氣相色譜法測(cè)定發(fā)酵乳中的7種短鏈脂肪酸

丁巖，王娟，張迪

(Ofmom中國(guó)有限公司媽咪愛(ài)營(yíng)養(yǎng)研發(fā)中心，北京，101300)

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)通常是指碳鏈中碳原子數(shù)少于6的有機(jī)脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸等[1-3]。SCFAs存在于胃腸道中，對(duì)胃黏膜有一定的保護(hù)作用[4]。乳品在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生SCFAs，SCFAs是發(fā)酵乳的主要風(fēng)味營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一[5]。

目前，最常用的測(cè)定SCFAs含量的方法有液相色譜法[6-9]、氣相色譜法[10-14]和質(zhì)譜法[15-20]，其中高效液相色譜法雖然前處理操作簡(jiǎn)單，但要求樣品基質(zhì)簡(jiǎn)單。對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，例如發(fā)酵乳，則干擾過(guò)多，分離度差，定性及定量都較為困難，且需要消耗大量的有機(jī)試劑。對(duì)于氣相色譜法來(lái)說(shuō)，由于羧基的極性較強(qiáng)，在氣相色譜柱中容易產(chǎn)生吸附作用，導(dǎo)致結(jié)果的重現(xiàn)性差，這種情況尤其在低濃度時(shí)會(huì)發(fā)生，因此SCFAs在進(jìn)入氣相色譜柱前最好進(jìn)行衍生化，同時(shí)衍生化還可以降低這些揮發(fā)性酸的蒸發(fā)損失[21]。質(zhì)譜法具有檢測(cè)靈敏度高，定性準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)于小分子化合物(尤其是分子質(zhì)量小于50的化合物，例如甲酸)，其在質(zhì)譜上沒(méi)有響應(yīng)或響應(yīng)很低。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[15-18]基本采用的是全掃描模式，沒(méi)有充分利用質(zhì)譜靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。采用頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[17-19]，存在的問(wèn)題是，樣品的基質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)系列的基質(zhì)很難完全一致，準(zhǔn)確定量存在困難。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)SCFAs[20]，應(yīng)用還不是很廣泛。另外質(zhì)譜檢測(cè)成本過(guò)高。

綜合考慮，本方法選擇用衍生化方法進(jìn)行前處理，由于衍生物中含有溴元素，所以選擇氣相色譜帶電子捕獲檢測(cè)器進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本方法優(yōu)化了復(fù)雜的衍生化前處理過(guò)程，使操作變得簡(jiǎn)單、快速，消除了雜質(zhì)干擾，提高了分離度，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，適用于發(fā)酵乳中各種SCFAs的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳，實(shí)驗(yàn)室自制；脫脂乳粉原料，雀巢公司；丙酮、正己烷，均為色譜純，默克集團(tuán)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酚酞乙醇溶液、α-溴苯乙酮及18-冠-6醚，sigma公司；Na2HPO4、KH2PO4、H3PO4和KOH，分析純，百靈威公司；甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸標(biāo)準(zhǔn)品，百靈威公司。

實(shí)驗(yàn)室配制試劑：不同質(zhì)量濃度(2、20、100 g/L)的KOH水溶液；體積分?jǐn)?shù)為0.5%的H3PO4水溶液；磷酸鹽緩沖溶液[22](0.08 mol/L的Na2HPO4-KH2PO4水溶液，pH 6.8)：用0.08 mol/L的KH2PO4水溶液調(diào)節(jié)0.08 mol/L的Na2HPO4水溶液至溶液pH值為6.8；衍生化試劑[22](0.151 mol/L的α-溴苯乙酮和0.006 mol/L的18-冠-6醚混合的丙酮溶液)：稱(chēng)取α-溴苯乙酮(2-溴苯乙酮)0.300 5 g和18-冠-6醚0.015 9 g于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容到10 mL刻度，充分混勻，根據(jù)用量現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜(帶電子捕獲檢測(cè)器(ECD))，Agilent公司；Integral 5超純水系統(tǒng)，Millipore公司，水的電阻為18.2 MΩ；Centrifuge 5804R離心機(jī)，Eppendorf公司；DK-8D水浴鍋，常州諾基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：DB-23石英毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；檢測(cè)器溫度：280 ℃；分流比：150∶1；進(jìn)樣量：1 μL；載氣：氮?dú)猓惠d氣流速：1 mL/min；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持10 min，然后以20 ℃/min速率升溫至170 ℃，以6 ℃/min速率升溫至230 ℃，保持9 min。

1.3.2 預(yù)處理

1.3.2.1 樣品預(yù)處理

取10 mL發(fā)酵乳于15 mL離心管中，10 000 r/min離心10 min后，取上清液4 mL(V2)于另一15 mL離心管中，加1～2滴酚酞，用KOH水溶液調(diào)上清液至微變淡粉色，此時(shí)樣品溶液呈弱堿性(強(qiáng)堿弱酸鹽電離呈弱堿性)， SCFAs以酸根形式存在。用超純水定容至5 mL(V1)刻度，混勻后10 000 r/min離心10 min，準(zhǔn)備衍生化。如果樣品中待測(cè)物質(zhì)濃度過(guò)高，可以將樣品在衍生化之前稀釋f倍后再進(jìn)行衍生化處理。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)系列預(yù)處理

分別稱(chēng)取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸各0.25 g到同一100 mL容量瓶中，用水定容到刻度，混合均勻。取4 mL配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液于15 mL帶5 mL刻度的離心管中，加1～2滴酚酞，用KOH溶液調(diào)至淡粉色，然后用水定容到5 mL刻度。此溶液為級(jí)別1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將級(jí)別1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)渲?個(gè)不同級(jí)別混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。各級(jí)別混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度如表1所示。

表1 各級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)溶液中7種SCFAs的質(zhì)量濃度Table 1 The concentration of 7 SCFAs in each level

1.3.3 衍生化

取0.5 mL樣品上清液(或取0.5 mL表1中不同級(jí)別的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液)于10 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液，2 mL衍生化試劑和1 mL丙酮，加蓋密封，100 ℃水浴反應(yīng)40 min，冷卻至室溫后，取0.7 mL衍生后的樣品于2 mL離心管中，加0.7 mL等體積的正己烷渦旋萃取，取正己烷層，進(jìn)氣相色譜分析。衍生化反應(yīng)式如圖1所示。

圖1 SCFAs衍生化反應(yīng)方程式Fig.1 The derivative reaction equation of SCFAs

2 結(jié)果與分析

2.1 SCFAs的定性分析

在上述色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，得到SCFAs各酸單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖和混合酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，如圖2所示。

圖2 七種SCFAs各酸單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖和混合酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of each single acid standard and 7 SCFAs mixed standard

由圖2可以看出，發(fā)酵乳中可能含有的7種SCFAs得到了很好的分離，保留時(shí)間分別為：乙酸25.745 min，甲酸25.884 min，異丁酸26.300 min，丙酸26.498 min，丁酸27.483 min，異戊酸27.729 min，戊酸28.760 min。

2.2 SCFAs的定量分析

一系列的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以各酸的質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，各濃度對(duì)應(yīng)的峰面積y為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)式(1)計(jì)算樣品中的SCFAs的含量。

試樣中各個(gè)SCFAs的含量計(jì)算公式：

(1)

式中：X：試樣中各個(gè)SCFAs的含量，mg/L；C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的試樣中各個(gè)SCFAs的質(zhì)量濃度，mg/L；V1：樣品預(yù)處理時(shí)的定容體積，mL；V2：樣品預(yù)處理時(shí)的取樣體積，mL；f：樣品的稀釋倍數(shù)。

2.3 SCFAs的線性范圍、方法定量限和檢出限

將各個(gè)SCFAs配制成不同級(jí)別的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各個(gè)級(jí)別的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別調(diào)節(jié)pH值和衍生化處理，然后進(jìn)氣相色譜檢測(cè)，各級(jí)別混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各酸質(zhì)量濃度均為20～7 200 mg/L，根據(jù)SCFAs的定量分析方法(2.2)繪制各酸質(zhì)量濃度和對(duì)應(yīng)峰面積的關(guān)系圖，即各酸的衍生化效率圖，如圖3所示。

圖3 七種SCFAs的衍生化效率圖Fig.3 The derivatization efficiency graph of 7 SCFAs

各酸質(zhì)量濃度在20～2 000 mg/L之間時(shí)，曲線均呈線性關(guān)系，隨著質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，從甲酸開(kāi)始，衍生化效率逐漸下降，所以設(shè)定各個(gè)SCFAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為質(zhì)量濃度20～2 000 mg/L。

各酸質(zhì)量濃度在20～2 000 mg/L線性范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如表2所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，各酸的信噪比均>25，符合信噪比大于10作為定量限的要求，所以設(shè)置方法定量限為20 mg/L。

表2 七種SCFAs的線性回歸方程和定量限Table 2 The linear regression equations and quantitative limits of 7 SCFAs

注：x為質(zhì)量濃度，mg/L；y為峰面積。

各酸質(zhì)量濃度在5 mg/L時(shí)，如圖4所示，各個(gè)SCFAs均有檢出，信噪比在8.4～15.4，符合信噪比大于3作為檢出限的要求，所以設(shè)置方法檢出限為5 mg/L。

圖4 七種SCFAs的檢出限色譜圖Fig.4 The detection limit gas chromatogram of 7 SCFAs

2.4 SCFAs的加標(biāo)回收率和精密度

取脫脂乳粉，配制成質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂乳，做3個(gè)加標(biāo)濃度，每個(gè)加標(biāo)濃度做6個(gè)平行，測(cè)定回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明該方法回收率高，重現(xiàn)性好。最低加標(biāo)濃度設(shè)置在定量限上，即質(zhì)量濃度為20 mg/L；由于甲酸和乙酸本底含量較高，所以甲酸和乙酸的最低加標(biāo)濃度提高到質(zhì)量濃度為50 mg/L。加標(biāo)回收率和結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均滿(mǎn)足實(shí)際樣品檢測(cè)的定量要求。

表3 七種SCFAs的加標(biāo)回收率和精密度Table 3 The recovery and precision of 7 SCFAs mixed standard

續(xù)表3

物質(zhì)名稱(chēng)加標(biāo)量/(mg·L-1)本底值/(mg·L-1)結(jié)果均值/(mg·L-1)回收率/%RSD/%異丁酸20.2819.9998.583.78101.400.00104.30102.863.71304.20321.43105.672.76戊酸21.4622.63105.442.40107.300.00111.49103.903.74321.90341.82106.192.88異戊酸21.7421.5899.283.32108.700.00111.57102.643.71326.10345.46105.942.78

3 討論

本方法中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，有兩種操作可以選擇，第一種先調(diào)pH值再逐級(jí)稀釋?zhuān)褪潜痉椒ㄊ褂玫牟僮?；第二種就是先逐級(jí)稀釋再分別調(diào)pH值，分別稱(chēng)取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸各0.25 g到同一100 mL容量瓶中，用水定容到刻度，混合均勻。之后將此混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e吸取每個(gè)級(jí)別的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各4 mL，分別滴加1～2滴酚酞，用KOH調(diào)節(jié)至淡粉色，之后分別定容至5 mL刻度。經(jīng)過(guò)結(jié)果比對(duì)區(qū)別很小，所以選擇先調(diào)pH值再逐級(jí)稀釋的方式，簡(jiǎn)化操作。

本方法預(yù)處理過(guò)程中用KOH調(diào)節(jié)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液呈弱堿性，如果不慎KOH過(guò)量可以用0.5% 的H3PO4水溶液回調(diào)，不影響檢測(cè)結(jié)果。

本方法還可以用于其他水系樣品或可溶于水的樣品的SCFAs測(cè)定的參考，例如果汁，葡萄酒，糞便等。