高場強(qiáng)超聲處理對(duì)柑橘果膠分子結(jié)構(gòu)及其功能特性的影響

陳倩茜，張萌，王海燕，黃夢玲，劉鳳霞

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430070)

果膠是一類廣泛存在于植物細(xì)胞壁的初生壁和細(xì)胞中間片層的雜多糖[1]，其結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成復(fù)雜，普遍觀點(diǎn)認(rèn)為果膠結(jié)構(gòu)分為光滑區(qū)和毛發(fā)區(qū)，光滑區(qū)由α-D-半乳糖醛酸殘基通過α-1,4糖苷鍵聚合而成，毛發(fā)區(qū)由高度分支的α-L-鼠李半乳糖醛酸聚糖組成[2-4]。有研究表明不同來源的果膠具有不同的半乳糖醛酸含量、蛋白含量、總糖含量和分子質(zhì)量，其中分子質(zhì)量的差別最大[5]。果膠作為天然的大分子多糖，具有優(yōu)良的增稠、凝膠、穩(wěn)定和功能特性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、紡織、煙草等行業(yè)[6-11]。但天然果膠由于分子質(zhì)量較大且不同來源果膠結(jié)構(gòu)上的巨大差異而限制了其在食品及醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用[12]，為全面滿足需求，通常采用化學(xué)、生物和物理的改性方法來降低果膠分子質(zhì)量、改變其甲酯基含量及分布、添加基團(tuán)對(duì)果膠結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾等[13-15]。其中分子質(zhì)量是果膠的一項(xiàng)重要指標(biāo)，大分子質(zhì)量的果膠不能被人體吸收，而改性之后的小分子質(zhì)量果膠可被人體吸收，從而擴(kuò)大了果膠在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用范圍[16-17]。柑橘皮是果膠的重要來源，果膠含量占其干重的20%～30%[36]。我國柑橘種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，按國內(nèi)柑橘年產(chǎn)量和加工量推算，每年可產(chǎn)生 200萬t以上的柑橘皮副產(chǎn)物，除極少數(shù)用于陳皮等加工外，大部分被直接丟棄掩埋，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[37]。因此，利用我國豐富的柑橘皮果膠資源做研究可在一定程度上提高柑橘皮利用率。

高場強(qiáng)超聲技術(shù)是利用超聲產(chǎn)生的巨大沖擊波破碎細(xì)胞，目前已被廣泛用于果膠提取[18-22]。另外，由于超聲處理過程中產(chǎn)生的機(jī)械作用、空化作用和熱效應(yīng)[23-24]，超聲波也被證明是一種生物大分子的有效、綠色地定向降解方法[25]。王博等利用超聲波提取水溶性茯苓多糖，表明超聲波不會(huì)對(duì)其單糖種類、組成以及單糖結(jié)構(gòu)造成影響，但是對(duì)茯苓多糖的分子鏈有顯著影響[26]。SESHADRI等研究了超聲波方法對(duì)高甲氧基果膠流變學(xué)特性和光學(xué)特性影響，結(jié)果顯示隨著超聲強(qiáng)度的增強(qiáng)和處理時(shí)間的延長，果膠形成凝膠的凝膠力較弱，形成的凝膠更加透明，同時(shí)果膠的流變學(xué)特性發(fā)生了明顯變化，逐步趨向于牛頓流體[27]。然而，上述研究主要集中在超聲處理對(duì)果膠分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及流變特性的研究，超聲處理后果膠乳化特性的變化研究相對(duì)較少，超聲處理通過影響果膠分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，進(jìn)而影響果膠各類功能特性的研究尚缺乏系統(tǒng)性。

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探究不同超聲時(shí)間和超聲強(qiáng)度條件下柑橘果膠的理化指標(biāo)、流變性質(zhì)和乳化性質(zhì)的變化，以期明確超聲對(duì)果膠多糖的定向降解規(guī)律，為后期低分子果膠生物活性的研究及實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商品柑橘果膠，貨號(hào)為P9135，購于Sigma- Aldrich上海貿(mào)易公司。

四硼酸鈉、半乳糖醛酸、間苯基苯酚、濃H2SO4、NaOH、蒽酮試劑、疊氮化鈉、右旋糖酐、甲醇、NaNO3等均為國產(chǎn)分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；食用級(jí)精制大豆油，購于上海嘉里食品工業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技有限公司生產(chǎn)；JA12002電子天平，龍騰電子公司生產(chǎn)；BT224S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司生產(chǎn)；PB-10PH計(jì)，德國Sartorius集團(tuán)生產(chǎn)；紫外可見分光光度計(jì)UV-762，北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn)；流變儀AR2000，美國TA公司生產(chǎn)；激光粒度分析儀，美國貝克曼庫特公司生產(chǎn)；Zeta電位儀，英國馬爾文儀器公司生產(chǎn)；內(nèi)切式勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 樣品超聲波處理

采用超聲波處理器模型JY92-2D處理樣品。準(zhǔn)確稱取3.00 g柑橘果膠溶于97 mL水中，取25 mL果膠溶液置于頻率20 kHz的超聲場中。超聲作用時(shí)間為0、10、20、30和45 min；超聲強(qiáng)度為20%、30%、40%、50%和60%；超聲探頭直徑6 mm；探頭插入液面下2 cm，液面高度4 cm；溫度設(shè)置(25±1) ℃；脈沖時(shí)間4 s，間歇2 s；單因素實(shí)驗(yàn)中改變超聲時(shí)間時(shí)強(qiáng)度為50%，改變超聲強(qiáng)度時(shí)時(shí)間為10 min。試驗(yàn)過程中采用冰浴控溫，溫度由超聲波儀自帶的溫度探頭測定。為減小每次的操作誤差，處理完的樣品迅速置于4 ℃條件下冷藏并于24 h內(nèi)測定相關(guān)性質(zhì)。

1.3.2 半乳糖醛酸含量測定

果膠半乳糖醛酸含量的測定依據(jù)參考文獻(xiàn)[28]，略作修改。取果膠溶液1 mL，加入6 mL 0.012 5 mol/L的濃硫酸-四硼酸鈉溶液，立即放入冰水浴中。振蕩混合均勻后于沸水浴中5 min，并再次放入冰水浴中冷卻至室溫后加入0.1 mL的0.15%間苯基苯酚溶液，振蕩后，放置15 min后用分光光度計(jì)在520 nm處測定其吸光值，空白加入的反應(yīng)試劑為蒸餾水。以半乳糖醛酸標(biāo)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度值Y與果膠半乳糖醛酸含量X關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=99.052X+4.584 5，R2=0.993。果膠半乳糖醛酸含量按如下公式計(jì)算：

(1)

式中：Y,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的半乳糖醛酸質(zhì)量濃度，μg/mL；N,稀釋倍數(shù)；m，溶解的果膠樣品重量,μg。

1.3.3 總糖含量測定

果膠總糖含量的測定依據(jù)參考文獻(xiàn)[29]，略作修改。精確量取80 μg/mL的果膠樣品1 mL，加入4 mL蒽酮試劑(0.2 g蒽酮溶于100 mL濃H2SO4中，現(xiàn)配現(xiàn)用)，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，煮沸10 min。用冰浴冷卻至室溫后在620 nm處測其吸光值，空白以1 mL蒸餾水代替樣品。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度值Y與果膠總糖含量X關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.006 86X+0.009 45，R2=0.995，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線當(dāng)量計(jì)算出果膠中的總糖含量。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測定

將3%果膠溶液用蒸餾水稀釋至80 μg/mL，按照Lowry試劑盒的操作步驟測定其吸光值，空白以1 mL蒸餾水代替樣品。使用Lowry試劑盒測定繪制吸光度值Y與蛋白質(zhì)含量X關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=2.650 4X-0.024 75，R2=0.994，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線當(dāng)量計(jì)算果膠中的蛋白含量。

1.3.5 果膠分子質(zhì)量分布的測定

果膠分子質(zhì)量分布的測定采用十八角度激光散射儀進(jìn)行。流動(dòng)相為0.05 mol/L NaNO3(含0.02%疊氮化鈉)，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 mL。采用20%甲醇做歸一化處理，以右旋糖酐為標(biāo)品，測定樣品果膠的分子質(zhì)量分布。

1.3.6 果膠溶液粒徑和電勢測定

果膠溶液粒徑和電勢的測定依據(jù)參考文獻(xiàn)[30]，略作修改。將果膠溶液稀釋至質(zhì)量濃度1 g/L，使用馬爾文激光粒度儀Size模式，在25 ℃下測定不同果膠溶液的粒徑分布情況。調(diào)節(jié)果膠溶液pH值分別為3、4、5、6、7，使用馬爾文激光粒度儀Zeta potential模式，在25 ℃測定其不同pH下的電位。

1.3.7 果膠溶液流變性質(zhì)和表觀黏度測定

果膠溶液流變性質(zhì)和表觀黏度的測定依據(jù)參考文獻(xiàn)[30]，略作修改。果膠溶液的流變性質(zhì)和表觀黏度測定采用空氣軸承旋轉(zhuǎn)流變儀AR2000進(jìn)行。選用40 mm的2°錐板，溫度使用恒溫水循環(huán)系統(tǒng)控制在25 ℃，果膠濃度3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，樣品放置時(shí)剛好覆蓋轉(zhuǎn)子邊緣。剪切速率0.01～100 s-1，溫度25 ℃，記錄檢測樣品的粘度隨剪切速率的變化。

應(yīng)變掃描：固定頻率1 Hz，溫度25 ℃，在0.01%～100%進(jìn)行應(yīng)變掃描以確定線性黏彈區(qū)(LVR)，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，為保證測定過程中所有果膠樣品均在線性黏彈區(qū)內(nèi)，選擇1%作為應(yīng)變掃描值進(jìn)行0.1～10 Hz頻率掃描，溫度25 ℃，記錄貯藏模量G′和損耗模量G″。

1.3.8 果膠乳化性質(zhì)的測定

果膠乳化性質(zhì)的測定依據(jù)參考文獻(xiàn)[31]，略作修改。果膠乳化性主要從乳液粒度和乳液穩(wěn)定性兩方面進(jìn)行表征。濃度為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的果膠溶液20 g中加入15 g精制大豆油于50 mL離心管中，10 000 r/min均質(zhì)3 min(1 min/次)制備果膠乳化液。乳液粒度測定采用馬爾文激光粒度儀進(jìn)行，測量背景為水，逐步滴加樣品使遮光度在75%左右進(jìn)行測量，每個(gè)樣品自動(dòng)重復(fù)測定3次。果膠乳液穩(wěn)定性測定采用儲(chǔ)藏期法進(jìn)行，乳液水平放置在4 ℃冰箱中并加入0.02%疊氮鈉防腐，觀察乳液穩(wěn)定情況。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用Origin 8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)和T檢驗(yàn)并制圖，顯著性水平0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高場強(qiáng)超聲處理對(duì)果膠理化指標(biāo)的影響

2.1.1 果膠溶液半乳糖醛酸、蛋白質(zhì)及總糖含量

不同處理果膠的半乳糖醛酸、蛋白質(zhì)及總糖含量如表1和表2所示。由表1和表2結(jié)果可知，超聲處理后果膠的半乳糖醛酸、蛋白質(zhì)和總糖含量并未發(fā)生顯著性變化。

2.1.2 果膠分子質(zhì)量分布

由圖1可知，超聲波處理時(shí)間和強(qiáng)度使柑橘果膠的分子質(zhì)量有下降趨勢。隨著超聲時(shí)間的增加和超聲強(qiáng)度的增強(qiáng)，果膠分子質(zhì)量分布趨于向小分子質(zhì)量果膠移動(dòng)，這可能是由于超聲處理過程中產(chǎn)生的空化效應(yīng)引起果膠分子鏈的斷裂[25-26]。

A-超聲時(shí)間; B-超聲強(qiáng)度圖1 不同超聲時(shí)間和強(qiáng)度對(duì)柑橘果膠分子質(zhì)量分布的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time and intensity on molecular weight of citrus pectin

由果膠平均分子質(zhì)量變化結(jié)果可知(表1、表2)，超聲時(shí)間較短或超聲強(qiáng)度較低時(shí)，果膠平均分子質(zhì)量降低速率較大，而隨著時(shí)間的延長和強(qiáng)度的增大，果膠平均分子質(zhì)量降低速率減小。如前所述，超聲引起果膠降解主要是由于空化效應(yīng)，但這種效應(yīng)對(duì)果膠分子質(zhì)量的影響不會(huì)隨著處理時(shí)間的延長和處理強(qiáng)度的增加而無限制增強(qiáng)，因此超聲處理下果膠的平均分子質(zhì)量逐漸趨于穩(wěn)定。另外，超聲處理效果與反應(yīng)介質(zhì)的性質(zhì)及超聲波裝置等都有密切關(guān)系[32]。

2.1.3 果膠溶液粒徑

由表1和表2中果膠溶液粒徑數(shù)據(jù)可知，超聲處理會(huì)明顯影響果膠溶液的粒徑，超聲時(shí)間越長、超聲強(qiáng)度越大，果膠溶液粒徑越小。一方面，超聲處理會(huì)通過打斷果膠的半乳糖醛酸長鏈而減小果膠分子粒徑，這一結(jié)果與果膠分子質(zhì)量變化趨勢相一致；另一方面，超聲處理也可通過影響果膠分子的空間構(gòu)象而影響果膠溶液的粒徑大小。王苗苗等的研究發(fā)現(xiàn)[30]，超聲處理會(huì)導(dǎo)致芒果果膠伸展的構(gòu)象趨于聚集而引起果膠粒徑減小。

2.1.4 果膠溶液Zeta電勢

Zeta電勢可有效地表征大分子如果膠的表面電荷性質(zhì)和膠體體系的穩(wěn)定性。表1和表2為果膠溶液在不同pH下的Zeta電勢，由結(jié)果可知各果膠在pH 3～7的Zeta電勢均為負(fù)值，且呈現(xiàn)出相同的規(guī)律。即溶液pH=3時(shí)，果膠電勢的絕對(duì)值最小，隨著pH的增大，果膠電勢的絕對(duì)值也增大，當(dāng)pH達(dá)到6～7時(shí)，電勢不再發(fā)生明顯變化。超聲處理前后的果膠在相同pH下的電勢并未發(fā)生顯著變化，表明超聲處理并未顯著改變果膠溶液表面電荷分布情況。

表1 超聲時(shí)間對(duì)柑橘果膠平均分子質(zhì)量、粒徑、Zeta電勢及理化性質(zhì)的影響Table 1 Effects of ultrasonic time on molecular weight, size, zeta potential and physic-chemical properties of citrus pectin

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。同一行中不同大寫字母標(biāo)注表示0.05水平上有顯著性差異；同一列中不同小寫字母標(biāo)注表示在0.05水平上有顯著性差異。

表2 超聲強(qiáng)度對(duì)柑橘果膠平均分子質(zhì)量、粒徑、Zeta電勢及理化性質(zhì)的影響Table 2 Effects of ultrasonic intensity on molecular weight, size, zeta potential and physic-chemical properties of citrus pectin

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。同一行中不同大寫字母標(biāo)注表示0.05水平上有顯著性差異；同一列中不同小寫字母標(biāo)注表示在0.05水平上有顯著性差異。

2.2 高場強(qiáng)超聲處理對(duì)果膠溶液表觀粘度變化的影響

由圖2可知，隨剪切速率的增加，果膠呈現(xiàn)剪切變稀的趨勢即假塑性流體的性質(zhì)，超聲處理后逐漸趨于牛頓流體；且隨著超聲時(shí)間的延長和超聲強(qiáng)度的增大，相同剪切速率下果膠溶液的表觀黏度下降。該研究與SESHADRI等的研究結(jié)果相一致[27]。果膠的黏度與果膠分子質(zhì)量和半乳糖醛酸含量密切相關(guān)[30]，如前所述，超聲處理后果膠的半乳糖醛酸含量無顯著變化，但果膠平均分子質(zhì)量顯著減小，這可能是導(dǎo)致果膠表觀黏度下降的主要原因。

A-超聲時(shí)間; B-超聲強(qiáng)度圖2 不同超聲時(shí)間和強(qiáng)度對(duì)果膠表觀黏度的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time and intensity on apparent viscosity of citrus pectin

2.3 高場強(qiáng)超聲處理對(duì)果膠溶液黏彈性變化的影響

在應(yīng)力為1%、頻率掃描范圍為0.1至100 Hz條件下確定超聲處理前后果膠溶液的貯存模量G′和損耗模量G″。G′代表樣品體系的彈性成分，而損耗模量G″代表樣品體系的黏性成分。G′>G″的體系是屬于凝膠體系，而G′G′一直存在，表明果膠一直處于溶膠狀態(tài)。隨著不同超聲時(shí)間的處理，列出圖3-B和圖3-C，G′與G″出現(xiàn)交點(diǎn)，說明果膠凝膠能力增強(qiáng)，即超聲處理后果膠表現(xiàn)為彈性特性，更易形成凝膠。隨著不同超聲強(qiáng)度的處理，圖3-D和圖3-E中，也出現(xiàn)了G′與G″交點(diǎn)，說明果膠凝膠能力增強(qiáng)。雖然超聲波處理后果膠凝膠能力增強(qiáng)，但交點(diǎn)的變化沒有顯示出規(guī)律性。

由圖4可知，超聲處理后果膠溶液的損耗模量(黏性)/貯存模量(彈性)較原始果膠減小，表明超聲處理后果膠溶液更傾向于體現(xiàn)彈性特性。有研究表明，超聲波處理果膠會(huì)使其酯化度降低，而低酯果膠形成凝膠的速率會(huì)隨著其酯化度的降低而加快，即更易形成凝膠[12]。

A-空白;B-30 min;C-45 min;D-40%;E-60%圖3 不同超聲時(shí)間和強(qiáng)度果膠的頻率掃描結(jié)果Fig.3 Effects of ultrasonic time and intensity on the storage modulus and the loss modulus with angular frequency in pectin solution

A-超聲時(shí)間; B-超聲強(qiáng)度圖4 不同超聲時(shí)間和強(qiáng)度對(duì)柑橘果膠黏彈性的影響Fig.4 Effects of ultrasonic time and intensity on viscoelasticity of citrus pectin

2.4 高場強(qiáng)超聲處理對(duì)果膠乳化性質(zhì)的影響

2.4.1 果膠乳液粒度

乳液粒度大小是表征乳液穩(wěn)定性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，通常情況下，乳液粒度越小、分布越均勻，乳液的穩(wěn)定性越好[29]。如圖5所示，超聲處理后果膠乳液粒徑顯著減小，且處理時(shí)間越長，強(qiáng)度越大，乳液粒徑越小，表明超聲處理可能會(huì)提高果膠乳液的穩(wěn)定性。

A-超聲時(shí)間; B-超聲強(qiáng)度圖5 果膠乳液在不同超聲時(shí)間和強(qiáng)度處理下的粒度Fig.5 Effects of ultrasonic time and intensity on particle size of pectin emulsion注：同一處理?xiàng)l件下不同大寫字母標(biāo)注表示0.05水平上有顯著性差異；同一天中不同小寫字母標(biāo)注表示在0.05水平上有顯著性差異。

已有研究表明，超聲處理可以通過降低乳液的粒度的方式提高乳液穩(wěn)定性[33-35]。

2.4.2 果膠乳液穩(wěn)定性

圖6所示為各果膠乳液在4 ℃條件下貯藏后的乳液照片。由圖6可以看出，不同乳液經(jīng)貯藏后乳化層均發(fā)生了肉眼可見的分層現(xiàn)象，但乳化層的高度不同。其中，未處理的果膠乳液分層現(xiàn)象最為嚴(yán)重，而隨著超聲強(qiáng)度的增大，分層現(xiàn)象趨于不明顯，表明超聲處理可在一定程度上提高果膠乳液的穩(wěn)定性。影響乳液穩(wěn)定性的因素很多，蛋白含量、果膠分子質(zhì)量分布及構(gòu)象是其中重要因素，然而，具體的影響機(jī)制還需進(jìn)一步探索研究。

圖6 果膠乳液貯藏穩(wěn)定性Fig.6 Stability of the O/W emulsions prepared by different citrus pectin over storage

3 結(jié)論

本文研究了不同超聲條件(時(shí)間、強(qiáng)度)對(duì)果膠理化性質(zhì)、流變特性和乳化特性的影響。由結(jié)果可知，超聲波處理不會(huì)影響果膠中半乳糖醛酸、蛋白質(zhì)和總糖含量及組成，但是可能會(huì)影響半乳糖醛酸長鏈結(jié)構(gòu)，使果膠分子質(zhì)量下降、粒度減小，由此導(dǎo)致果膠表觀黏度下降，逐漸趨于牛頓流體。在試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，處理時(shí)間越長、強(qiáng)度越大，果膠表觀黏度下降越顯著。

超聲處理后果膠乳液的粒度減小，且處理時(shí)間越長、強(qiáng)度越大，粒度減小越顯著。乳液粒度大小會(huì)顯著影響乳液的穩(wěn)定性，貯藏穩(wěn)定試驗(yàn)的研究也發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間越長、強(qiáng)度越大，果膠乳液的分層越慢，乳球聚集越慢，表明超聲處理可在一定程度上改善果膠的乳化特性。

綜上，超聲波這一處理方法綠色無污染，條件溫和，效果顯著，可以作為一種切實(shí)可行的果膠定向降解方法。超聲波處理能夠通過降低果膠分子質(zhì)量，進(jìn)而影響果膠表觀黏度及其凝膠、乳化等功能特性。同時(shí)，已有研究表明，降解后的小分子質(zhì)量果膠，能更好地被人體吸收，且相對(duì)于高分子質(zhì)量果膠而言具有更好的生理活性。然而，超聲改性后的果膠在生理學(xué)及醫(yī)學(xué)上的生物利用率及在體內(nèi)生理活性的變化，還有待我們進(jìn)一步研究。