微乳薄層色譜法對桑葉桑枝中活性成分的鑒別

孫 蓮， 駢繼鑫， 李 娟

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

桑樹(MorusalbaL.)為多年生落葉性木本植物，喬木多，灌木少，其皮、葉、枝和果實都具有藥用作用，桑葉(Foliummori)和桑枝(Ramulusmori)中含有多種活性成分，主要有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油、香豆素類、甾體類、三萜類和多糖類等[1]，具有清除氧自由基、降血糖、降血脂、抗粥樣硬化和抗炎等藥理作用[2-7]。微乳薄層色譜是以微乳液為流動相進(jìn)行的薄層分析。微乳液是由表面活性劑、助表面活性劑、油和水按一定的比例混合而成的無色透明、低粘度的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，與傳統(tǒng)的薄層色譜法相比，具有靈敏度高、重現(xiàn)性及分離效率好、斑點圓而集中等優(yōu)點[8-15]。本研究采用微乳液薄層分析法對桑葉和桑枝中的活性成分進(jìn)行定性鑒別，為桑葉和桑枝的質(zhì)量控制提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器CAMAG LINOMA T5型半自動點樣儀(瑞士卡瑪公司)，CAMAG REPROSTAR 3型薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪公司)。

1.2試藥綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110753-200413)，蘆丁(中國藥品生物制品檢定所，批號100080-200707)，東莨菪內(nèi)酯對照品(北京寶賽希望生物科技有限公司，批號D-020-140728)，桑皮苷A(上海圻明生物有限公司，批號161112)，桑辛素對照品(上海圻明生物有限公司，批號161109)，純度均>98%；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3藥材桑葉和桑枝2017年5月采自新疆10個不同產(chǎn)地(1庫車縣、2烏魯木齊市、3吐魯番市、4庫爾勒市、5哈密市、6阿拉爾市、7疏勒縣、8和田市、9北屯市、10呼圖壁縣)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)生藥教研室帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為多年生落葉性木本植物桑(MorusalbaL.)的葉和枝。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取桑葉、桑枝的干燥粉末各5.0 g，分別置于250 mL的錐形瓶中，加入85%乙醇100 mL，超聲提取2次，每次30 min，合并提取液， 4 000 r/min離心5 min，將提取液濃縮至5 mL，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備 稱取桑皮苷A、綠原酸、蘆丁、東莨菪內(nèi)酯、桑辛素對照品各2.5 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇定溶至刻度，得濃度為0.25 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 顯色劑的制備 稱取5.0 g三氯化鋁置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定溶至刻度，得5%的三氯化鋁乙醇溶液，備用。

2.1.4 展開劑的配制 分別稱取SDS、正丁醇和正己烷，按質(zhì)量比27∶63∶10混合，加入不同比例的水，超聲5 min，密封靜置24 h，備用。

2.2微乳薄層分析

2.2.1 微乳展開劑含水量的選擇 在SDS-正丁醇-正己烷的質(zhì)量比(27∶63∶10)保持不變的條件下，按表1改變含水量，配制系列微乳液，將點樣后的聚酰胺薄膜在不同微乳液中展開，取出晾干，均勻噴灑顯色劑，366 nm下檢視，當(dāng)微乳展開劑的含水量為75%時，對照品和桑葉桑枝樣品均能達(dá)到較好的分離效果，故選擇含水量75%的O/W型微乳液作為展開劑，見表2。

表1 微乳展開劑中不同含水量的選擇

表2 微乳展開劑中不同含水量的展開效果

2.2.2 微乳展開劑中SDS用量的選擇 當(dāng)含水量(75%)，助表面活性劑(正丁醇)-正己烷質(zhì)量比保持不變的條件下，按表3分別取不同量的SDS，配制微乳展開劑，按照“2.2.1”項下的方法展開，366 nm下檢視。當(dāng)SDS用量為2.2 和3.2 g時，對照品和桑葉桑枝樣品的分離都存在拖尾和顯色不清晰的現(xiàn)象，當(dāng)SDS的用量為2.7 g時，對照品和桑葉桑枝樣品均能達(dá)到較好的分離效果，因此選擇SDS-正丁醇-正己烷質(zhì)量比為 2.7∶6.3∶1.0,見圖1、2。

表3 微乳展開劑不同SDS含量的選擇

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.2∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(3.2∶6.3∶1.0)

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.2∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(3.2∶6.3∶1.0)

2.2.3 微乳展開劑中助表面活性劑種類的選擇 當(dāng)含水量(75%)，SDS-助表面活性劑-正己烷質(zhì)量比為2.7∶6.3∶1.0保持不變的條件下，按表4配制微乳展開劑，按“2.2.1”項下方法展開、檢視，不同助表面活性劑(正丁醇、乙醇及甲醇)對展開效果的影響，當(dāng)助表面活性劑為正丁醇時，對照品和桑葉桑枝樣品均能達(dá)到較好的分離效果，因此選擇正丁醇為助表面活性劑，見圖3、4。

2.2.4 微乳展開劑中正丁醇用量的選擇 當(dāng)含水量(75%)，SDS-正己烷質(zhì)量比保持不變的條件下，取不同質(zhì)量的正丁醇，按表5配制展開劑，按“2.2.1”項下方法展開、檢視，當(dāng)正丁醇用量為6.3 g時，對照品和桑葉桑枝樣品均能達(dá)到較好的分離效果，因此選擇SDS-正丁醇-正己烷質(zhì)量比為2.7∶6.3∶1.0，見圖5、6。

表4 不同種類助表面活性劑的微乳展開劑

SDS-甲醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-乙醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0)

表5不同正丁醇用量的微乳展開劑

2.2.5 微乳展開劑中甲酸用量的選擇 當(dāng)含水量(75%)，SDS-正丁醇-正己烷質(zhì)量比為2.7∶6.3∶1.0保持不變的條件下，選擇微乳展開劑-甲酸(9.0∶0.5、9.0∶1.0、9.0∶1.5)為展開劑，按照“2.2.1”項下的方法展開、檢視，當(dāng)V(微乳)∶V(甲酸)=9.0∶1.0時，對照品和桑葉桑枝樣品均能達(dá)到較好的分離效果，見圖7、8。

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶:5.8∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.8∶1.0)

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶5.8∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.8∶1.0)

V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶0.5 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.0 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.5

V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶0.5 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.0 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.5

2.3微乳薄層鑒別系統(tǒng)驗證實驗分別吸取10批次不同產(chǎn)地的桑葉桑枝樣品溶液2.5 μL及混合對照品2 μL，點于20 cm×10 cm 聚酰胺薄膜板上，以含水量75%， m(SDS)-m(正丁醇)-m(正己烷)=2.7∶6.3∶1.0，V(微乳液) ∶V(甲酸)=9.0∶1.0 為展開劑，366 nm下檢視。在桑枝桑葉樣品與對照品相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)出顏色相同的斑點，可鑒別出桑葉中綠原酸、蘆丁和桑皮苷A3種成分，以及桑枝中桑辛素、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯和桑皮苷A4種成分，見圖9、10。

(注：A.綠原酸；B.蘆丁； C.桑皮苷A)

(注：A.綠原酸；B.蘆??； C.桑皮苷A)

3 討論

微乳薄層色譜是以微乳液為展開劑的薄層分析法，與傳統(tǒng)的薄層色譜的展開劑相比，得到的斑點更加清晰，且數(shù)目較多，低毒。微乳薄層還具有明顯的熒光增強(qiáng)增敏效應(yīng)，是桑枝桑葉中黃酮類等物質(zhì)定性鑒別較為理想的方法。本實驗對提取溶劑進(jìn)行了篩選，分別以甲醇、95%乙醇、85%乙醇及70%乙醇為溶劑的超聲和回流2種提取法。結(jié)果顯示，以甲醇為溶劑的2種提取方法得到的提取物中，綠色素含量較大，斑點不清晰、有拖尾；以95%乙醇作為溶劑的2種提取方法得到的提取物中，紅色素含量較大，斑點有拖尾；以70%乙醇作為溶劑的2種提取方法得到的提取物，分離后斑點較少、不清晰；只有以85%乙醇為溶劑的超聲法得到的提取物中，色素含量少，分離后斑點數(shù)多、清晰。同上還考察了以乙酸乙酯、正庚烷、正辛烷、正己烷作為展開系統(tǒng)的油相時，對展開效果的影響，發(fā)現(xiàn)以正己烷為油相的微乳液作為展開劑時，分離效果最好。