新型桂花酒的浸提工藝研究及抗氧化評價

黃夢明，田鵬，劉占奇，李良，2，董孝元，2，*

（1.黃鶴樓酒業(yè)（咸寧）有限公司，湖北咸寧430007；2.武漢雅仕博科技有限公司，湖北武漢430050）

桂花（Osmanthus fragrans）系木犀科常綠灌木或小喬木，又名木犀、巖桂、九里香、金粟。原產(chǎn)于中國西南部，四川、云南、廣西、廣東和湖北等均是其產(chǎn)地[1]。桂花是中國十大傳統(tǒng)名花之一，在我國具有悠久的歷史[2]。

桂花不僅是具有高觀賞性的花卉植物，還是一種健康食品，富含大量的活性健康成分，其中黃酮類、多酚類等活性物質(zhì)在桂花中含量非常高。黃酮類物質(zhì)和多酚類物質(zhì)作為植物中存在的天然抗氧化劑，對人體內(nèi)各種自由基具有一定抑制作用[3-5]。

隨著經(jīng)濟發(fā)展和時代的變遷，飲酒的習慣也在逐漸改變，健康、個性化開始受到人們的關(guān)注。桂花酒作為一款露酒，可以很好的滿足現(xiàn)代人群的要求，具有很高的開發(fā)價值。市場上主流的桂花酒可分為兩種，一是以桂花為原料發(fā)酵釀造的桂花酒，二是以桂花為原料浸提生產(chǎn)的桂花酒，這兩種桂花酒各有特色，而通過現(xiàn)代技術(shù)分離純化桂花中生理活性成分生產(chǎn)出的新型桂花酒，是目前一種新的發(fā)展趨勢[6-11]。

本試驗通過研究桂花酒的生產(chǎn)工藝中的浸提工藝，開發(fā)一種新型桂花酒，并且分析其活性成分，對其抗氧化能力進行評價，為新型桂花酒的開發(fā)和發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮桂花：咸寧市桂花鎮(zhèn)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；無水乙醇、NaOH、Al（NO3）3、NaNO2、FeSO4、H2O2、水楊酸、鄰苯三酚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；VC、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）、AB-8型大孔樹脂：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E型電子分析天平：梅特勒-托利多（中國）有限公司；UV-2700分光光度計：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；HH-S型電熱恒溫水浴鍋：上海索普儀器有限公司；SF-TGL-16M臺式高速離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司；KQ-250E超聲波清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Biosafer-18A（普通型）立式凍干機：賽飛（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 桂花提取物的制備

桂花活性成分提?。喝∫押Y選好的新鮮桂花按照1∶4（g/mL）的比例加入70%乙醇，在60℃下振蕩提取2 h，過濾，取濾液在55℃下進行減壓蒸餾，制得提取液。

桂花活性成分純化：取經(jīng)過前處理后裝柱好的AB-8型大孔樹脂按照1∶10（g/mL）提取液的比例上柱，徑高比控制在1∶15，上柱液流速控制在2 BV/h，上柱完畢后，用3 BV/h水進行沖洗雜質(zhì)60 min，然后用70%乙醇按3 BV/h洗脫樹脂80 min，收集洗脫液，經(jīng)減壓蒸餾后，進行冷凍干燥，得到桂花提取物的提取比率為20∶1。

1.3.2 新型桂花酒的生產(chǎn)工藝

3.5%桂花提取物→原酒浸提→過濾→澄清→過濾→桂花酒原酒→調(diào)配→灌裝→成品

1.3.3 感官評價

參照GB/T 27588-2011《露酒》中及GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對露酒的感官評價及綜合分析方法對樣品色澤、澄清度、香氣、滋味和風格指標進行評分[12-13]。確定具體分值并建立感官評價表，如表1所示，按照表1中所列各項標準對樣品進行評分。

表1 桂花酒感官評價表Table1 Osmanthus wine sensory evaluation form

1.3.4 桂花酒中黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al（NO3）3法[14-15]進行總黃酮的測定，以蘆丁為標準品作標準曲線。

對桂花提取物中的原酒提取過程中的總黃酮含量進行檢測，計算出桂花提取物在浸提條件下的提取率。

1.3.5 新型桂花酒的浸提工藝單因素試驗

以感官評價和總黃酮提取率評價指標，對提取物浸提的酒精度、浸提溫度、浸提時間進行單因素試驗，再通過正交試驗優(yōu)化，得到最佳生產(chǎn)工藝。

1.3.5.1 桂花酒浸提酒精度的單因素試驗

選擇酒精度為40%、50%、60%、70%vol的同種原酒對桂花提取物在75℃，提取2h，以桂花酒的感官評價得分及總黃酮的提取率為評價標準，得到最佳酒精度。

1.3.5.2 桂花酒浸提溫度的單因素試驗

選擇酒精度為60%vol的同種原酒對桂花提取物在 55、65、75、85℃，提取 2 h，通過桂花酒的感官評價得分及總黃酮的提取率，得到最佳浸提溫度。

1.3.5.3 桂花酒浸提時間的單因素試驗

選擇酒精度為60%vol的同種原酒對桂花提取物在75℃提取1、2、3、4 h，通過桂花酒的感官評價得分及總黃酮的提取率，得到最佳浸提時間。

1.3.6 新型桂花酒的浸提工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以浸提原酒的酒精度、浸提溫度、浸提時間為因素，采用三因素三水平做正交試驗，以確定最佳浸提工藝條件。

1.3.7 桂花酒抗氧化試驗

1.3.7.1 清除DPPH自由基

參考Jun的方法[16]，精確稱取12.5 mg DPPH標準品，用無水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成0.34 mmol/L的DPPH-乙醇溶液備用。精確量取125 mg/L的DPPH-乙醇溶液4 mL加入到加水稀釋后質(zhì)量濃度為20 mg/L～100 mg/L（以黃酮質(zhì)量濃度計）的桂花酒溶液8.0 mL中。搖勻后于避光處靜置30 min進行反應(yīng)，在517 nm波長處測定吸光度A1。以蒸餾水作為空白對照A0。以等質(zhì)量濃度的加水稀釋的桂花提取液，BHT和VC為對照。DPPH自由基清除率公式：

1.3.7.2 清除羥基自由基

參考文獻中的方法[17-18]，取加水稀釋后質(zhì)量濃度為20 mg/L～100 mg/L（以黃酮質(zhì)量濃度計）的桂花酒成品溶液10 mL添加到比色管中，依次添加2 mL 6 mmol/L水楊酸，2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，2 mL 6 mmol/L H2O2溶液，搖勻，37℃下保溫30 min，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液在510 nm處檢測吸光度值A(chǔ)X。將樣品用去離子水代替檢測吸光度值為A0，將雙氧水用去離子水代替檢測吸光度值為A1。取稀釋后的桂花提取液，BHT和VC等質(zhì)量濃度加入作為對照。羥基自由基清除率計算公式：

1.3.7.3 清除超氧陰離子自由基

參照文獻的試驗方法[19-20]，將0.1 mol/L pH 8.2 Tris-HCl溶液和6 mmol/L鄰苯三酚在25℃下水浴保溫10 min，之后取5.7 mL pH 8.2 Tris-HCl溶液于比色管中，向比色管添加用水稀釋后質(zhì)量濃度為50 mg/L～200 mg/L（以黃酮質(zhì)量濃度計）的桂花酒成品溶液0.20 mL，最后加入0.1 mL 6 mmol/L鄰苯三酚，迅速搖勻，立即在325nm下測定其吸光度變化的動態(tài)曲線，測定時間為5min，通過動態(tài)曲線得到其自氧化速率為V1。以0.20 mL去離子水代替樣品作為空白對照，測定其自氧化速率為V0，空白自氧化速率控制在60 mAbs/min左右為宜。以等質(zhì)量濃度的BHT和VC加入作為對照。超氧陰離子自由基清除率計算公式：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Origin 2018和SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。所有樣品均平行測定3次，測定結(jié)果以x±sd表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 桂花酒浸提工藝的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 桂花酒浸提酒精度的單因素試驗結(jié)果不同酒精度對桂花酒的影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同酒精度對桂花酒的影響Fig.1 The influence of different wine base’s alcohol degrees on osmanthus wine

由圖1可知，桂花總黃酮提取率基本隨著酒精度提高而增加，但是酒精度在70%vol時，桂花酒的感官評價由于較高的酒精度導致下降。因此在其他條件相同下，選擇加入酒精度為60%vol的原酒浸提具有較高的黃酮提取率和感官評價得分。

2.1.2 桂花酒浸提溫度的單因素試驗結(jié)果

不同浸提溫度對桂花酒的影響如圖2所示。

圖2 不同浸提溫度對桂花酒的影響Fig.2 Effects of different extraction temperature on osmanthus wine

由圖2可知，桂花總黃酮的提取率和桂花酒的感官評價基本隨著浸提溫度的升高而升高，但在75℃～85℃下提升幅度明顯減緩。因此在其他條件相同的情況下，75℃和85℃條件下感官評價得分相同，而85℃條件下，黃酮提取率略高于75℃，但從經(jīng)濟條件下考慮，選擇75℃浸提可能更符合生產(chǎn)需求。

2.1.3 桂花酒浸提時間的單因素試驗結(jié)果

不同浸提時間對桂花酒的影響如圖3所示。

圖3 不同浸提時間對桂花酒的影響Fig.3 Effects of different extraction time on osmanthus wine

由圖3可知，桂花總黃酮的提取率在2 h之后明顯減緩，說明桂花總黃酮的提取在2 h基本完成，并且桂花酒的感官評價在2 h之后，也無太大變化。因此在其他條件相同的情況下，在2 h后感官評價得分基本不變，而黃酮提取率略微上升的情況下，綜合經(jīng)濟因素，選擇2 h浸提更加符合生產(chǎn)需求。

2.2 桂花酒的浸提工藝的正交試驗分析

2.2.1 正交試驗水平因素的確定

根據(jù)上述單因素試驗分析，選取酒精度中40%、50%、60%vol，浸提溫度 65、75、85℃，浸提時間 1、2、3h，以黃酮提取率及桂花酒成品感官評價為變量，進行三水平三因素的正交試驗。正交試驗表如表2所示。

表2 桂花酒浸提工藝正交試驗因素水平表Table 2 Osmanthus wine extraction process orthogonal test factor level table

2.2.2 浸提工藝正交試驗結(jié)果

桂花酒浸提工藝正交試驗結(jié)果見表3，桂花酒的浸提工藝優(yōu)化的正交試驗結(jié)果分析見表4，方差分析見表5。

由表4可知，影響桂花酒原酒浸提工藝的黃酮提取率的主次因素依次為：C＞B＞A，即浸提時間＞浸提溫度＞酒精度；影響桂花酒原酒浸提工藝的感官評價的主次因素依次為：C＞B＞A，即浸提時間＞浸提溫度＞酒精度。由表5可知，浸提時間對桂花酒原酒的總黃酮提取率有極顯著影響，浸提溫度和酒精度對黃酮提取率有顯著影響，3個因素對桂花酒的感官評價沒有較大影響。綜合表4及表5，選擇原酒酒精度為60%vol，浸提溫度為85℃，浸提時間2 h。根據(jù)表4中浸提溫度對于提取率及感官評價的k2值與k3值的比較，及對經(jīng)濟效率的考慮，選擇在75℃條件下浸提更加合適。經(jīng)過試驗驗證，在酒精度為60%vol，浸提溫度為75℃，浸提時間2 h時，其提取率在93.21%，感官得分在94.9分，而原酒酒精度為60%vol，浸提溫度為85℃，浸提時間2 h的提取率95.33%，感官得分在96.1分，相比之下提高水平并不多，因此選擇前者更符合生產(chǎn)需求，即原酒酒精度為60%vol，浸提溫度為75℃，浸提時間2 h。

表3 桂花酒浸提工藝正交試驗方案及試驗結(jié)果Table 3 The orthogonal test scheme and test results of osmanthus wine extracting process

表4 桂花酒浸提工藝正交試驗結(jié)果分析Table 4 Analysis of orthogonal test results of extraction process of osmanthus wine

表5 桂花酒浸提工藝正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Analysis ofvariance analysis of orthogonal test results of osmanthus wine extracting process

2.3 桂花酒抗氧化能力試驗結(jié)果

2.3.1 桂花酒原酒及桂花酒成品酒的黃酮含量

桂花酒的黃酮含量見表6。

表6 桂花酒的黃酮含量Table 6 The flavonoids content of osmanthus wine

以蘆丁為標準品，對桂花提取液，桂花酒原酒及桂花酒成品酒，測定其總黃酮含量。從表6可知桂花中含有大量的總黃酮類物質(zhì)，經(jīng)提取后具有較高的純度和活性。提取物經(jīng)原酒溶解后，黃酮濃度具有較高水平，調(diào)配后的成品酒也有較高的黃酮含量。

2.3.2 桂花酒對DPPH自由基的清除能力

桂花酒對DPPH自由基清除能力試驗結(jié)果見圖4。

圖4 桂花酒對DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH free radical scavenging capacity of osmanthus wine

DPPH自由基清除能力測試，是一種快速、簡單的對自由基清除劑的篩選和判別方法。其原理是DPPH乙醇溶液呈紫色，當有自由基清除劑存在時，由于自由基與自由基清除劑進行單電子配對，紫色減褪，其褪色程度符合朗伯比爾定律[21]。

如圖4可知，4種物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力趨勢基本相同，都是隨著總黃酮的質(zhì)量濃度增加，對DPPH自由基的清除能力上升。通過計算4種物質(zhì)的 IC50值，VC的 IC50為 35.92 mg/L，BHT 的 IC50為60.49 mg/L，桂花提取液（質(zhì)量濃度以總黃酮質(zhì)量濃度計）的IC50為52.44 mg/L，桂花酒成品（質(zhì)量濃度以總黃酮質(zhì)量濃度計）的IC50為48.82 mg/L，因此對DPPH自由基的清除能力的強弱順序為VC＞桂花酒成品＞桂花提取液＞BHT。

2.3.3 桂花酒對羥基自由基的清除能力

桂花酒對·OH清除能力試驗結(jié)果見圖5。

圖5 桂花酒對·OH清除能力Fig.5 The hydroxyl radical scavenging ability of osmanthus wine

·OH是一種活性氧自由基，具有極強的氧化性，并且能與抗氧化劑迅速反應(yīng)，在人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)會產(chǎn)生少量的·OH，會對人體細胞造成損傷[22]。

從圖5分析可知：在質(zhì)量濃度均為20 mg/L～40 mg/L時，其他3種物質(zhì)對·OH清除能力均大于VC，其中桂花酒成品具有最強的清除效果；但在80 mg/L～100 mg/L質(zhì)量濃度下，VC比其他3種物質(zhì)的清除能力強；4種物質(zhì)對·OH的清除效果基本呈現(xiàn)出隨著質(zhì)量濃度的增加而遞增的趨勢，對4種物質(zhì)的IC50進行計算，BHT的IC50值為51.25 mg/L，桂花提取液（質(zhì)量濃度以總黃酮質(zhì)量濃度計）的IC50值為48.02 mg/L，桂花酒成品（質(zhì)量濃度以總黃酮質(zhì)量濃度計）的IC50值為44.77 mg/L，VC的 IC50值為 51.64 mg/L，依照 IC50值來判斷，抗氧化能力強弱為：桂花酒成品＞桂花提取液＞BHT＞VC，但是在不同質(zhì)量濃度下每個物質(zhì)對·OH清除能力有所區(qū)別，并不是線性的。

2.3.4 桂花酒對超氧陰離子自由基的清除能力

桂花酒對O2-·清除能力見圖6。

圖6 桂花酒對O2－·清除能力Fig.6 Superoxide anion radical scavenging ability of osmanthus wine

O2-·是人體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性自由基，正常情況下，會與人體內(nèi)細胞中如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等物質(zhì)進行反應(yīng)，被除掉，達到機體內(nèi)的平衡。當這種平衡失去時，O2-·會在人體內(nèi)積累，而機體的抗氧化酶類活性下降，此時O2-·會對人體的細胞造成損傷[23]。

根據(jù)圖6數(shù)據(jù)顯示：4種物質(zhì)對O2-·的清除能力基本隨著質(zhì)量濃度增大而增加，桂花提取液和桂花酒成品（質(zhì)量濃度以總黃酮質(zhì)量濃度計）遠遠小于VC的清除能力，但比BHT的清除能力強。通過計算4種物質(zhì)的IC50值，得到VC的IC50值為79.39 mg/L，桂花酒成品的IC50值為123.91 mg/L，桂花提取液的IC50值為136.87 mg/L，BHT 的 IC50值為 168.83 mg/L，即對 O2-·的清除能力強弱順序為VC＞桂花酒成品＞桂花提取液＞BHT。

3 結(jié)論

新型桂花酒采用植物功效成分提取技術(shù)，對桂花中的活性成分如黃酮等物質(zhì)進行提取，得到具有較高純度的桂花提取物，然后加入原酒對桂花提取物進行提取。本文主要針對桂花提取物的浸提工藝進行優(yōu)化，首先進行單因素試驗對不同因素進行分析，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，進行正交試驗對浸提條件進行優(yōu)選，綜合總黃酮提取率，桂花酒的感官評價及經(jīng)濟因素，選取酒精度為60%vol的原酒在75℃下浸提2 h，經(jīng)重復驗證，具有較好的提取效果，且經(jīng)過調(diào)配后的桂花酒成品，具有優(yōu)良的感官特性，符合目前市場上對于健康的需求。

目前生產(chǎn)的新型桂花酒缺點在于經(jīng)過多次分離純化后，部分香氣成分物質(zhì)可能析出，因此如果能夠解決新型桂花酒的香氣損失問題，就能夠生產(chǎn)出健康及風味俱佳的桂花酒。針對新型桂花酒的研發(fā)工作，對桂花中活性物質(zhì)及香味成分物質(zhì)分析至關(guān)重要。目前國內(nèi)已經(jīng)有機構(gòu)或者公司對桂花香味物質(zhì)進行研究，并且通過超臨界萃取、微波蒸餾萃取等技術(shù)進行提取，制成桂花香氛[24-25]，因此針對新型桂花酒的香氣缺失問題，如果向其中加入天然生產(chǎn)的桂花香氛，可能會解決此問題，但其他影響尚且未知，需要通過之后的研究探討其效果。