清腸溫中方通過miR-675-5p/VDR信號(hào)通路調(diào)控潰瘍性結(jié)腸炎Th17/Treg免疫平衡及腸黏膜屏障的機(jī)制研究*

孫中美 丁龐華 王文婷 史 瑞 裴文靜 郭 一 謝添弘 姜 慧 石 磊 原文靜 毛堂友 △ 指導(dǎo) 李軍祥

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.北京市羊坊店醫(yī)院，北京 100038；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是炎癥性腸病的一種，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。目前UC的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，最新研究顯示，miR-675-5p/維生素D受體（VDR）信號(hào)通路失調(diào)，造成腸黏膜屏障功能受損及腸黏膜免疫紊亂，是導(dǎo)致UC發(fā)病的主要機(jī)制之一［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，清腸溫中方能夠明顯改善UC患者的臨床癥狀，抑制炎癥反應(yīng)，修復(fù)腸黏膜損傷，但具體機(jī)制不明［3］。因此，本研究將從miR-675-5p/VDR信號(hào)通路入手，進(jìn)一步探討清腸溫中方治療UC的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只健康SPF級(jí)SD雄性大鼠,體質(zhì)量（180±220） g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動(dòng)物房。12 h光照/黑夜循環(huán)，溫度20～24℃，濕度50%～60%；自由飲食飲水飼養(yǎng)。

1.2 藥物 清腸溫中方配方顆粒：黃連6 g，炮姜10 g，三七 6 g，青黛 6 g，地榆炭 15 g，苦參 15 g，木香 6 g，炙甘草6 g。由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院配方顆粒藥房統(tǒng)一購于北京康仁堂藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉（MW36-50KDa；MP Biomedical，Burlingame，CA，USA），便潛血試紙（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；ZO-1抗體 （Santa cruz，SC-8146），Occludin 抗體（Abcam，Ab31721）。

1.4 分組、造模及標(biāo)本采集 動(dòng)物模型的建立方法如前期研究［4-5］，所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，稱取體質(zhì)量，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)等分為3組：空白組、模型組、清腸溫中方組?？瞻捉M自由飲用去離子水同時(shí)予去離子水灌胃；模型組和清腸溫中方組自由飲用4.5%DSS溶液制備UC模型，同時(shí)模型組給予去離子水，清腸溫中方組予清腸溫中方灌胃7 d。每日稱取大鼠體質(zhì)量，觀察大便性狀，檢測(cè)便潛血，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)。干預(yù)結(jié)束后，禁食不禁水24 h后麻醉大鼠，取血及結(jié)腸組織，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 結(jié)腸miR-675-5p表達(dá)檢測(cè) 按照TRIzol Regent說明書提取RNA。miR-675-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACCAGTGTGC-3′。逆轉(zhuǎn)錄條件為42℃，60min，72℃5 min。逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-675-5p的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參，引物序列見表1，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

表1 miR-675-5p及U6基因序列引物

1.6 結(jié)腸 VDR mRNA、孤核受體（RORγt） mRNA、叉頭蛋白P3（Foxp3）mRNA的表達(dá)檢測(cè) 提取結(jié)腸組織樣本的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后， 采用 2-△△CT法進(jìn)行 VDR mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相對(duì)定量分析。VDR mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA 的引物如表2。

表 2 VDR、RORγt、Foxp3 基因序列引物

1.7 ELISA檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）的表達(dá) 應(yīng)用大鼠IL-10、IL-17酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)大鼠血清IL-10、IL-17的濃度。

1.8 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)腸ZO-1、Occludin的表達(dá)4 μm厚石蠟切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、高壓修復(fù)、封閉后，加入一抗（ZO-1抗體濃度1∶500，Occludin抗體濃度1∶500）、二抗，經(jīng)過顯色、復(fù)染、脫水、封片后，200 倍鏡視野下采集圖片，Image pro plus 6.0軟件分析圖像，計(jì)算光密度和染色區(qū)域總面積，用平均光密度（IOD/area）來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），不符合正態(tài)分布或方差不齊進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠結(jié)腸miR-675-5p、VDR mRNA的比較見表3。空白組第8號(hào)大鼠在實(shí)驗(yàn)第3天不明原因死亡，其余大鼠均耐受實(shí)驗(yàn)干預(yù)措施，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。模型組大鼠結(jié)腸組織miR-675-5p的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），VDR mRNA 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，清腸溫中方組大鼠結(jié)腸組織miR-675-5p的表達(dá)水平顯著降低 （P＜0.05），VDR mRNA的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠結(jié)腸miR-675-5p、VDR mRNA的比較（±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸miR-675-5p、VDR mRNA的比較（±s）

與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同

組別 n miR-675-5p VDR mRNA空白組 7 1.762±0.577 4.173±1.600模型組 8 3.182±0.907△△ 2.570±0.924△清腸溫中方組 8 1.832±0.853* 3.973±1.217*

2.2 各組大鼠結(jié)腸 RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的比較 見表4。與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織RORγt mRNA的表達(dá)水平明顯增高 （P＜0.05），而Foxp3 mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，清腸溫中方組大鼠結(jié)腸的RORγt mRNA的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），而Foxp3 mRNA的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。

表4 各組大鼠結(jié)腸RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的比較（±s）

表4 各組大鼠結(jié)腸RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的比較（±s）

組 別 n RORγt mRNA Foxp3 mRNA空白組 7 1.122±0.387 1.216±0.563模型組 8 1.756±0.415△ 0.592±0.210△清腸溫中方組 8 1.150±0.306* 1.434±0.496**

2.3 各組大鼠血清IL-10、IL-17的比較 見表5。與空白組比較，模型組大鼠血清IL-10明顯降低 （P＜0.01），而血清IL-17明顯升高（P＜0.05）。清腸溫中方干預(yù)后，血清IL-10明顯升高（P＜0.05），而血清IL-17明顯降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠結(jié)腸血清IL-10、IL-17的比較（pg/mL，±s）

表5 各組大鼠結(jié)腸血清IL-10、IL-17的比較（pg/mL，±s）

組 別 n IL-10 IL-17空白組 7 73.39±14.35 3.93±0.41模型組 8 43.90±8.91△△ 6.16±1.71△清腸溫中方組 8 62.30±13.79* 4.14±0.20*

2.4 各組大鼠結(jié)腸ZO-1、Occludin的比較 空白組大鼠結(jié)腸組織中的ZO-1、Occludin陽性表達(dá)較多，模型組中ZO-1、Occludin陽性表達(dá)區(qū)域明顯減少，經(jīng)過治療后，清腸溫中方組較模型組的表達(dá)相對(duì)增強(qiáng)，其組織切片陽性表達(dá)染色主要為深棕黃色或褐色，見圖1、圖2。與空白組比較，模型組ZO-1、Occludin的平均光密度明顯降低（P＜0.05）；清腸溫中方治療后，大鼠結(jié)腸的ZO-1、Occludin平均光密度較模型組顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），見表 6。

表6 各組大鼠結(jié)腸ZO-1、Occludin的比較（±s）

表6 各組大鼠結(jié)腸ZO-1、Occludin的比較（±s）

組 別 n ZO-1平均光密度 Occludin平均光密度空白組 7 0.127±0.038 0.119±0.043模型組 8 0.076±0.044△ 0.082±0.023△清腸溫中方組 8 0.117±0.019* 0.117±0.014**

3 討 論

圖1 各組大鼠結(jié)腸ZO-1蛋白表達(dá)情況（IHC，200倍）

圖2 各組大鼠結(jié)腸Occludin蛋白表達(dá)情況（IHC，200倍）

UC是一種病變局限于黏膜及黏膜下層的結(jié)腸及直腸的慢性非特異性炎癥性疾病，典型的臨床癥狀為黏液膿血便，其病因尚不明確［6］。本病病程較長，在身體、心理以及經(jīng)濟(jì)方面均對(duì)患者造成巨大的壓力［7］。目前，UC的主要治療目的是誘導(dǎo)緩解、維持緩解以及防止復(fù)發(fā)等方面。西醫(yī)主要的治療方法有氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、微生物制劑以及生物制劑等，但是在臨床使用中存在各種問題，如氨基水楊酸制劑存在藥物不良反應(yīng)明顯、療程長等缺點(diǎn)；糖皮質(zhì)激素易導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染及骨折風(fēng)險(xiǎn)升高，且存在藥物依賴及藥物抵抗的問題；而免疫抑制劑以及生物制劑使用過后感染及腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)升高，且其目前尚在研究階段，療效及安全性尚不明確［8-11］。中醫(yī)藥辨證論治在UC的治療中因效果顯著、副作用小等優(yōu)勢(shì)取得了令人矚目的成就。

清腸溫中方是本文指導(dǎo)，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院李軍祥教授根據(jù)多年治療UC總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，主要組成為：黃連 6 g，炮姜 10 g，青黛 6 g，苦參 15 g，三七6 g，木香 6 g，地榆炭 15 g，炙甘草 6 g。本方以黃連、炮姜為君藥以清熱燥濕，溫脾止瀉；三七、苦參、青黛為臣藥以增強(qiáng)清熱燥濕之功，并兼化瘀止血之效；以木香、地榆炭為佐藥以行氣導(dǎo)滯、涼血止血；并以炙甘草為使藥以補(bǔ)益脾氣、調(diào)和諸藥。前期臨床、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［3-5］提示清腸溫中方治療UC療效顯著，并抑制腸道炎癥反應(yīng)修復(fù)腸黏膜損傷，但具體機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)通過研究清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠Th17/Treg免疫平衡及腸黏膜屏障的影響，進(jìn)一步探究其治療UC的機(jī)制。

MiR-675-5p是長鏈非編碼 RNA（lncRNA）H19的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，由LncRNA H19第一外顯子區(qū)編碼生成的。LncRNA H19的高表達(dá)可以增加miR-675-5p的釋放量，而miR-675-5p可以通過和下游靶基因VDR mRNA的3’UTR以非完全匹配方式相結(jié)合，從而干擾和抑制VDR mRNA的翻譯，同時(shí)還可以通過使靶基因VDR mRNA脫腺苷酸化的作用，增強(qiáng)其對(duì)靶基因VDR mRNA的降解，從而降低VDR的表達(dá)［12-13］。

VDR是類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族的一員，是一類配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，在人體中廣泛表達(dá)于各類細(xì)胞。VDR一方面可特異性地與維生素D（VD）結(jié)合，調(diào)節(jié)其內(nèi)生維生素D的活化形式，即維生素D-1，25（OH）2D3的水平，改變上皮通透性，促進(jìn)腸黏膜屏障緊密連接蛋白ZO-1、Occludin等和黏附連接蛋白E-cadherin的表達(dá)，從而增強(qiáng)腸壁的屏障功能；另一方面表達(dá)于CD4+T細(xì)胞上的VDR與VD特異性結(jié)合后，從而調(diào)控Th17/Treg免疫平衡，從而維持腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)［14-16］。

Th17/Treg免疫平衡的失調(diào)是UC發(fā)病的主要因素［17］。RORγt是促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分泌IL-17等促炎因子，從而促進(jìn)腸道炎癥；Foxp3是Treg細(xì)胞的特性核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的分化發(fā)育，誘導(dǎo)IL-10等抑炎因子的產(chǎn)生，二者保持動(dòng)態(tài)平衡，共同維持腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)［18-19］。當(dāng)二者的免疫平衡失調(diào)后，會(huì)導(dǎo)致Th17細(xì)胞分泌的IL-17等促炎因子的分泌增多，Treg細(xì)胞分泌的IL-10等抑炎因子的數(shù)量減少，最終引起腸黏膜免疫紊亂，導(dǎo)致UC 發(fā)生［20-21］。

因此，通過調(diào)控miR-675-5p/VDR信號(hào)通路修復(fù)UC大鼠腸黏膜屏障及調(diào)控Th17/Treg免疫平衡成為治療UC的新的方向。本次研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸miR-675-5p、RORγt mRNA 及血清 IL-17的表達(dá)較空白組明顯增高，VDR mRNA、Foxp3 mRNA、ZO-1、Occludin、血清IL-10的表達(dá)較空白組明顯降低，提示miR-675-5p/VDR信號(hào)通路參與了UC的發(fā)病過程，而經(jīng)過清腸溫中方的干預(yù)后，大鼠結(jié)腸miR-675-5p、RORγt mRNA及血清IL-17的表達(dá)較模型組明顯降低， 而 VDR mRNA、Foxp3 mRNA、ZO-1、Occludin、血清IL-10的表達(dá)較模型組明顯升高，表明清腸溫中方可以通過降低miR-675-5p的表達(dá)，靶向調(diào)控VDR信號(hào)通路，從而調(diào)控UC Th17/Treg免疫平衡、修復(fù)腸黏膜屏障損傷，達(dá)到治療UC的目的。

本次研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討了miR-675-5p/VDR信號(hào)通路促進(jìn)大鼠UC發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)清腸溫中方治療UC的作用機(jī)制做了進(jìn)一步探討，但中藥治療疾病的機(jī)制往往是多方面的，更深、更廣的作用機(jī)制有待于更深層次的研究。