微酸性電解水對灰葡萄孢菌殺菌效果與作用機制研究

南松劍 黃曉伶 王 朔 葉章穎 朱松明

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院， 杭州 310058； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院， 煙臺 264670)

0 引言

微酸性電解水(Slightly acidic electrolyzed water，SAEW)又稱微酸性氧化電位水，指在直流電場的作用下，采用無隔膜電解方式電解稀鹽酸溶液或稀鹽酸和稀鹽混合溶液而得到的具有特殊理化及殺菌特性的水溶液，其pH 值一般在5.0～7.0之間，接近中性，擁有較低氧化還原電位(Oxidation-reduction potential，ORP)(<800 mV)和一定的有效氯質(zhì)量濃度[1-3]。微酸性電解水與強酸性電解水(pH值小于3.0，ORP值大于1 100 mV)具有近似的殺菌效果，但相較于強酸性電解水，其制備方便，對金屬及塑料材料的腐蝕性更低[4-5]。如用于設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，微酸性電解水對設(shè)施設(shè)備具有更小的損害。微酸性電解水已在醫(yī)療、食品加工及畜禽養(yǎng)殖等領(lǐng)域有了初步的應(yīng)用研究[6-10]。

以往利用電解水對真菌及其孢子的殺菌研究多集中在強酸性電解水及中性電解水。如BUCK等[11]研究發(fā)現(xiàn)，使用強酸性電解水處理灰葡萄孢菌及褐腐病菌等，需要30 s或更少的處理時間可殺死其孢子，而厚壁、有色素的真菌(如彎孢菌、蠕蟲孢子菌)需要2 min或更長的時間才能顯著降低發(fā)芽率。ABBASI等[12]使用強酸性電解水處理了泡囊菌(細菌斑點病原體)、疥瘡鏈霉菌(馬鈴薯疥瘡病原體)和番茄黃萎病鐮刀菌(根腐病原體)等植物病原菌繁殖體，2 min可顯著減少4～8個對數(shù)單位。KE等[13]研究認為，相比強酸性電解水，中性電解水具有更強的對黃曲霉菌的殺菌效果，OH自由基是其中重要的殺菌因子，是破壞黃曲霉分生孢子細胞結(jié)構(gòu)的重要殺菌因子，它也破壞了細胞正常功能，導(dǎo)致K+和Mg2+泄漏。在相同的有效氯濃度水平下，中性電解水比強酸性電解水含有更多的OH自由基。HAMZAH等[14]使用有效氯質(zhì)量濃度分別為60、120 mg/L的中性電解水對細胞懸液中的蠟樣芽胞桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌進行了殺菌處理，5 min可分別達2.46～3.62 lgCFU/mL和2.11～3.03 lgCFU/mL的殺菌效果。目前，利用微酸性電解水對細菌的殺菌研究逐漸增多[15]，但將其用于病原真菌的殺菌效果及機制研究還較少，由此限制了這一新型殺菌制劑在真菌病害防治方面的應(yīng)用潛力。

灰葡萄孢菌是可以引起多種已知植物灰霉病的壞死營養(yǎng)型病原真菌，具有廣寄主性和強致病性，其在空氣中廣泛分布，且可污染食物和飼料等[16-18]。本文以灰葡萄孢菌為模型菌，研究微酸性電解水對其純培養(yǎng)的殺菌效力，在此基礎(chǔ)上，通過電鏡觀察微酸性電解水對灰葡萄孢的微觀結(jié)構(gòu)破壞情況，以期對微酸性電解水的殺真菌機制進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 微酸性電解水對灰葡萄孢菌的殺菌效力

使用上海富強旺衛(wèi)生用品有限公司的HD-240L型連續(xù)式微酸性電解水機制備微酸性電解水，理化特性見表1。分別設(shè)置：相同殺菌時間(5 min)、不同有效氯質(zhì)量濃度(10、20、30、40 mg/L)的微酸性電解水，進行殺菌處理；相同有效氯質(zhì)量濃度(10、30 mg/L)、不同殺菌時間(0、1、5、10、15 min)的兩組處理，每組處理3次重復(fù)，以無菌生理鹽水處理為對照，進行殺菌實驗，方法如下。

表1 微酸性電解水理化指標(biāo)Tab.1 Physicochemical properties of slightly acidic electrolyzed water

將制備好的灰葡萄孢菌孢子懸液(孢子菌體濃度在7.00～7.70 lgCFU/mL之間)，在小型漩渦振蕩儀上充分振蕩分散，分別吸取1 mL懸浮液加入盛有8 mL微酸性電解水的試管中，進行殺菌處理，達到預(yù)設(shè)時間后，加入1 mL無菌中和劑(0.05%Na2S2O3)終止殺菌[19]，振蕩混合均勻后，用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，每稀釋度吸取0.1 mL均勻涂抹于PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基上，26℃恒溫培養(yǎng)72 h待菌落充分生長后，計平板菌落數(shù)，然后計算處理前后懸液中菌體濃度(lgCFU/mL)。對照組則將1 mL孢子懸液吸入到盛有9 mL生理鹽水的試管中，然后按照實驗組的操作方法進行實驗。

1.2 灰葡萄孢菌落直徑及外觀形態(tài)的影響觀察

在培養(yǎng)基上均勻接種灰葡萄孢菌孢子懸液，制備方法及接種培養(yǎng)方法同1.1節(jié)所述，26℃恒溫培養(yǎng)2 d，然后每隔24 h噴灑一次不同濃度微酸性電解水(理化指標(biāo)見表1中編號1和3)，以噴灑無菌生理鹽水為對照，采用十字交叉法每天測量菌落直徑，同時觀察菌落形態(tài)并記錄。

1.3 微觀結(jié)構(gòu)觀察分析

1.3.1掃描電鏡觀察分析

取灰葡萄孢菌落生長均勻的PDA純培養(yǎng)，無菌操作切取5塊正方形(0.5 cm×0.5 cm)帶培養(yǎng)基菌塊，轉(zhuǎn)入5個無菌培養(yǎng)皿中，分別取有效氯質(zhì)量濃度為10 mg/L和30 mg/L微酸性電解水(表1)，分別對菌塊進行原位殺菌處理5 min和10 min，留一組作為對照組，之后加入中和劑終止殺菌，倒出液體，留菌塊備用。

將處理后菌塊放入直徑1.5 cm的無菌試劑盒，加入3%的戊二醛進行固定，為防止孢子漂浮，在真空泵中真空吸附10～20 min，后固定2 h；將固定好的菌落塊用丙酮進行逐級脫水，采用環(huán)氧樹脂-618包埋[10]，制片并用EVO LS 15型掃描電鏡進行觀察分析。

1.3.2透射電鏡觀察分析

設(shè)置微酸性電解水有效氯質(zhì)量濃度分別為10 mg/L和30 mg/L(表1)，進行懸液殺菌處理，方法見1.1節(jié)所述，處理時間分別為5 min和10 min，達到規(guī)定時間后加入中和劑終止殺菌備用。

取處理后菌懸液，用磷酸鹽緩沖液(0.03 mol/L，pH值7.2)在相同條件下離心洗滌3次，向沉淀物中加3%的戊二醛固定1 h，使用丙酮溶液逐級脫水，后用環(huán)氧樹脂進行包埋，制作超薄切片，然后用醋酸鈾和枸椽酸鉛進行染色[20]，在JEM-1400型透射電鏡下觀察并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微酸性電解水對灰葡萄孢菌的殺菌效力

由表2可知，當(dāng)固定殺菌時間為5 min時，隨著有效氯質(zhì)量濃度的增加，對灰葡萄孢菌的殺菌率逐漸增加，有效氯質(zhì)量濃度達到40 mg/L時，殺菌對數(shù)值3.65 lgCFU/mL，殺菌率達到99.97%。

由表3可知，當(dāng)固定有效氯質(zhì)量濃度，隨著殺菌時間的延長，殺菌率呈顯著性增強，殺菌時間為1 min時，殺菌率均較低，有效氯質(zhì)量濃度為30 mg/L，殺菌率僅為54.29%，但殺菌時間為1 min和5 min時，有效氯質(zhì)量濃度為30 mg/L的微酸性電解水殺菌率均遠高于有效氯質(zhì)量濃度為10 mg/L的微酸性電解水，差異顯著，結(jié)果表明，殺菌時間較短時，隨有效氯質(zhì)量濃度增加，可顯著增強殺菌率，但接觸時間較短時，殺菌率較低，在有效氯質(zhì)量濃度30 mg/L、殺菌5 min時，未達到99.99%的殺菌率。

表2 相同時間不同電解水濃度對灰葡萄孢菌的殺菌效力Tab.2 Microbicidal potential of slightly acidic electrolyzed water at different concentrations and the same time

表3 不同時間相同電解水濃度對灰葡萄孢菌的殺菌效力Tab.3 Microbicidal potential of slightly acidic electrolyzed water at the same concentrations and different times

比較表2和表3可以看出，有效氯質(zhì)量濃度為10 mg/L時，處理時間為10 min時的殺菌率高于有效氯質(zhì)量濃度為30 mg/L時，處理時間為5 min時，結(jié)果表明，充分的殺菌時間是保證殺菌效力的重要因素。有效氯質(zhì)量濃度為30 mg/L，殺菌時間為10 min時，以及有效氯質(zhì)量濃度10 mg/L，殺菌時間15 min，對灰葡萄孢的殺菌率均達到99.99%。

2.2 灰葡萄孢菌落直徑及外觀形態(tài)

由菌落直徑測定數(shù)據(jù)可以看出(表4)，未經(jīng)微酸性電解水處理的灰葡萄孢菌落直徑，逐日增長明顯，經(jīng)微酸性電解水處理2 d后，菌落直徑與未處理組對比出現(xiàn)顯著差異，有效氯質(zhì)量濃度越高，對菌落生長抑制越強，有效氯質(zhì)量濃度為30 mg/L的微酸性電解水，經(jīng)過3 d的處理菌落停止生長，有效氯質(zhì)量濃度為10 mg/L時，處理3 d后，雖還有生長但生長緩慢。結(jié)果表明，微酸性電解水可以在體外有效抑制灰葡萄孢菌落的生長。推測認為微酸性電解水可以使菌絲及新生孢子死亡，導(dǎo)致灰葡萄孢無法產(chǎn)生新的孢子，抑制其繁殖，進一步觀察發(fā)現(xiàn)菌絲逐漸變暗黃，枯萎，直至死亡。

表4 灰葡萄孢菌PDA純培養(yǎng)經(jīng)微酸性電解水處理后菌落直徑Tab.4 Colony diameter after being treated by slightly acidic electrolyzed water cm

2.3 灰葡萄孢菌經(jīng)微酸性電解水處理后的微觀結(jié)構(gòu)觀察及分析

由微酸性電解水處理前后灰葡萄孢原位掃描電鏡結(jié)果(圖1，放大倍數(shù)1 000)，可以看出經(jīng)電解水殺菌處理前后灰葡萄孢菌絲和孢子形態(tài)的變化。未經(jīng)處理的灰葡萄孢菌，在電鏡下結(jié)構(gòu)清晰，菌絲表面基本光滑，孢子形態(tài)未出現(xiàn)明顯皺縮(圖1a)。經(jīng)微酸性電解水原位殺菌處理后，菌絲伸展不規(guī)則，有不同程度的折疊扭曲現(xiàn)象，孢子開始皺縮(圖1b～1e，2b～2e)，隨電解水有效氯質(zhì)量濃度和處理時間增加，孢子皺縮明顯，大量孢子從菌絲脫落。

圖1 微酸性電解水對灰葡萄孢處理前后的掃描電鏡圖Fig.1 SEM photos of Botrytis cinerea before and after slightly acidic electrolyzed water treatment

圖2 微酸性電解水對灰葡萄孢處理前后的透射電鏡圖Fig.2 TEM photos of Botrytis cinerea before and after slightly acidic electrolyzed water treatment

灰葡萄孢菌依靠菌絲釋放孢子囊，進而吐出孢子進行繁殖，推測微酸性電解水可同時通過破壞菌絲以及孢子的結(jié)構(gòu)，從而抑制孢子的繁殖和生長，起到殺菌的作用。

經(jīng)微酸性電解水處理前后灰葡萄孢透射電鏡結(jié)果(圖2)觀察可知，未經(jīng)電解水處理的孢子中線粒體(箭頭1)較為明顯，形狀規(guī)則，且細胞質(zhì)分布均勻致密(圖2a)。經(jīng)電解水處理后，灰葡萄孢菌孢子中線粒體明顯有分裂的現(xiàn)象(箭頭3)，且細胞質(zhì)(箭頭2)變得疏松(圖2b)；隨電解水濃度增加，還可見孢子質(zhì)壁分離明顯，細胞膜收縮，且邊緣變得不規(guī)則，細胞質(zhì)中的線粒體等出現(xiàn)不同程度的溶解(箭頭4)。隨電解水有效氯質(zhì)量濃度增加和處理時間延長，孢子細胞內(nèi)容物出現(xiàn)不同程度的溶解，細胞膜嚴重皺縮，細胞質(zhì)中各種細胞器分別不夠明顯(圖2c～2e)。

推測微酸性電解水首先通過細胞壁進入孢子內(nèi)，導(dǎo)致質(zhì)壁分離，與膜上物質(zhì)反應(yīng)，可改變細胞膜通透性，導(dǎo)致膜內(nèi)容物溢出，細胞膜收縮而變得不規(guī)則，及部分細胞器溶解，最終導(dǎo)致灰葡萄孢菌孢子的死亡。

3 結(jié)束語

微酸性電解水對灰葡萄孢純培養(yǎng)具有良好的殺菌作用，在有效氯質(zhì)量濃度為10 mg/L、殺菌處理時間為15 min，以及在有效氯質(zhì)量濃度為30 mg/L、殺菌時間為10 min時，對其孢子懸液均達到99.99%的殺菌效果，相較于單純提高濃度，延長處理時間可獲得更強的殺菌效力。微酸性電解水對灰葡萄孢具有原位抑菌作用，噴灑微酸性電解水可抑制灰葡萄孢菌落的生長。對微酸性電解水處理前后灰葡萄孢微觀結(jié)構(gòu)進行觀察，發(fā)現(xiàn)微酸性電解水進入灰葡萄孢孢子細胞壁后，導(dǎo)致細胞質(zhì)壁分離，細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，細胞質(zhì)外溢，部分細胞器溶解，細胞發(fā)生皺縮，這可能是細菌孢子失去活性的原因。