度感應(yīng)(QS) 密度感應(yīng)(QS)是基于小信號(hào)分子的細(xì)胞間通信系統(tǒng),QS信號(hào)的濃度隨著環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量的增加而逐漸上漲,在達(dá)到閾值濃度時(shí),信號(hào)分子激活特異性受體以調(diào)節(jié)QS依賴性基因表達(dá)[24]。已有結(jié)果表明哈維氏弧菌的三種密度感應(yīng)系統(tǒng)都有其相對(duì)應(yīng)的自我誘導(dǎo)分子控制自身的生物發(fā)光、鐵載體、蛋白酶、III型分泌系統(tǒng)、生物被膜的基因的表達(dá)[12,25],控制弧菌的致病性。群體密度作為一種控制弧菌疾病的因素,可以根據(jù)控制水產(chǎn)品的畝產(chǎn)以及幼苗的投放量并及時(shí)發(fā)現(xiàn)與移除患病水產(chǎn)品,盡最大可能減少弧菌菌群密度,從而控制弧菌疾病。

1.4.2 血清抗性 細(xì)菌感染宿主后,進(jìn)入宿主血液,會(huì)受到宿主血液中的溶菌素、補(bǔ)體等的清除作用。而細(xì)菌對(duì)于宿主血清的抵抗能力直接關(guān)系到其對(duì)宿主的致病能力[26]。某些哈維氏弧菌菌株在宿主血清中表現(xiàn)出高存活率,可能是因?yàn)槠淇梢缘挚顾拗餮宓那宄饔?從而引起宿主細(xì)胞的免疫能力下降而致病。Li等[27]的研究發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌能夠抵抗宿主血清的清除作用并在宿主細(xì)胞內(nèi)形成凋亡小體引起宿主細(xì)胞的凋亡壞死,從而達(dá)到其致病的效果。細(xì)菌對(duì)于宿主血清的抗性作用加強(qiáng)了其對(duì)宿主的致病能力。

1.4.3 環(huán)境因素 Zha等[28]研究了海水酸化可能會(huì)導(dǎo)致血蛤及其病原體哈維氏弧菌的病原體-宿主相互作用發(fā)生改變,并使宿主更容易受到細(xì)菌感染,故養(yǎng)殖水體環(huán)境的非正常改變或者惡化會(huì)引起水產(chǎn)品的患病率的上升。還有研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境因素如pH、溫度、氨氮硝酸氮的濃度對(duì)哈維氏弧菌的致病性存在影響,其中溫度為主要的影響因子[29-30]。

2 哈維氏弧菌的快速檢測(cè)技術(shù)

由于哈維氏弧菌復(fù)雜的生理生化及遺傳特性,傳統(tǒng)的生理生化檢測(cè)哈維氏弧菌耗時(shí)長(zhǎng)且效率不高,為縮短檢測(cè)時(shí)間,節(jié)省人力物力,如今正逐漸傾向于發(fā)展哈維氏弧菌的快速檢測(cè)方法。

2.1 分子生物學(xué)技術(shù)

2.1.1 PCR檢測(cè)技術(shù) 近年來(lái),PCR檢測(cè)技術(shù)因其較強(qiáng)的特異性以及靈敏性被廣泛用于水產(chǎn)品中各種弧菌疾病以及病毒的檢測(cè),可以根據(jù)某一弧菌的特定基因來(lái)建立特異性檢測(cè)該弧菌的鑒定方法。廖梅杰等[31]以哈維氏弧菌特異性溶血素基因vhhP2為基礎(chǔ),設(shè)定該溶血素基因?yàn)榘谢?創(chuàng)建了可以特異性檢測(cè)哈維氏弧菌的引物。現(xiàn)如今有研究人員通過(guò)建立多重引物,對(duì)病原菌進(jìn)行同步PCR檢測(cè)已取得不錯(cuò)的效果。耿偉光等[32]利用同時(shí)設(shè)計(jì)多種病原菌引物的方法,對(duì)患病水產(chǎn)品體內(nèi)分離出的多種病原菌進(jìn)行同步檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng),且與其他細(xì)菌以及宿主無(wú)交叉反應(yīng)。Ana等[33]同樣根據(jù)三種編碼蛋白質(zhì)基因(opA,ftsZ和mreB)來(lái)設(shè)計(jì)具有種特異性的引物用于區(qū)分哈維氏弧菌、輪蟲弧菌、坎貝利弧菌等幾種近緣弧菌。有研究者建立了快速實(shí)時(shí)定量PCR鑒定哈維氏弧菌和pVCR1質(zhì)粒的DNA并對(duì)其定量[34],關(guān)于哈維氏弧菌的檢測(cè),除了上述編碼蛋白質(zhì)的相關(guān)基因以及特異性的溶血素基因,還可以利用其基因組中的其他基因如16Sr DNA以及DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶B亞基(gyr B)一以及其它毒力基因等進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,后將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行序列對(duì)比即可得出測(cè)定結(jié)果。

2.1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是較PCR分析更為快速的分析檢測(cè)技術(shù),Cao[35]以及張靜等[36]根據(jù)哈維氏弧菌tOxR基因上一段保守序列設(shè)計(jì)出一套LAMP引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均是除哈維氏弧菌以外,其他的實(shí)驗(yàn)弧菌以及細(xì)菌均未能擴(kuò)增出該基因的片段,該方法可以用于特異性檢測(cè)哈維氏弧菌。Yu等[37]設(shè)計(jì)的三重LAMP法通過(guò)設(shè)計(jì)三組不同的特異性引物來(lái)鑒定三種主要的魚類致病性弧菌哈維氏弧菌,鰻弧菌和溶藻弧菌,靈敏度是傳統(tǒng)PCR分析的102～103倍,是一種能夠快速且靈敏度較高的魚體內(nèi)弧菌的檢測(cè)技術(shù)。程碟等[38]也利用溶血素基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo),建立了LAMP-LED的方法,可以更加清楚方便的檢測(cè)哈維氏弧菌。與PCR技術(shù)一樣,LAMP法較普通檢測(cè)方法提高了檢測(cè)效率。但是相比于PCR技術(shù),LAMP法增加了引物的量,具有較好的特異性,并且在恒溫?cái)U(kuò)增減少了擴(kuò)增階段繁瑣的溫度循環(huán),降低了對(duì)儀器的要求,縮短了檢測(cè)時(shí)間,降低了檢測(cè)成本;擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接由肉眼觀察檢測(cè),無(wú)需借助儀器檢測(cè)。但是該方法還存在擴(kuò)增體系易污染且防疫體系較為復(fù)雜等問(wèn)題亟待解決。

2.2 免疫診斷技術(shù)

免疫學(xué)方法相比其他檢測(cè)技術(shù),具有較強(qiáng)特異性,高靈敏性并且易于觀察等特點(diǎn)。酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)是免疫診斷技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的一種,是檢測(cè)免疫反應(yīng)產(chǎn)物生成以及產(chǎn)物的顏色來(lái)進(jìn)行定性及定量。早前,Robertson[39]就曾利用ELISA法檢測(cè)過(guò)水體中以及對(duì)蝦體內(nèi)的哈維氏弧菌。Kumar[40]等人根據(jù)溶血素基因設(shè)計(jì)了單克隆抗體,采用單克隆夾心ELISA法來(lái)檢驗(yàn)海產(chǎn)品中副溶血弧菌。較其他克隆方法,該方法更為靈敏,可以將其利用在哈維氏弧菌的檢測(cè)上。

3 哈維氏弧菌疾病的防治

弧菌是海洋生物以及養(yǎng)殖水產(chǎn)品中的正常菌群,在一定的范圍內(nèi),不會(huì)引起病害,若是弧菌密度急劇增大引起水產(chǎn)品疾病,嚴(yán)重則會(huì)導(dǎo)致死亡。目前多使用抗生素抑制病原哈維氏弧菌病害。但是長(zhǎng)期使用會(huì)引起菌群的耐藥性且對(duì)身體造成很大的傷害。所以,有效抑制哈維氏弧菌的方法以及新型的無(wú)毒害弧菌抑制劑的研究是十分必要的。溫度作為影響哈維氏弧菌的致病性的影響因子,通過(guò)控制養(yǎng)殖水體溫度來(lái)達(dá)到抑制哈維氏弧菌活性,從而減少弧菌疾病是一個(gè)很好的研究方向。有機(jī)酸作為抗生素替代添加劑現(xiàn)正在逐漸受到人們的關(guān)注,研究用新型微膠囊化有機(jī)酸混合物喂養(yǎng)池塘養(yǎng)殖虎蝦,發(fā)現(xiàn)對(duì)于哈維氏弧菌的感染,喂養(yǎng)過(guò)后的虎蝦有增強(qiáng)免疫的作用,說(shuō)明有機(jī)酸是一種良好的抗生素替代劑[41]。大蒜的提取物也曾被用于研究抑制哈維氏弧菌的活性[42],新鮮的大蒜提取物對(duì)于哈維氏弧菌活性的抑制作用為最優(yōu)。還可以通過(guò)多輪菌株毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)養(yǎng)殖水產(chǎn)品進(jìn)行抗菌體的篩育,Huang等[43]通過(guò)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的三輪抗菌體篩選實(shí)驗(yàn),選育出了哈維氏弧菌顯著的抗菌體。有研究通過(guò)使用群體感應(yīng)干擾化合物保護(hù)巨型淡水蝦羅氏沼蝦的幼蟲免受哈維氏弧菌感染[44],發(fā)現(xiàn)該方法不會(huì)對(duì)幼蝦的生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面的影響,但是該方法還需要進(jìn)一步發(fā)展與完善。以上抑制哈維氏弧菌活性以及疾病的方法均是綠色、安全、衛(wèi)生的,替代抗生素的作用,避免了水產(chǎn)品中的藥物殘留威脅到人類身體健康。

4 展望

由于哈維氏弧菌復(fù)雜的生理生化特性,研究人員對(duì)于其致病特性一直在不斷的摸索當(dāng)中。目前,我們對(duì)于哈維氏弧菌的檢測(cè)多在于定性方面,但對(duì)其致病性及其致病能力的強(qiáng)弱檢測(cè)方法則無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此對(duì)于哈維氏弧菌的致病性以及致病能力強(qiáng)弱的研究是現(xiàn)在所迫切需要的。代謝組學(xué)技術(shù)通過(guò)對(duì)生物體或細(xì)胞代謝產(chǎn)生的物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析可以很好的利用到哈維氏弧菌的檢測(cè)當(dāng)中。目前代謝組學(xué)技術(shù)主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)以及核磁共振波譜技術(shù)(NMR)等。Liu等[45]利用核磁共振技術(shù)比較了鰻弧菌和燦爛弧菌對(duì)蛤蜊肝胰腺的誘導(dǎo)代謝反應(yīng),發(fā)現(xiàn)鰻弧菌在蛤蜊肝胰臟中引起的氧化和免疫應(yīng)激比輝綠弧菌更嚴(yán)重,他們還利用核磁共振技術(shù)驗(yàn)證了哈氏弧菌對(duì)貽貝的影響主要體現(xiàn)在貽貝體內(nèi)葡萄糖合成以及ATP/AMP轉(zhuǎn)化途徑中誘導(dǎo)滲透破壞并減少能量需求,可以通過(guò)參與能量代謝和磷酸膽堿含量所顯示[46]。因此作者猜測(cè)研究人員可以通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)被弧菌感染的水產(chǎn)品,根據(jù)其體內(nèi)免疫應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)弱以及能量變化的情況來(lái)檢測(cè)哈維氏弧菌對(duì)于宿主的致病強(qiáng)弱。因此預(yù)測(cè)采用基于代謝組學(xué)技術(shù)的檢測(cè)方法可以通過(guò)獲取哈維氏弧菌侵染宿主后發(fā)生的代謝信息的變化,推測(cè)出哈維氏弧菌的致病能力,從而建立高速有效的鑒定哈維氏弧菌的致病能力的方法。