甲氨蝶呤通過抑制TLR2-NF-κB信號通路減輕類風濕關節(jié)炎大鼠滑膜炎的作用研究

崔毅佳， 王淑梅， 金志國

(1首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院藥劑科； 2臨床合理用藥生物特征譜學評價北京市重點實驗室,3臨床合理用藥生物特征譜學評價國際合作聯(lián)合實驗室， 北京 100038)

類風濕關節(jié)炎(rrheumatoid arthritis，RA)是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病，其特征是手、足小關節(jié)的多關節(jié)、對稱性、侵襲性關節(jié)炎癥，經(jīng)常伴有關節(jié)外器官受累及血清類風濕因子陽性，可以導致關節(jié)畸形及功能喪失[1-3]。RA的發(fā)病可能與遺傳、感染、性激素等有關。RA關節(jié)炎的病理主要有滑膜襯里細胞增生、間質大量炎性細胞浸潤，以及微血管的新生、血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等[4-5]。Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs))的激活可以啟動先天免疫防御，Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)在識別內(nèi)源性激動劑中起重要作用，如大分子降解產(chǎn)物、熱休克蛋白、蛋白水解物級聯(lián)產(chǎn)物、破裂細胞的細胞內(nèi)成分以及被炎癥激活的基因產(chǎn)物[6-7]。TLR2是參與信號轉導的重要跨膜蛋白。研究表明，TLR2參與防御革蘭氏陰性細菌，脂多糖(LPS)是其最常見的配體[8-9]。TLR2的下游信號分子主要包括核因子最終激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)轉錄因子，活化的NF-κB蛋白進入細胞核，啟動許多基因的轉錄，包括促炎性腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白細胞介素2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)[10]。甲氨蝶呤為免疫抑制劑，具有強力免疫抑制作用,抑制初次及再次免疫應答反應，并可通過抑制免疫細胞的增殖，抑制組織胺等炎癥介質的反應發(fā)揮抗炎作用。本研究擬探討甲氨蝶呤通過抑制TLR2-NF-κB信號通路減輕類風濕關節(jié)炎大鼠滑膜炎的作用，為類風濕關節(jié)炎滑膜炎的治療提供理論及臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1動物分組及染毒清潔級SD(sprague dawley)大鼠120只，12周齡，體質量(117.43±13.21)g，湖南斯萊克實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK(湘)2011-0003]，根據(jù)體質量隨機分成6組：對照組、模型組、雷公藤多苷片組(30.0 mg/kg)、甲氨蝶呤低劑量組(10.0 mg/kg)、甲氨蝶呤中劑量組(20.0 mg/kg)、甲氨蝶呤高劑量組(40.0 mg/kg)、每組20只，雌雄各半。動物自由攝取飼料、自由飲水，自動控制晝夜循環(huán)(12/12 h)，室溫(22±1)℃。本研究經(jīng)本院動物護理與使用委員會批準，所有動物實驗均符合美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南。

1.2藥物、儀器及試劑甲氨蝶呤片(上海上藥信誼藥廠有限公司；國藥準字H31020644)，雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥有限公司；國藥準字Z33020422)，根據(jù)成人劑量公式換算，大鼠用藥量為成人的23.16倍，以10.0 mL/kg 體質量灌胃，將藥液濃度配制成為10.0 g/mL。TLR2、NF-κB、IL-2、IL-6、TNF-α、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于上海邦奕生物科技有限公司、MK3酶標儀(美國熱電)。Trizol RNA提取試劑、One Step PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II購自美國的Invitrogen Corporation(City，State，USA)，TLR2、NF-κB RNA定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自上海GenePharma有限公司。TePCR熱循環(huán)儀為Roche Light Cycler(Kaiseraugst，Rheinfelden，Switzerland)。

1.3各實驗組的制備模型組、雷公藤多苷片組、甲氨蝶呤各劑量組大鼠于溫度為10℃的冷水中游泳，每次15 min,每日 1 次，連續(xù) 7 d(以誘導 RA 的寒濕因素)，然后腹腔注射6%戊巴比妥鈉進行麻醉，取仰臥位固定操作臺上，完全弗氏佐劑與Ⅱ型膠原的混合乳劑(比例為1∶1)注射于尾根部、背部及足跖部(0.1 mL)，對照組給予0.1 mL的0.01 mol/L的稀冰醋酸注射，距初次免疫 7 d 加強免疫 1 次。甲氨蝶呤各劑量組及雷公藤多苷片組于造模成功第1天開始給予相應藥物灌胃(灌胃體積1.0 mL/100 g)，持續(xù)給予3個月，對照組和模型組給予等體積生理鹽水。試驗結束后，進行大鼠關節(jié)炎癥的積分(免疫后的第 10 天起，每隔3天分別對各組大鼠進行評定關節(jié)炎癥積分。無炎癥計 0 分；輕度紅腫計 0.5 分；中度以上紅腫計 1 分。整個肢體出現(xiàn)功能障礙追加 1 分，單個肢體的最高積分為 4 分，總共累積最高積分為 16 分)[11]。

1.4機械痛閾(pawwithdrawlmechanicalthreshold，PWT)及熱刺激潛伏期(pawwithdrawalthermallatency,PWTL)的測定各組大鼠處死前，根據(jù)文獻[12]方法測定PWT、PWTL。

1.5TLR2、NF-κB在膝關節(jié)滑膜組織中表達的測定根據(jù)制造商的說明，使用Trizol Reagent從膝關節(jié)滑膜組織中提取總RNA。使用One Step Prime Script miRNA cDNA合成試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，并使用SYBR Premix Ex Taq II進行定量實時PCR 。使用內(nèi)源性U6小核RNA(U6)進行標準化(U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-

T-3′)。通過2-ΔΔCT方法計算TLR2、NF-κB在膝關節(jié)滑膜組織中的相對表達水平。PCR引物的序列如下：TLR2正向引物：5′-AGTCTATACAAGGG-

CAAGCTCTC-3′，反向引物：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′；NF-κB正向引物：5′-ATTTC-

ACCAATCTTGTCTCCATCA-3′，反向引物：5′-CTCCTCCTGTTC GACAGTCAGC-3′。反應體系為：正向引物10 μL、反向引物10 μL、RNA模版0.6 μL，超級酶混合物0.2 μL，2×μByr一步法RT-qPCR緩沖液5 μL，去RNA水3.4 μL。循環(huán)如下：95℃持續(xù)10 min，進行40個循環(huán)，持續(xù)15 s溫度60℃。

1.6ELISA測定大鼠膝關節(jié)滑膜組織中TLR2、NF-κB、IL-2、IL-6、TNF-α蛋白水平按照無菌條件操作，稱取0.1 g膝關節(jié)滑膜組織組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將膝關節(jié)滑膜組織碾碎至粉末狀；將組織粉末轉入2 mL Eppendorf管中，加入1.2 mL PBS(pH7.4)，充分振蕩混勻，2 000 r/min，4℃，離心20 min。仔細收集上清液。獲取膝關節(jié)滑膜組織勻漿后，采用ELISA法檢測膝關節(jié)滑膜組織中TLR2、NF-κB、IL-2、IL-6、TNF-α蛋白水平。

2 結果

2.1甲氨蝶呤對大鼠PWPT、PEL、關節(jié)炎癥積分的影響與對照組比較，甲氨蝶呤各劑量PWPT、PEL評分降低，關節(jié)炎癥積分升高(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤各劑量PWPT、PEL評分升高，關節(jié)炎癥積分降低(P<0.05)，且隨著甲氨蝶呤組給藥劑量的增加，PWPT、PEL評分逐漸升高，關節(jié)炎癥積分逐漸降低劑量-效應關系明顯(P<0.05)；與雷公藤多苷片組相比，甲氨蝶呤組低、中劑量組PWPT、PEL評分降低，關節(jié)炎癥積分升高；高劑量組PWPT、PEL評分略微降低，關節(jié)炎癥積分略微升高(P>0.05)，見表1。

2.2甲氨蝶呤組對各組大鼠膝關節(jié)滑膜結構的影響對照組膝關節(jié)滑膜結構完整，滑膜表面光滑，滑膜細胞分布均勻且排列整齊(約1～3層)，核呈卵圓形位于中央，較為清晰，未見炎癥細胞浸潤；模型組滑膜層明顯增厚，滑膜組織壞死，呈均質紅染，滑膜細胞疏松紊亂，結構破壞，崩解，結構紊亂，核固縮、大量中性粒細胞浸潤，大量滑膜成纖維細胞增生；雷公藤多苷片組及甲氨蝶呤組高劑量組關節(jié)滑膜結構較為完整，見少量壞死滑膜壞死細胞，伴少量淋巴、中心細胞浸潤，纖維組織增生減少；甲氨蝶呤組中、低劑量組較模型組而言，膝關節(jié)滑膜局部粗糙不平、潰瘍形成壞死滑膜細胞減少，炎癥細胞浸潤減少，滑膜成纖維細胞的增生減少，但軟骨結構疏松紊亂，具有明顯的劑量依賴效應，見圖1。

表1 甲氨蝶呤對大鼠PWPT、PEL、關節(jié)炎癥積分的影響

注：與對照組比較,*P<0.05； 與模型組比較,△P<0.05； 與雷公藤多苷片組比較,#P<0.05。

A: 對照組 B: 模型組 C: 雷公藤多苷片組

D: 甲氨蝶呤低劑量組 E: 甲氨蝶呤中劑量組 F: 甲氨蝶呤高劑量組

2.3各組大鼠膝關節(jié)滑膜TLR2、NF-κBmRNA表達水平比較與對照組比較，甲氨蝶呤組各劑量組TLR2、NF-κB mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組各劑量組TLR2、NF-κB mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，且隨著甲氨蝶呤組給藥劑量的增加，TLR2、NF-κB mRNA表達水平逐漸降低，劑量-效應關系明顯(P<0.05)；與雷公藤多苷片組相比，甲氨蝶呤組組低、中劑量組TLR2、NF-κB mRNA表達水平明顯升高；高劑量組TLR2、NF-κB mRNA表達水平略微升高(P>0.05)，見表2。

2.4各組大鼠膝關節(jié)滑膜TLR2、NF-κB蛋白表達水平比較與對照組比較，甲氨蝶呤組各劑量組TLR2、NF-κB 蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組各劑量組TLR2、NF-κB 蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，且隨著甲氨蝶呤組給藥劑量的增加，TLR2、NF-κB 蛋白表達水平逐漸降低，劑量-效應關系明顯(P<0.05)；與雷公藤多苷片組相比，甲氨蝶呤組組低、中劑量組TLR2、NF-κB 蛋白表達水平明顯升高；高劑量組TLR2、NF-κB 蛋白表達水平略微升高(P>0.05)，見表3。

表2 各組大鼠膝關節(jié)滑膜TLR2、NF-κB mRNA水平比較

注：與對照組比較,*P<0.05； 與模型組比較,△P<0.05； 與雷公藤多苷片組比較,#P<0.05。

2.5各組大鼠膝關節(jié)滑膜IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達水平比較與對照組比較，甲氨蝶呤組各劑量組IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組各劑量組IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，且隨著甲氨蝶呤組給藥劑量的增加，IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達水平逐漸降低，劑量-效應關系明顯(P<0.05)；與雷公藤多苷片組相比，甲氨蝶呤組低、中劑量組IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平明顯升高；高劑量組IL-2、IL-6、TNF-α表達水平略微升高(P>0.05)，見表4。

表3 各組大鼠膝關節(jié)滑膜TLR2、NF-κB 蛋白表達水平比較

注：與對照組比較,*P<0.05； 與模型組比較,△P<0.05； 與雷公藤多苷片組比較,#P<0.05。

表4 各組大鼠膝關節(jié)滑膜IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平比較

注：與對照組比較,*P<0.05； 與模型組比較,△P<0.05； 與雷公藤多苷片組比較,#P<0.05。

3 討論

目前，臨床上已將非甾體類抗炎藥，皮質類固醇和透明質酸用于臨床治療RA。但是，它們不能逆轉軟骨損傷，還導致不良的心血管和胃腸道副作用。因此，需要用于治療RA的新型更好的藥劑。甲氨蝶呤能抑制二氫葉酸還原酶活性,使細胞內(nèi)葉酸水平降低，核蛋白合成減少,進而抑制細胞增殖。甲氨蝶呤預處理可以防止滑膜細胞在無血清培養(yǎng)條件下誘導細胞凋亡。這種作用可能與其抗氧化潛力有關，阻斷缺氧誘導因子-1α/基質細胞衍生因子-1(HIF-1α/SDF-1)通路的激活。本研究結果顯示，與對照組比較，甲氨蝶呤各劑量PWPT、PEL評分降低，關節(jié)炎癥積分升高；與模型組比較，甲氨蝶呤各劑量PWPT、PEL評分升高，關節(jié)炎癥積分降低，且隨著甲氨蝶呤組給藥劑量的增加，PWPT、PEL評分逐漸升高，關節(jié)炎癥積分逐漸降低劑量-效應關系明顯；與雷公藤多苷片組相比，甲氨蝶呤組低、中劑量組PWPT、PEL評分降低，關節(jié)炎癥積分升高；高劑量組PWPT、PEL評分略微降低，關節(jié)炎癥積分略微升高(P>0.05)；這說明甲氨蝶呤能對類風濕關節(jié)炎滑膜炎具有一定程度的修復作用。結合病理學結果對照組膝關節(jié)滑膜結構完整，滑膜表面光滑，滑膜細胞分布均勻，未見炎癥細胞浸潤；模型組滑膜層明顯增厚，滑膜組織壞死，大量滑膜成纖維細胞增生；雷公藤多苷片組及甲氨蝶呤組高劑量組關節(jié)滑膜結構較為完整，見少量壞死滑膜壞死細胞；甲氨蝶呤組中、低劑量組較模型組而言，膝關節(jié)滑膜局部粗糙不平、潰瘍形成壞死滑膜細胞減少，炎癥細胞浸潤減少，但軟骨結構疏松紊亂，具有明顯的劑量依賴效應,提示甲氨蝶呤能明顯減輕滑膜細胞損傷程度。

TLR2是一種跨膜受體蛋白，通過其富含細胞外亮氨酸的重復結構域和細胞質信號傳導結構域發(fā)揮信號轉導分子的作用[13-14]。已經(jīng)證明，TLR2不僅在先天免疫反應中起關鍵作用，而且還參與了適應性免疫的觸發(fā)。 雖然LPS通過與CD14的相互作用被公認為TLR2的主要配體，但TLR2的內(nèi)源配體也可能存在。 例如，已經(jīng)證明TLR2與髓樣分化因子88(MYD88)的結合激活TNF受體和IL-1受體相關激酶，這進一步導致炎癥反應[15]。NF-κB是一種關鍵的核轉錄因子，通常由p50和p65亞基組成。已經(jīng)確定NF-κB調(diào)節(jié)促炎性細胞因子的表達，因此在免疫和炎癥反應中具有重要作用[16]。此外，NF-κB信號傳導的異常激活與炎癥性疾病中急性和慢性的發(fā)病機制有關。在無活性狀態(tài)下，NF-κB通過與NF-κB抑制蛋白(IκBα)結合而位于胞質溶膠中。 NF-κB的激活誘導IκBα從二聚體復合物中釋放和降解，然后是NF-κBp65的磷酸化以及其向細胞核的易位[17]。一旦進入細胞核，NF-κB啟動促炎細胞因子的基因轉錄，包括IL-1β，IL-6和TNF-α[18]。本研究結果顯示，與對照組比較，甲氨蝶呤組各劑量組TLR2、NF-κB mRNA、蛋白表達水平明顯升高水平明顯降低，且隨著甲氨蝶呤組給藥劑量的增加，TLR2、NF-κB mRNA、蛋白表達水平逐漸降低，劑量-效應關系明顯；與雷公藤多苷片組相比，甲氨蝶呤組組低、中劑量組TLR2、NF-κB mRNA、蛋白表達水平明顯升高；高劑量組TLR2、NF-κB mRNA、蛋白表達水平略微升高。而類風濕關節(jié)炎大鼠滑膜炎IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白水平明顯增加，給予甲氨蝶呤后可以抑制其表達。這說明甲氨蝶呤能通過抑制炎癥信號通路TLR2、NF-κB mRNA、蛋白表達水平的表達進而抑制炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α的表達。

綜上所述，甲氨蝶呤能對類風濕關節(jié)炎滑膜炎具有一定程度的修復作用，其機制與甲氨蝶呤能通過抑制炎癥信號通路TLR2、NF-κB mRNA、蛋白表達水平的表達進而抑制炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α的表達有關。