Cullin7蛋白在原發(fā)性肝癌癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

林 蘭， 李 乾

(?？谑腥嗣襻t(yī)院病理科， ?？?570208)

原發(fā)性肝癌是肝細胞或肝內膽管細胞發(fā)生的癌腫，己成為全世界癌癥死亡的重要原因，嚴重威脅人類健康[1-2]。全球每年新增原發(fā)性肝癌患者900萬左右。我國每年新增原發(fā)性肝癌患者400萬左右，其中70%的原發(fā)性肝癌由乙肝引起，其次為丙肝及飲酒，黃曲霉毒素是我國南方潮濕地區(qū)原發(fā)性肝癌發(fā)病的高危因素，患者常因肝區(qū)疼痛(刺痛或脹痛、持續(xù)性鈍痛)而就診，約三分之二就診時已處于晚期，其治療手段以手術為主，結合分子靶向治療、化療、放療。但若原發(fā)性肝癌已擴散，或對放療化療不敏感，其手術效果往往不佳，五年生存率較低(約17.6%)，因此探討原發(fā)性肝癌的發(fā)病機制具有重要意義[3-5]。Cullin7定位于6p21.1, 由1 698個氨基酸組成，有高度保守的Cullin結構域，在胎盤、胎兒腎臟，骨骼肌肉、脾臟、腎臟、心臟正常表達，對胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)調控、血管生成和腫瘤轉移等方面發(fā)揮著重要作用[6]。Cullin7是E3泛素連接酶復合物的組件，通過連接賴氨酸48與靶蛋白多聚泛素鏈共價結合，進而啟動對后續(xù)基因蛋白的調控，若Cullin7基因突變后，Cullin7蛋白空間構象發(fā)生改變，其細胞內泛素水平失衡，細胞生長、凋亡和DNA 修復紊亂，導致細胞惡性增殖[7-9]。目前關于Cullin7蛋白與原發(fā)性肝癌關系的研究較少，因此本研究擬探討Cullin7蛋白在原發(fā)性肝癌癌組織中的表達及臨床意義，為原發(fā)性肝癌的治療提供理論及臨床依據。

1 資料與方法

1.1一般資料2011年3月-2014年4月在?？谑腥嗣襻t(yī)院肝膽外科行手術治療并經病理證實的原發(fā)性肝癌患者130例，年齡為40～74歲，平均(57.5±17.8)歲, 男性65例,女性55例，甲胎蛋白≤200 μg/L者85 例，甲胎蛋白>200 μg/L者45例，平均(189.67±108.92) μg/L，天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)(15.7～100.6) U/L，平均(56.4±45.9) U/L；谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)( 15.87～157.90) U/L，平均(78.9±69.4) U/L；乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBs Ag)陽性109例，HBs Ag陰性21例；病程為9個月～4年；門靜脈癌栓者89例，無門靜脈癌栓者41例；腫瘤個數為單發(fā)者25例，腫瘤個數為多發(fā)者105例；肝細胞癌97例、膽管細胞癌23例、混合細胞癌10例。符合美國國家綜合癌癥網(National Compre-hensive Cancer network，NCCN)公布的2005版《Occult Primary Cancer Clinical Practice Guidelines》中關于原發(fā)性肝癌的診斷標準[10]。病理分期采用中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會2001年修訂的原發(fā)性肝癌分期標準。術切除標本后行病理檢查以判定Cullin7蛋白與浸潤深度、淋巴結轉移、TMN分期、復發(fā)、淋巴血管間隙浸潤、病理學分級、腫瘤最大徑的相關性。同時取距原發(fā)性肝癌組織5 cm以上的正常肝臟組織為癌旁組?；颊咦栽柑峁┱８闻K組織及原發(fā)性肝癌組織標本，用于分析Cullin7蛋白的表達。納入標準：入選患者均符合美國國家綜合癌癥網2005版《Occult Primary Cancer Clinical Practice Guidelines》中關于原發(fā)性肝癌的診斷標準；臨床資料完整、詳細；患者(或患者直系親屬)均簽署知情同意書。 排除標準：入院前接受放化療治療的其他惡性腫瘤患者；心功能不全、膜性心臟病以及急診冠狀動脈介入治療者；肝、腎、心功能異常者；預計存活期<3個月。

1.2主要儀器和試劑免疫組織化學二抗試劑盒、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒均購于南京森貝伽生物科技有限公司，北京永光明SW-CJ-1D超凈工作臺(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，Cullin7一抗(購于上海源葉生物科技有限公司)，Cullin7 酶聯免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)試劑盒(購于武漢伊艾博科技有限公司)，南京德鐵HBS-1096A 酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)。

1.3ELISA測定Cullin7蛋白水平實驗開始前所有器具高壓滅菌，37℃烘干。將保存在液氮罐中的正常肝臟組織、原發(fā)性肝癌組織取出。準確稱取0.5 g正常肝臟組織,原發(fā)性肝癌組織,加入0.5 mL 0.9%生理鹽水，在高速粉碎儀(10 000 r/s)中迅速將其粉碎至粘液狀；將組織粘液轉入2 mL Eppendorf管中，加入1.2 mL PBS(pH7.4)，充分振蕩混勻，室溫靜止30 min后以2 000 r/min，4℃，離心10 min。仔細收集上清液。獲取正常肝臟組織、原發(fā)性肝癌組織上清液后，采用ELISA檢測正常肝臟組織、原發(fā)性肝癌組織的Cullin7蛋白表達量。

1.4Cullin7在正常肝臟組織、原發(fā)性肝癌組織表達水平的測定免疫組織化學法測定Cullin7在正常肝臟組織、原發(fā)性肝癌組織中的表達。隨機選取10個高倍視野(×400)計數，從陽性率最高的部位開始，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時計數；>50%為(+++)，26%～50% 為 (++)，6%～25% 為 (+)，陽性細胞≤5% 為 (-)，(-)及(+)歸為不表達組或低表達組即為陰性，(++)及(+++)歸為高表達組即為陽性，所有病理標本制作由同一名病理科醫(yī)師完成，而免疫組織化學法結果的判定則采取雙盲法評估。設立陽性對照(用DAKO公司生產的一抗作為陽性對照，染色結果作為標準結果)，陽性顆粒定位于細胞核，呈均勻分布或位于核膜下，有的呈小斑塊狀不規(guī)則分布。具體制片過程為：常規(guī)制作5 μm的正常肝臟組織、原發(fā)性肝癌組織石蠟切片，3% 的H2O2液常溫阻斷內源性過氧化氫酶活性，微波修復抗原，PBS常規(guī)沖洗，1% 的Cullin7抗體工作液(稀釋濃度1∶200)(購于英國Abcam公司)，4℃夜，加入二抗(IgG)，室溫30 min，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，(50%、60%、80%、90%、95%、100%)梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。

1.5隨訪隨訪起始日期為術后第1天，隨訪截止日期為 2018年1月1日。隨訪方式為入戶隨訪，隨訪內容為：治療效果、恢復情況、病情變化、生存質量等。

2 結果

2.1癌旁組、原發(fā)性肝癌組中Cullin7蛋白水平的表達原發(fā)性肝癌組Cullin7蛋白表達水平高于癌旁組(t=170.644，P<0.001)，見表1。

表1 癌旁組、原發(fā)性肝癌組中Cullin7蛋白水平的表達

表1 癌旁組、原發(fā)性肝癌組中Cullin7蛋白水平的表達

組別例數Cullin7/(ng/g)癌旁組13029.87±8.96原發(fā)性肝癌組130198.76±6.86t值170.644P值<0.001

2.2癌旁組、原發(fā)性肝癌組中Cullin7表達的相關性分析Cullin7主要定位于胞核，其陽性表達為棕褐色，見圖1。原發(fā)性肝癌組Cullin7陽性率高于癌旁組(χ2=115.535，P<0.01)，見表2。

表2 不同臨床病理特征組中Cullin7表達的相關性分析/例(%)

2.3Cullin7蛋白表達與臨床病理特征的關系Cullin7蛋白表達與年齡相關性不明顯(χ2=3.211，P>0.05);與浸潤深度、淋巴結轉移、TMN分期、復發(fā)、淋巴血管間隙浸潤、病理學分級、腫瘤最大徑有關，且浸潤深度越深、有淋巴結轉移、TMN分期越高、有復發(fā)、有淋巴血管間隙浸潤、病理學分期越高、腫瘤最大徑≥5 cm，Cullin7蛋白陽性表達率越高(χ2=19.238、37.717、20.512、23.662、15.331、20.910、15.455，P<0.05),見表3。

2.4Cullin7蛋白表達水平與原發(fā)性肝癌患者預后分析Cullin7陰性組3年生存率及生存期均明顯高于Cullin7陽性組(χ2=34.592,Z=19.764，P<0.05),見表4、圖2。

表3 Cullin7蛋白表達與臨床病理特征的關系/例(%)

3 討論

Cullin7-RING復合體組是E3連接酶組的重要組成部分，Cullin7可靶向定位目標分子并與結合酶的ROCl RING域形成同源二聚體，形成Skpl-CULl-Fbox蛋白-ROCl復合體，而Cullin7的C-末端的cullin域會招募結合酶(Cdc34、Ubc4、E2)催化向底物分子蛋白轉移，進行泛素化。若Cullin7過表達，Aurora A活性增強，泛素化過程受阻，而Akt/RAS/MEK/ERK信號通路激活，細胞增殖、凋亡、分化、轉移及損傷修復功能紊亂，導致細胞惡性轉化[11-13]。本研究顯示，原發(fā)性肝癌組Cullin7陽性率高于于癌旁組，原發(fā)性肝癌組Cullin7水平高于癌旁組，這與上述結論一致。國內外研究已證實，Cullin7能明顯促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移。Cullin7能促進E-cadherin酶的表達，E-cadherin酶是一種分泌型銅依賴性胺氧酶，能降解細胞外彈力蛋白和基質膠原交聯，促進腫瘤細胞增殖和侵襲遷移，此外Cullin7能強烈抑制細胞凋亡，肺癌細胞中的Cullin7表達水平遠遠高于野生株，而Cullin7水平的高表達意味著腫瘤細胞黏附于血管內皮細胞的能力加強，這樣才能穿過細胞外基質層，建立遠處轉移灶[14-15]。本研究中，Cullin7表達水平與浸潤深度、淋巴結轉移、TMN分期、復發(fā)、淋巴血管間隙浸潤、病理學分級、腫瘤最大徑相關性明顯，且浸潤深度越深、有淋巴結轉移、TMN分期越高、有復發(fā)、有淋巴血管間隙浸潤、病理學分期越高、腫瘤最大徑≥5 cm，Cullin7蛋白陽性表達率越高。與上述討論符合，也說明Cullin7在原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展、遠處轉移過程中起促進作用。

表4 Cullin7蛋白表達水平與原發(fā)性肝癌患者預后分析

圖2 Cullin7陽、陰組 Kaplan-Meier生存曲線分析

Cullin7蛋白能促進細胞腫瘤因子白介素-8、血管內皮生長因子的分泌，而白介素-8、血管內皮生長因子能明顯增強腫瘤血管系統(tǒng)的生長，并強烈刺激腫瘤實體的形成。本研究中，通過預后分析，Cullin7陰性組3年生存率及生存期均明顯高于Cullin7 陽性組，證實了這一點。此外，研究發(fā)現Cullin7可介導癌細胞的定向轉移和趨化性，并激活淋巴細胞、內皮細胞、中性粒細胞、上皮細胞上相應的趨化因子受體，并激活WNT信號通路(wingless/integrated，WNT)，將細胞質中的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)主動轉運至細胞核中，與TCF/LEF的同源異構區(qū)域結合，導致靶基因過度表達，進而導致細胞凋亡機制失衡，細胞大量增殖，發(fā)生癌變，形成惡性表型[16-18]。

綜上所述，Cullin7在原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起促進作用；Cullin7蛋白在原發(fā)性肝癌癌組織中表達量增加，Cullin7蛋白低表達的原發(fā)性肝癌患者能獲得較好的預后。