男性痛風(fēng)患者與TLR4基因rs10759932(C/T)和rs1927906(C/T)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的研究

劉 璐， 陳 程， 姚 華， 王婷婷， 加娜爾·巴合提江， 苗 蕾

(1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室， 烏魯木齊 830011;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心， 烏魯木齊 830000； 3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 烏魯木齊 830054)

痛風(fēng)是代謝性疾病之一，近年來(lái)隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的多樣性使得痛風(fēng)患病率呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]，痛風(fēng)是血尿酸濃度升高而導(dǎo)致的尿酸鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)等組織或器官并且伴隨有組織損傷的炎癥性疾病，在炎性通路的研究中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)是多種免疫和炎癥效應(yīng)分子基因轉(zhuǎn)錄激活因子，可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎癥效應(yīng)分子激活而導(dǎo)致炎癥性疾病產(chǎn)生，而NF-κB的上游分子機(jī)制則是通過(guò)Toll樣受體(TLR)激活其信號(hào)通路[2]。

Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路能夠調(diào)控炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的產(chǎn)生，使其在痛風(fēng)發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3]。TLR4是Toll樣受體家族的重要成員，并在通路中參與調(diào)控痛風(fēng)的發(fā)病過(guò)程[4]，因此TLR4基因多態(tài)性與痛風(fēng)性炎癥反應(yīng)也有一定相關(guān)性[5]。本研究擬采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)痛風(fēng)患者TLR4基因rs10759932和rs1927906的單核苷酸多態(tài)性，進(jìn)一步探討痛風(fēng)與遺傳因素的關(guān)系，為痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制的研究提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇2016-2018年新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院風(fēng)濕科男性痛風(fēng)就診患者103例(痛風(fēng)組)，平均年齡(44.55±10.37)歲。入選患者符合2015美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)[6](ACR)制定的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除血液疾病、腫瘤、肝腎功能不全者及使用藥物者等。選擇同期健康體檢者103例(對(duì)照組)，平均年齡(45.07±10.23)歲，2組人群年齡構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.967)。

1.2標(biāo)本采集研究對(duì)象于采血前禁食12 h，清晨取空腹靜脈血2 mL，置于肝素抗凝管中2 h內(nèi)3 000 r/min離心15 min，6 h內(nèi)完成所有指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)主要有甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、 尿酸(SUA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、空腹血糖(GLU)等。

1.3診斷標(biāo)準(zhǔn)GLU≥6.1 mmol/L為高血糖[7]；收縮壓(SBP)≥130 mmHg和(或)舒張壓(DBP)≥90 mmHg為高血壓[8]；TC≥6.2 mmol/L為高膽固醇血癥[9]；TG≥2.3 mmol/L為高甘油三酯血癥[10]；體質(zhì)指數(shù)(BMI)≥28 kg/m2為肥胖[11]。

1.4主要儀器及試劑Hotstar Taq試劑盒(Qiagen)，PCR反應(yīng)緩沖液(Takara)，MgCl2(Takara)，dNTP(GENERAY BIOTECH)，PCR Marker(NEW ENGLAND Biolabs)，SNaPshot Multiplex(ABI)，5×Sequencing Buffer(ABI)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 DNA提取 取空腹靜脈血2 mL，EDTA抗凝，參照DNA提取配套試劑盒(北疆百泰克公司)說(shuō)明書(shū)操作提取DNA，所提DNA樣品采用紫外分光光度計(jì)定量和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。質(zhì)檢合格的DNA樣本濃度調(diào)整為50 ng/μL，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中TLR4基因用Primer3軟件設(shè)計(jì)引物，由上海天昊公司合成。rs10759932位點(diǎn)上游引物序列：5′-TGCAAGCTTCTGCTATGATTAAAAGTG-3′，下游引物序列：5′-TTTTGAGCACCCACCATATGATTC-3′；rs1927906位點(diǎn)上游引物序列：5′-CAAGGCTCTGAGAAGGAAGATCAA-3′，下游引物序列：5′-TCTTTCCCTGCTTGTCCACCTC-3′。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，94℃ 20 s，65℃ 40 s，72℃ 1.5 min 11個(gè)循環(huán)，94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 1.5 min 24個(gè)循環(huán)，72℃ 2 min。20 g/L瓊脂凝膠電泳，并采用FR-250 電泳儀(上海復(fù)日)掃描拍照。

1.5.3 單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型 由上海天昊公司采用SNaPshot SNP分型技術(shù)對(duì)所有樣本進(jìn)行rs10754558、rs3806268位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè)及基因分型。

2 結(jié)果

2.1一般臨床資料的比較痛風(fēng)組與對(duì)照組在年齡、SBP、BUN、TG、TC的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；痛風(fēng)組BMI、DBP、SUA、GLU、CREA高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 痛風(fēng)組和對(duì)照組間臨床指標(biāo)比較

2.2代謝綜合征不同組分在痛風(fēng)組和對(duì)照組間的分布比較痛風(fēng)組肥胖和高血糖的發(fā)生率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而高血壓、高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥的發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 代謝綜合征不同組分在痛風(fēng)組和對(duì)照組間的

2.3危險(xiǎn)因素分析以是否患有痛風(fēng)為因變量，將肥胖、高血壓、高血糖、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥作為預(yù)測(cè)因素納入Logistic回歸模型中進(jìn)行單因素分析，結(jié)果為肥胖、高血壓、高血糖和高膽固醇血癥是痛風(fēng)發(fā)病的危險(xiǎn)因素(P<0.05，OR>1)，將上述有意義的因素納入多因素Logistic回歸模型進(jìn)行分析，高血糖為痛風(fēng)發(fā)病的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4痛風(fēng)組及對(duì)照組TLR4兩基因位點(diǎn)的基因型以及基因頻率的分布比較兩位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，群體具有代表性。rs10759932位點(diǎn)CC、CT、TT基因型在痛風(fēng)組的分布頻率為10%，48%和42%，對(duì)照組中的分布頻率為6.1%，34.7%和59.2%，CC、CT基因型痛風(fēng)組高于對(duì)照組，TT基因型對(duì)照組高于痛風(fēng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rs1927906位點(diǎn)TT、CT基因型在痛風(fēng)組的分布頻率分別是88%和12%，對(duì)照組中的分布頻率分別為 89.8%和10.2%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs10759932的等位基因C和T在2組的分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),C等位基因痛風(fēng)組高于對(duì)照組，T等位基因?qū)φ战M高于痛風(fēng)組。rs10759932的等位基因C和T在2組的分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表3 痛風(fēng)影響因素的多因素Logistic回歸分析

表4 痛風(fēng)組和對(duì)照組TLR4基因不同位點(diǎn)基因型及基因頻率的分布比較/例(%)

注：痛風(fēng)組3例基因型分型失敗,例數(shù)為100例。

3 討論

本次研究共調(diào)查痛風(fēng)患者103例，采用病例對(duì)照研究對(duì)其進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)和危險(xiǎn)因素的分析，生化指標(biāo)中2組在BMI、DBP、GLU和CREA上存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在代謝綜合征不同組分的檢出率中高血糖和肥胖的發(fā)生率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)這與本課題組前期研究結(jié)果[12]以及國(guó)內(nèi)青玉鳳等[13]研究結(jié)果一致。痛風(fēng)人群中糖代謝紊亂的發(fā)生率高于正常人群，由此可以證實(shí)糖代謝指標(biāo)的差異與是否患有痛風(fēng)有一定的關(guān)聯(lián)，也提示患有痛風(fēng)的人群，體內(nèi)炎癥環(huán)境對(duì)糖代謝指標(biāo)可以產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響血糖在體內(nèi)的糖酵解過(guò)程，目前在2型糖尿病患者和肥胖者中發(fā)現(xiàn)糖酵解的關(guān)鍵酶3-磷酸甘油脫氫酶活性下降，結(jié)果使體內(nèi)的尿酸水平上升，誘發(fā)高尿酸血癥或痛風(fēng)的發(fā)生。在肥胖的差異性研究中相關(guān)研究結(jié)果提示肥胖是的發(fā)生率在痛風(fēng)組較高[13]，與本次研究結(jié)果一致，本研究人群為男性人群，男性肥胖以腹型肥胖為主，腹部脂肪的堆積與男性飲食習(xí)慣密切相關(guān)。并且肥胖患者常合并糖尿病、高血壓等代謝性疾病，可相互影響并加重痛風(fēng)發(fā)作的進(jìn)展。進(jìn)行危險(xiǎn)因素分析時(shí)，高血糖是痛風(fēng)發(fā)作的危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步證實(shí)痛風(fēng)與糖代謝存在相關(guān)影響的作用。

TLR4基因廣泛分布在人體單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的表面上。而尿酸鹽可作為一種“內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)”，通過(guò)激活Toll樣受體炎性通路，引起一系列的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。國(guó)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TLR4因子炎性通路參與尿酸鹽介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)[14]。國(guó)內(nèi)青玉鳳等[15]也證實(shí)TLR4的基因多態(tài)性與痛風(fēng)的發(fā)生有一定聯(lián)系。國(guó)內(nèi)外大量研究結(jié)果得出TLR4基因多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎、骨髓炎、膀胱癌和哮喘等發(fā)作相關(guān)，因此本研究通過(guò)分子生物學(xué)方法探討TLR4基因多態(tài)性與痛風(fēng)發(fā)病的相關(guān)性。

TLR4基因位于9q32-33，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)可發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)基因多態(tài)性相關(guān)的TLR4基因位點(diǎn)有200多個(gè)，本次研究所選rs10759932位點(diǎn)位于TLR4基因5’末端側(cè)翼區(qū)，rs1927906位點(diǎn)位于TLR4基因3’末端側(cè)翼區(qū)。衛(wèi)美蓉等[16]研究結(jié)果表明rs10759932位點(diǎn)基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生有關(guān)，汪小明等[17]研究發(fā)現(xiàn)rs10759932位點(diǎn)基因多態(tài)性與淺表性膀胱癌的復(fù)發(fā)有關(guān)，劉曉聰?shù)萚18]研究發(fā)現(xiàn)rs10759932位點(diǎn)基因多態(tài)性與肝癌的發(fā)生有關(guān)，但是對(duì)于rs1927906位點(diǎn)多態(tài)性的研究較少。本次研究發(fā)現(xiàn)在所有研究對(duì)象中rs10759932位點(diǎn)存在CC、CT和TT 3種基因型，CT、CC基因型和C等位基因在痛風(fēng)組高于對(duì)照組，攜帶TT和T等位基因在痛風(fēng)組低于對(duì)照組，3種基因型和2種等位基因的分布在痛風(fēng)組和對(duì)照組存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rs1927906位點(diǎn)只有CT和TT兩組基因型，不管是CT和TT的基因型還是C和T的等位基因在2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故這些研究結(jié)果提示TLR4基因的rs10759932位點(diǎn)基因多態(tài)性與男性痛風(fēng)的發(fā)生相關(guān)，我們?nèi)孕柙诖髽颖竞投嘀行倪M(jìn)行該位點(diǎn)與男性痛風(fēng)發(fā)生的相關(guān)性的驗(yàn)證。

總之，痛風(fēng)是飲食、環(huán)境和遺傳共同作用而誘發(fā)的疾病，加強(qiáng)對(duì)免疫炎癥反應(yīng)中相關(guān)基因的多態(tài)性研究，有助于從遺傳的角度深入了解和闡明痛風(fēng)發(fā)病的機(jī)制，為今后痛風(fēng)的基礎(chǔ)研究和病因?qū)W提供一定的依據(jù)。