白三葉抗凍性研究

趙梅，周瑞蓮，王振南

（1.山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南 250100；2.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264025；3.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276000）

三葉草（Triforlium hybridum）屬多年生草本植物，是溫帶地區(qū)廣為種植的優(yōu)質(zhì)豆科牧草[1]，全球250余種，最重要的有10種，我國常見的野生種有白三葉、紅三葉、草莓三葉草和野火球等；引自國外的有雜三葉、絳三葉、地三葉、埃及三葉4種[2-3]。目前，我國研究栽培較多的是白三葉、紅三葉和地三葉。

白三葉草又名白車軸草，原產(chǎn)于歐洲及小亞細(xì)亞地區(qū)[4]，經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)，白三葉是三葉草中表現(xiàn)最好的系列，其綜合性狀優(yōu)于紅三葉和雜三葉。

本文結(jié)合目前白三葉抗凍性研究現(xiàn)狀，生理生化調(diào)控機(jī)理、抗凍基因工程研究、白三葉的應(yīng)用及栽培中存在的問題進(jìn)行綜述，歸納了國內(nèi)外對白三葉抗凍性研究的進(jìn)展，旨在為白三葉抗凍性研究提供大量理論基礎(chǔ)，為其全面推廣及在未來提高白三葉抗凍性在園林綠化中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 白三葉抗凍性形態(tài)生理學(xué)研究現(xiàn)狀

1.1 白三葉抗凍形態(tài)學(xué)特征研究

白三葉根的結(jié)構(gòu)有利于抵抗低溫的傷害。多年生草本植物之所以能在各種各樣環(huán)境中生存，維持其無性系群體數(shù)量的穩(wěn)定性，其機(jī)理在于多年生草本植物一般都具有從母體分成獨(dú)立植株進(jìn)行營養(yǎng)繁殖的能力。大量研究已經(jīng)證實(shí)：許多無性系植物的各器官（如分枝、匍匐莖或根狀莖）在生理上與和他們相連的器官整合，用于生長的物質(zhì)可在它們之間進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。單一器官或整個(gè)植株的功能受整合反應(yīng)強(qiáng)烈影響，能滿足任何器官的物質(zhì)需要，或緩沖脅迫造成的影響。

白三葉根的組織結(jié)構(gòu)與抗寒性也有密切相關(guān)性。趙偉等[6]對瑞文德、海發(fā)、鋪地、小黑龍4種白三葉進(jìn)行-10℃的低溫處理，研究了根的結(jié)構(gòu)與抗寒性關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)抗寒性最強(qiáng)的小黑龍根次生結(jié)構(gòu)中木質(zhì)部比率最大，韌皮部比率最低，導(dǎo)管直徑最??；抗寒性最差的海發(fā)根次生結(jié)構(gòu)中木質(zhì)部比率最小，韌皮部比率和導(dǎo)管直徑最大。這說明根的組織結(jié)構(gòu)與抗寒性存在著遺傳上的相互制約關(guān)系，反映了白三葉品種間抗寒性在遺傳上的結(jié)構(gòu)特征，可作為白三葉品種抗寒性的鑒定指標(biāo)。

1.2 白三葉抗凍生理生化機(jī)理研究

1.2.1 白三葉葉片細(xì)胞膜穩(wěn)定性與抗凍性關(guān)系

在植物的抗寒研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜可能是凍害發(fā)生的首要位置，膜系統(tǒng)損傷首先是冷凍引發(fā)的嚴(yán)重脫水所致[7]。大量研究結(jié)果揭示和證實(shí)，細(xì)胞的各種膜系統(tǒng)，如線粒體、葉綠體、液泡膜和質(zhì)膜等的穩(wěn)定性與植物的抗寒、抗旱等抗逆性有著密切的關(guān)系，而質(zhì)膜的穩(wěn)定性與其他膜系統(tǒng)相比則具有更重要的作用，可以說是關(guān)鍵中的關(guān)鍵。

白三葉的抗凍性與細(xì)胞膜透性有著密切的關(guān)系。范玉貞[8]于2009年研究了10℃和0℃下白三葉電導(dǎo)率和MDA含量的變化，結(jié)果顯示：隨著脅迫溫度的降低，電導(dǎo)率和MDA均呈升高趨勢。電導(dǎo)率從對照的2.27%增加到3.69%（1O℃）和7.84%（0℃），10℃和0℃低溫處理的電導(dǎo)率分別是對照的1.63倍和3.45倍，這表明，隨著脅迫溫度下降，膜系統(tǒng)的透性顯著增加。

白三葉細(xì)胞膜脂肪酸的成分也影響其抗寒性。許多研究者發(fā)現(xiàn)，生長在低溫中的植物，其膜脂中的不飽和脂肪酸的含量高，膜相變溫度也隨之降低，且與植物的抗寒性成正相關(guān)[9]。

1.2.2 低溫脅迫下白三葉草光合作用的適應(yīng)性變化

目前，對低溫下植物光合作用變化的研究較多，但是結(jié)果并不一致。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下植物的光合作用往往會(huì)下降。例如苜蓿幼苗經(jīng)-5～-6℃處理4h后，最大凈光合速率降低[10]。這是因?yàn)橹参镌诘蜏孛{迫下，由于水分對保衛(wèi)細(xì)胞的供應(yīng)不足，導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞的膨壓不足，致使氣孔不能張開，光合作用下降；還有人認(rèn)為，低溫導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，降低了細(xì)胞間隙中的二氧化碳濃度，光合作用降低。但是Martin等[11]認(rèn)為，低溫之所以會(huì)造成光合作用降低，是由于低溫下光合作用器官操縱二氧化碳濃度升高，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，也就是說，低溫下光合作用的降低主要是由非氣孔因素造成的[12]。

1.2.3 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對白三葉抗凍性的作用

兼容性物質(zhì)的合成和積累，冷誘導(dǎo)蛋白的合成及碳水化合物代謝的變化，（Becket al.,2004）都能維持生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，增加植物的抗冷抗凍性。

大量研究發(fā)現(xiàn)，碳水化合物可以提高植物細(xì)胞的滲透勢，降低水勢，穩(wěn)定細(xì)胞壁，為代謝提供能源，所以被認(rèn)為可以提高植物的抗凍性[13]。劉艷紅等[14]對高山冰緣植物粗脂肪、可溶性糖和類黃酮的含量變異與環(huán)境適應(yīng)關(guān)系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，高山冰緣植物積累高含量的可溶性糖，提高了植物抗凍和抗紫外線輻射的能力，是植物適應(yīng)冰緣環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)。

低溫脅迫下，白三葉細(xì)胞內(nèi)淀粉和可溶性糖積累量也會(huì)發(fā)生變化。Tronsm[15]通過研究冰凍和脫凍條件下兩種草中可溶性糖含量和糖苷酶活性的變化發(fā)現(xiàn)，在冰凍和脫凍條件下，可溶性糖的總量變化不大，但是在冰凍時(shí)可溶性糖會(huì)轉(zhuǎn)化成寡糖，蔗糖和低聚多糖含量增加。這表明，冷凍條件下，蔗糖的活性提高；脫凍后活性下降，α-半乳糖苷酶活性增加，由此得出，糖苷酶的活性可能與冷凍時(shí)期多糖的動(dòng)態(tài)變化有關(guān)。

1.2.4 抗氧化酶系統(tǒng)對白三葉抗凍性的作用

安瑩[16]研究了低溫對白三葉保護(hù)酶活性的影響，她發(fā)現(xiàn)，在15～-10℃的溫度梯度下，白三葉葉片中POD和SOD兩種抗氧化酶的變化趨勢基本一致，并且當(dāng)溫度降到-5℃時(shí)，葉片內(nèi)SOD和POD兩種保護(hù)酶活性會(huì)急劇升高，清除活性氧自由基，從而避免膜傷害。

這表明，低溫逆境條件下，白三葉草的抗氧化酶系統(tǒng)能夠清除細(xì)胞產(chǎn)生的大量氧自由基，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，對維持機(jī)體正常生長起著關(guān)鍵的作用。

2 白三葉抗凍基因工程研究進(jìn)展

長期以來，人們試圖通過基因工程的方法提高白三葉的適應(yīng)性，但其組織的有效再生一直是白三葉基因工程研究中無法克服的困難。其實(shí)，有關(guān)白三葉的轉(zhuǎn)基因研究開始的較早，早在1987年White就建立了其轉(zhuǎn)化體系，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得首例轉(zhuǎn)基因白三葉植株[17]。

關(guān)于白三葉的抗寒育種以前主要采用傳統(tǒng)常規(guī)育種技術(shù)和方法，但由于其周期長、效率低、工作繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn)在農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求[18]。最近十年來，隨著對抗寒分子機(jī)理認(rèn)識的不斷加深，人們不斷嘗試采用基因工程手段培育抗寒新品種。1989年，Bowler等[19]把煙草的Mn-SODcDNA導(dǎo)入苜蓿中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物SOD活性增強(qiáng)，將SOD的cDNA導(dǎo)入煙草、番茄和苜蓿中，大量表達(dá)后提高了植株抗氧化能力[20]。

抗凍蛋白（antifreeze proteins，APFS）是1969年Devrise首次從南極極地海魚中的血液中發(fā)現(xiàn)的，在魚類和昆蟲中研究比較深入。植物AFPs的研究起步較晚，20世紀(jì)90年代初期才開始研究，1992年，加拿大Griffith等（陳儒鋼等，2008；）首次報(bào)道從經(jīng)過低溫鍛煉可忍受細(xì)胞外結(jié)冰的冬黑麥中發(fā)現(xiàn)了植物內(nèi)源性AFP，標(biāo)志著植物抗凍蛋白研究的開始。

3 存在問題及展望

白三葉具有較長的匍匐莖，可進(jìn)行無性系繁殖，節(jié)與潮濕的土壤接觸產(chǎn)生不定根，當(dāng)老組織死亡時(shí)，這些不定根為匍匐莖提供營養(yǎng)，增加了匍匐莖的生存機(jī)會(huì)。這種獨(dú)特的繁殖方式，使白三葉可以抵抗低溫冰凍脅迫，因此，在我國北方地區(qū)廣泛種植。

隨著城市綠化建設(shè)的迅速發(fā)展，草坪伴隨人們戶外運(yùn)動(dòng)、娛樂地、休假地設(shè)施的發(fā)展而興起，由于白三葉草草坪保綠期長（一般在200天以上），繁殖快、生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、耐蔭、栽培管理簡單、不需要修剪，所以白三葉可作為觀賞草坪應(yīng)用，我國的沈陽、哈爾濱、北京等地都用白三葉草作觀賞草坪。

此外，白三葉是果園生草良種。果園生草就是在果園內(nèi)種植對果樹生產(chǎn)有益的草，它是果園保持水土、增加土壤有機(jī)質(zhì)和提高土壤肥力、改善果樹生態(tài)環(huán)境的有效措施，在發(fā)達(dá)國家早已普及，并成為果園科學(xué)化管理的一項(xiàng)基本內(nèi)容。

雖然白三葉草具有很高的應(yīng)用價(jià)值，但是經(jīng)過十幾年的種植，白三葉草坪的一些缺點(diǎn)和不足逐漸顯露出來，甚至有人提出將白三葉列為惡性雜草，在園林造景中嚴(yán)禁使用[21]。

首先，白三葉草的侵占性特別強(qiáng)，危害其他草坪草的生長。由于白三葉的適應(yīng)性特別強(qiáng)，當(dāng)種子落入雜草或公園其他草坪中后，很快會(huì)生長繁殖，快速生根、匍匐莖和根群，其它草坪草的生長環(huán)境會(huì)受到限制，生活力逐漸下降，當(dāng)白三葉生長2～3年后逐漸成為優(yōu)勢種取代其他草坪草。

因此，當(dāng)混播草坪種有白三葉植株時(shí)應(yīng)及早連根鏟除，以免侵占其他草坪草。另外，可以將白三葉草作為封閉型觀賞草坪建植，建立獨(dú)立的花壇、或者具有獨(dú)立觀賞價(jià)值的城市道路隔離帶，避免白三葉草種子擴(kuò)散。