通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)25個(gè)小熊貓的微衛(wèi)星位點(diǎn)

楊艾琳， 謝軍金， 沈富軍， 張文平， 侯蓉， 張志和， 張亮*

(1. 四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都大熊貓繁育研究基地，成都610081；2.北京師范大學(xué)，北京100875)

小熊貓Ailurusfulgens是國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，主要分布在喜馬拉雅-橫斷山脈一帶，有2個(gè)亞種：指名亞種A.f.fulgens和川西亞種A.f.styani(高耀亭，1987)。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，小熊貓野生種群生存狀況不斷惡化。世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)紅色名錄在其評(píng)估報(bào)告中指出，由于棲息地的退化和破碎化，小熊貓野生種群已處于瀕危(EN)狀態(tài)(Glatston，2015)。當(dāng)各隔離的小熊貓小種群面臨長(zhǎng)期續(xù)存的挑戰(zhàn)時(shí)，開(kāi)展遷地保護(hù)，以期復(fù)壯未來(lái)的野生種群是必要的。同時(shí)，這亦是緩解小熊貓野生種群壓力的重要手段之一。如何建立科學(xué)的小熊貓圈養(yǎng)種群管理體系，力求實(shí)現(xiàn)種群的自我維持，是目前管理者們亟待解決的問(wèn)題。

根據(jù)中國(guó)動(dòng)物園協(xié)會(huì)2017年的譜系調(diào)查，現(xiàn)存圈養(yǎng)小熊貓個(gè)體為485只。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)小熊貓圈養(yǎng)種群的數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)，但遺憾的是，由于缺乏科學(xué)的管理體系，很多機(jī)構(gòu)小熊貓種群的管理記錄不僅不完善，甚至還存在一些錯(cuò)誤記錄。同時(shí)，現(xiàn)有的配對(duì)方式易導(dǎo)致圈養(yǎng)種群遺傳多樣性丟失，甚至發(fā)生近交衰退，最后威脅整個(gè)種群的續(xù)存。遺傳多樣性對(duì)于物種特別是瀕危物種的保持至關(guān)重要(Meffe & Carroll，1994)，瀕危物種遺傳多樣性往往較低，而且有效種群也較小，因此易發(fā)生遺傳漂變。近交是有共同祖先的個(gè)體間的交配(Blouin & Blouin，1988)。遺傳多樣性的丟失和近交的聯(lián)合作用會(huì)降低種群對(duì)環(huán)境/氣候變化的適應(yīng)力，通過(guò)近交衰退直接或間接地導(dǎo)致適合度下降(Keller & Waller，2002；Armstrong & Seddon，2008；Jamieson，2011)。保護(hù)遺傳學(xué)是保護(hù)生物學(xué)研究中的一個(gè)核心部分，主要研究瀕危物種的遺傳多樣性和保護(hù)物種的進(jìn)化潛力(李明等，2001)，加強(qiáng)保護(hù)遺傳學(xué)方面的研究，及時(shí)為圈養(yǎng)種群的管理提供科學(xué)指導(dǎo)。

微衛(wèi)星即簡(jiǎn)單重復(fù)序列，由相對(duì)短片段的隨機(jī)重復(fù)組成，常常被偶然發(fā)現(xiàn)于已經(jīng)測(cè)序過(guò)的DNA片段上(Tautz & Renz，1984)。微衛(wèi)星是脊椎動(dòng)物基因組的重要組成部分，相比于線粒體DNA和核基因內(nèi)含子，微衛(wèi)星具有相對(duì)較高的突變率(Ryman & Leimar，2008)，在整個(gè)基因組上分布廣泛(Kashietal.，1997)。

微衛(wèi)星作為一個(gè)應(yīng)用廣泛且十分可靠的分子標(biāo)記，常常用于解決種群遺傳和進(jìn)化等問(wèn)題(Estoup & Angers，1998)，許多瀕危物種的圈養(yǎng)種群管理都采用了微衛(wèi)星技術(shù)，并取得了很好的成效。如Omote等(2012)在毛腿漁鸮Buboblakistoni上開(kāi)發(fā)了8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，在120只個(gè)體上進(jìn)行了擴(kuò)增，進(jìn)行遺傳多樣性的分析，等位基因數(shù)為2～7，觀察雜合度和期望雜合度分別為0.052～0.742和0.067～0.769；微衛(wèi)星還可估測(cè)現(xiàn)階段的遷移率，具有區(qū)分隨機(jī)交配和相對(duì)高遷移率的能力，并能估計(jì)個(gè)體之間的相關(guān)性(Selkoe & Toonen，2006)；在大熊貓Ailuropodamelanoleuca(Zhangetal.，2003)、華南虎Pantheratigrisamoyensis(Zhangetal.，2012)、丹頂鶴Grusjaponensis(Zhangetal.，2015)等瀕危動(dòng)物上也得到了很好的應(yīng)用。

此前，我們已經(jīng)采用磁珠富集法開(kāi)發(fā)了26個(gè)小熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)(Liangetal.，2007；Zhangetal.，2008)。遺憾的是，由于國(guó)內(nèi)圈養(yǎng)小熊貓種群普遍缺乏科學(xué)、詳細(xì)的記錄，存在著資料有誤、父/母未知、父母均未知、疑似父母范圍廣等多種問(wèn)題，在圈養(yǎng)種群遺傳管理的實(shí)際工作中，現(xiàn)有位點(diǎn)還不能在復(fù)雜情況下很好地完成親緣關(guān)系推定，因此，我們決定開(kāi)發(fā)新的微衛(wèi)星位點(diǎn)，以期提高小熊貓親子鑒定的準(zhǔn)確率。

1 研究方法

在成都大熊貓繁育研究基地采集1只2歲雄性小熊貓的血液樣品(本研究所用小熊貓樣品均采自成都大熊貓繁育研究基地)，用血液和組織核酸純化試劑盒(Qiagen，德國(guó))提取DNA后，將總DNA送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，通過(guò)Roche 454測(cè)序平臺(tái)的FLX測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用Newbler 2.6(Marguliesetal.，2005)進(jìn)行短片段文庫(kù)的拼接，組裝后的數(shù)據(jù)用misa.pl(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)分析。

使用PRIMER3(Rozen & Skaletsky，2000)在篩選出的微衛(wèi)星序列中隨機(jī)選擇了467條設(shè)計(jì)引物。考慮到滑鏈風(fēng)險(xiǎn)(Edwardsetal.，1991；Taberletetal.，1996，2008)會(huì)對(duì)微衛(wèi)星數(shù)據(jù)的讀取造成影響，本研究所選取的微衛(wèi)星位點(diǎn)均為3～6堿基重復(fù)序列。用這467對(duì)引物對(duì)5只小熊貓個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700，美國(guó))。反應(yīng)體系為：模板DNA 50 ng，20 μmol·L-1上、下游引物各0.2 μL，25 mmol·L-1MgCl20.6～1.4 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 0.2 μL，Taq酶0.2 U，加水補(bǔ)足至10 μL體系。擴(kuò)增體系如下：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，退火15 s(退火溫度詳見(jiàn)表1)，72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)；89 ℃ 15 s，退火15 s(退火溫度詳見(jiàn)表1)，72 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；最后4 ℃保存。將所有初始引物的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，選取PCR產(chǎn)物的條帶位于設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度范圍內(nèi)，且條帶清晰、明亮的引物加上熒光標(biāo)記(6-FAM或HEX)，接下來(lái)使用8只小熊貓的DNA樣本，對(duì)以上熒光引物進(jìn)一步篩選。將最后篩選出的引物應(yīng)用到42只小熊貓個(gè)體上進(jìn)行基因分型。為了確保分型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，所有PCR均進(jìn)行3次重復(fù)，基因分型在成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

根據(jù)所獲得的分型數(shù)據(jù)，使用Cervus 3.0(Marshalletal.，2010)進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性分析，計(jì)算等位基因雜合度和多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)。另外，使用Genepop 3.4(Raymond & Rousset，2003)進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡、連鎖不平衡以及無(wú)效等位基因頻率的檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

測(cè)序共獲得了2.9 Gb的數(shù)據(jù)量，平均讀長(zhǎng)為567.9 bp。N50長(zhǎng)度為719 bp，平均GC含量為40.41%，平均測(cè)序深度1×。Contigs數(shù)目為1 830個(gè)，拼接得到了近36萬(wàn)條序列。經(jīng)分析得到微衛(wèi)星序列近8萬(wàn)條，其中，單堿基重復(fù)序列59.2%，二堿基重復(fù)序列31.9%，三堿基重復(fù)序列4.4%，四堿基重復(fù)序列3.8%，五堿基重復(fù)序列和六堿基重復(fù)序列分別為0.6%和0.08%。

在測(cè)序得到的微衛(wèi)星序列中隨機(jī)選擇了一部分，利用Primer 3.0設(shè)計(jì)了467對(duì)引物。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，排除多位點(diǎn)擴(kuò)增及擴(kuò)增失敗的引物，最后篩選出了25個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(表1)，并提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)：KX609964～609988)。對(duì)成都大熊貓繁育研究基地的42只小熊貓進(jìn)行了基因分型，共獲得了128個(gè)等位基因，等位基因數(shù)目3(CRP18、CRP391、CRP442)到10(CRP43)，每個(gè)位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)是5.12；PIC=0.128～0.843，平均值為0.596 2；而觀察雜合度和期望雜合度分別為0.143～0.929和0.136～0.869(表1)。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，所有位點(diǎn)均未偏離哈迪-溫伯格平衡(表1)、無(wú)顯著的連鎖不平衡、無(wú)無(wú)效等位基因。

用這25對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)10份以上陳舊樣品(4 ℃放置2年以上的小熊貓血液DNA)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。分型結(jié)果與新鮮血液DNA結(jié)果完全一致，說(shuō)明這些微衛(wèi)星引物可應(yīng)用于較低質(zhì)量的DNA樣品。

3 討論

PIC是衡量分子標(biāo)記信息量最常用的指標(biāo)(Nagyetal.，2012)。根據(jù)Botstein等(1980)的標(biāo)準(zhǔn)，本研究中新開(kāi)發(fā)的25個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，其中有19個(gè)位點(diǎn)具有高度多態(tài)性。所有位點(diǎn)未偏離哈迪-溫伯格平衡和連鎖不平衡，提示它們適合用于小熊貓種群的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析。今后我們將以這25個(gè)位點(diǎn)為主，加上此前開(kāi)發(fā)的優(yōu)質(zhì)位點(diǎn)，進(jìn)一步擴(kuò)大樣品數(shù)量，建立成都大熊貓繁育研究基地小熊貓種群乃至國(guó)內(nèi)種群的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫(kù)。

中國(guó)的小熊貓圈養(yǎng)種群管理并不完善，存在的歷史問(wèn)題比較多，例如譜系比較混亂、繁殖配對(duì)隨意等。此外，考慮到國(guó)內(nèi)圈養(yǎng)小熊貓機(jī)構(gòu)間存在一定的交換，在全國(guó)范圍內(nèi)開(kāi)展一次親緣關(guān)系普查是必要的。本研究中報(bào)道的微衛(wèi)星位點(diǎn)可以對(duì)圈養(yǎng)種群個(gè)體之間的親緣關(guān)系進(jìn)行分析和驗(yàn)證，建立科學(xué)的譜系關(guān)系，從而避免近親配對(duì)等不科學(xué)的管理方式，也對(duì)小熊貓將來(lái)的就地保護(hù)和遷地保護(hù)具有重要意義。