一把毫毛一群小猴

陳冰

重磅新聞！

繼震驚世界的首批體細(xì)胞克隆猴“中中”“華華”誕生一年之后，上海科學(xué)家更進(jìn)一步，宣布培育出世界首批遺傳背景一致的非人靈長(zhǎng)類疾病動(dòng)物模型——生物節(jié)律紊亂體細(xì)胞克隆猴模型。

2019 年1 月24 日凌晨，兩篇系列研究論文在線發(fā)表于中國(guó)頂級(jí)綜合英文期刊《國(guó)家科學(xué)評(píng)論》。

1月24日，我國(guó)頂級(jí)綜合英文期刊《國(guó)家科學(xué)評(píng)論》在線發(fā)表了相關(guān)系列研究論文。這一科學(xué)成果突破了利用活體獼猴體細(xì)胞克隆的難關(guān)，開(kāi)啟了標(biāo)準(zhǔn)化創(chuàng)建疾病克隆猴模型的新時(shí)代，有助于縮短藥物研發(fā)周期，提高藥物研發(fā)成功率，將極大地促進(jìn)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)展。

在研究神經(jīng)科學(xué)和腦科學(xué)的人員只有美國(guó)的十分之一，而科研經(jīng)費(fèi)只有美國(guó)的二十分之一的前提下，我國(guó)的體細(xì)胞克隆猴技術(shù)再次走到世界的最前列。“孫悟空拔一把毫毛變一群小猴的夢(mèng)想，我們終于實(shí)現(xiàn)了！”中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所所長(zhǎng)蒲慕明院士表示，這次的克隆猴來(lái)自青年基因編輯猴的成熟體細(xì)胞，這使我國(guó)在建立非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中的領(lǐng)先優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步擴(kuò)大。

生物節(jié)奏紊亂引發(fā)眾多疾病

雄雞報(bào)曉，蜘蛛半夜結(jié)網(wǎng)，向日葵在清晨開(kāi)放……自然界所有生物的生命活動(dòng)都存在節(jié)律現(xiàn)象，與地球24小時(shí)的自轉(zhuǎn)周期保持同步對(duì)于生物維持健康的生理狀態(tài)至關(guān)重要。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的研究，人們發(fā)現(xiàn)，其實(shí)生物的節(jié)律與基因密切相關(guān)，2017年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)就被獎(jiǎng)勵(lì)給了三位研究節(jié)律相關(guān)基因的科學(xué)家。

特別是現(xiàn)代社會(huì)，巨大的工作生活壓力使人類的作息時(shí)間很難嚴(yán)格遵循于體內(nèi)的生物鐘。加班、輪班，頻繁地跨越時(shí)區(qū)，熬夜玩手機(jī)等等，越來(lái)越多的人面臨著生物鐘紊亂的困擾，晝夜節(jié)律紊亂與睡眠障礙、神經(jīng)退行性疾?。ㄈ绨柎暮ＤY）、精神疾?。ㄈ缫钟舭Y）、糖尿病、腫瘤，以及心血管疾病等密切相關(guān)。

然而，由于小鼠、果蠅等傳統(tǒng)動(dòng)物模型與人的晝夜活動(dòng)周期、腦結(jié)構(gòu)和代謝速率等存在顯著差異，極大制約了生物節(jié)律紊亂相關(guān)疾病機(jī)理和診治手段的研發(fā)。神經(jīng)科學(xué)研究所非人靈長(zhǎng)類研究平臺(tái)主任孫強(qiáng)指出，非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物曾在人類攻克傳染病等各種疾病中發(fā)揮重要的作用。并且非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物與人類最接近，是研究節(jié)律紊亂相關(guān)疾病機(jī)理和診治手段比較理想的動(dòng)物模型，因此建立非人靈長(zhǎng)類生物節(jié)律紊亂模型迫在眉睫。

通過(guò)研究，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物的大腦中有一個(gè)控制生物節(jié)律的“起搏器”，這個(gè)“起搏器”是通過(guò)一系列節(jié)律基因調(diào)控晝夜節(jié)律，這些核心節(jié)律基因之一便是BMAL1。在此背景下，中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類腦研究中心研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)兩年多的努力，首次利用CRISPR/Cas9方法，敲除了體外受精的猴胚胎中的生物節(jié)律核心基因BMAL1，產(chǎn)生了一批BMAL1缺失的獼猴，2016年中旬，五只BMAL1基因敲除的獼猴順利誕生。

那么這些猴子有沒(méi)有表現(xiàn)出周期紊亂的癥狀呢？

為此等到半年后小猴斷奶，研究人員就從多個(gè)方面開(kāi)始觀察敲除猴的生物節(jié)律。研究人員給猴子們佩戴了“運(yùn)動(dòng)手環(huán)”，可以隨時(shí)監(jiān)測(cè)到它們的晝夜活動(dòng)情況，發(fā)現(xiàn)敲除猴并未按照24小時(shí)的周期活動(dòng)，在夜間活動(dòng)明顯增多，這說(shuō)明敲除猴可能出現(xiàn)了失眠的問(wèn)題。于是研究人員通過(guò)手術(shù)，在猴子背部皮下埋入記錄腦電和肌電的植入子，分析其睡眠周期發(fā)現(xiàn)敲除猴的快速眼動(dòng)睡眠（REM，淺睡期）和慢波睡眠（NREM，熟睡期）明顯減少。

在另一方面，研究人員通過(guò)搜集連續(xù)兩天多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血液樣本，對(duì)那些受節(jié)律調(diào)節(jié)的神經(jīng)內(nèi)分泌激素水平進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)幫助進(jìn)入睡眠的褪黑素在敲除猴中分泌較少。同時(shí)研究人員還進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)敲除猴的大多數(shù)節(jié)律基因表達(dá)異常，還有很多與睡眠剝奪，抑郁癥以及衰老等相關(guān)的基因上調(diào)。

節(jié)律紊亂往往伴隨著神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，神經(jīng)退行性疾病患者往往會(huì)遭受各種各樣的睡眠問(wèn)題，包括失眠、睡眠中斷、日間過(guò)度嗜睡，繼而出現(xiàn)睡夢(mèng)中運(yùn)動(dòng)，白天與人交流出現(xiàn)障礙等等。但在之前，人們一直不太清楚這些究竟是睡眠紊亂的直接后果，還是長(zhǎng)期失眠或服藥的副作用。

從對(duì)這五只基因敲除猴的研究可以看到，猴子表現(xiàn)出怕人，避免與人對(duì)視等問(wèn)題，而這些癥狀是以前在小鼠身上很難探測(cè)到的。

此外，有很多研究表明節(jié)律紊亂或睡眠障礙還是一些精神疾病，如雙相情感障礙，抑郁癥等癥狀。但是之前我們很難認(rèn)定一只小鼠有抑郁或是雙相情感障礙之類的問(wèn)題，而這在靈長(zhǎng)類身上就很明顯了。研究人員在血液檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)與壓力應(yīng)激相關(guān)的皮質(zhì)醇在敲除猴的血液中一直處于高水平，這讓他們聯(lián)想到敲除猴在與人接觸時(shí)極度緊張的反應(yīng)。當(dāng)有人靠近敲除猴時(shí)，它會(huì)雙手抱住頭部，蜷縮在角落里，不敢活動(dòng)。如果將敲除猴放入一個(gè)新環(huán)境中，它也不能很快地適應(yīng)，不敢像正常猴那樣在環(huán)境中自由探索。

研究人員還給猴子們做了一個(gè)經(jīng)典的聽(tīng)覺(jué)刺激實(shí)驗(yàn)，在給出的一連串規(guī)律的聲音中隨機(jī)插入特殊的聲音，記錄猴子聽(tīng)到聲音時(shí)的腦電，發(fā)現(xiàn)敲除猴大腦在識(shí)別和反應(yīng)這些特殊事件的能力上不如正常猴，這與精神分裂患者的情況類似。

中科院神經(jīng)所研究員張洪鈞說(shuō)，基因敲除后，出生不到一年的A6猴的睡眠就出現(xiàn)了接近衰老的現(xiàn)象，已與人類老年期類似。一年后又出現(xiàn)了焦慮、抑郁、精神分裂等嚴(yán)重癥狀，同時(shí)通過(guò)血液檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了激素水平異常。也就是說(shuō)，有了遺傳背景一致的疾病模型猴，就能研究相關(guān)發(fā)病生理指標(biāo)，還可進(jìn)行藥物干預(yù)，這將大大推進(jìn)相關(guān)疾病的研究。

張洪鈞告訴記者，之所以如此大費(fèi)周章構(gòu)建基因敲除猴，最期望的就是在這些猴身上找到節(jié)律紊亂者的精神癥狀，這些才是非人靈長(zhǎng)類較之小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的真正優(yōu)勢(shì)?！癇MAL1敲除小鼠的睡眠相比正常對(duì)照則是增多的，這也進(jìn)一步說(shuō)明了非人靈長(zhǎng)類在腦疾病研究上的巨大優(yōu)勢(shì)。基因敲除猴為模擬人的節(jié)律紊亂相關(guān)疾病邁出了關(guān)鍵的第一步。

基因編輯克隆猴也得了精神病

通過(guò)敲除BMAL1基因獲得的第一代模型猴還不算完美的動(dòng)物模型，因?yàn)檫@些基因敲除猴屬于“嵌合體”，體內(nèi)不同細(xì)胞的基因型有差別，所表現(xiàn)出的癥狀嚴(yán)重程度不一致，不能作為理想的動(dòng)物模型。那么，能否利用“中中”“華華”這樣的克隆猴技術(shù)，構(gòu)建出疾病模型猴呢？

“可以說(shuō)是馬不停蹄，我們很快投入到了新的任務(wù)中，在國(guó)際上首次獲得了5只遺傳背景一致的生物節(jié)律紊亂克隆猴?！敝锌圃荷窠?jīng)所孫強(qiáng)研究員介紹，最大的一只出生于2018年7月12日，已脫離人工哺乳，一緊張就會(huì)抱頭，見(jiàn)了保育員就心跳加速，白天晚上無(wú)規(guī)律地睡眠——在神經(jīng)所非人靈長(zhǎng)類研究中心的孵育箱里，這只編號(hào)B1的食蟹猴斷奶之后表現(xiàn)出了與本體基因編輯猴A6明顯相同的生物節(jié)律紊亂癥狀。

接下來(lái)將研制系列疾病模型猴，包括抑郁癥、帕金森癥和阿爾茨海默癥等腦疾病，這些腦疾病模型克隆猴，未來(lái)將有助于解析腦重大疾病的致病機(jī)理、確立預(yù)警和早期診斷指標(biāo)、進(jìn)行干預(yù)和治療等。

孫強(qiáng)研究員指出，國(guó)際上通行的驗(yàn)證克隆動(dòng)物的金標(biāo)準(zhǔn)是比對(duì)細(xì)胞核和線粒體基因。檢測(cè)表明，這5只基因編輯克隆猴的細(xì)胞核基因型與核供體細(xì)胞完全一致，而線粒體基因型則與卵供體猴一模一樣，同時(shí)它們的任何基因與生出它們的代孕媽媽徹底無(wú)關(guān)，非常符合克隆動(dòng)物的鑒定金標(biāo)準(zhǔn)。

中科院神經(jīng)所劉真研究員介紹，此次克隆有兩個(gè)技術(shù)突破。第一，不同于“中中”“華華”從流產(chǎn)母猴的胚胎體細(xì)胞克隆而來(lái)，這次選擇了1只一歲半、睡眠紊亂最明顯的公猴來(lái)提供體細(xì)胞，被國(guó)際同行評(píng)價(jià)為“首次證實(shí)通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)可以克隆成年基因修飾猴”。盡管克隆技術(shù)路線是一致的，但在效率上略高于“中中”“華華”，這將在很大程度上打消人們對(duì)于克隆技術(shù)效率的擔(dān)憂。第二，首次利用基因編輯猴的體細(xì)胞得到克隆后代?！爸兄小薄叭A華”都是野生型猴，從疾病研究的角度來(lái)說(shuō)，不如基因編輯猴的克隆后代，這也回答了“攜帶有特定基因編輯的體細(xì)胞是否可以用來(lái)克隆”的疑問(wèn)。

“中中”、“華華”與此次研究所用的克隆猴流程示意圖?？茖W(xué)家會(huì)先去除猴卵細(xì)胞的細(xì)胞核，然后在其中放入另一只猴的體細(xì)胞核，等待兩者充分融合后，最后將這個(gè)核移植過(guò)的卵移植到代孕母猴體內(nèi)等待克隆猴出生。

可以說(shuō)，本次研究意味著克隆基因編輯猴技術(shù)由此從理論層面邁向了實(shí)踐層面，鑒于目前克隆技術(shù)是制造基因編輯猴的成本最低、耗時(shí)最少的手段，而作為全球暫時(shí)唯一掌握克隆猴技術(shù)的神經(jīng)所，有望在未來(lái)的神經(jīng)科學(xué)研究中搶先一步。

藥物研發(fā)周期縮短

“腦疾病的社會(huì)負(fù)擔(dān)越來(lái)越大，平均每個(gè)腦疾病藥物需耗費(fèi)數(shù)十億美元和10年以上時(shí)間，失敗率大于90%。有了疾病猴模型，有望縮短藥物研發(fā)周期，降低研發(fā)成本。”中科院神經(jīng)所所長(zhǎng)蒲慕明院士說(shuō)。

人類很多與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，如阿爾茨海默癥、自閉癥、心腦血管疾病等，很難通過(guò)小鼠來(lái)模擬。“沒(méi)有猴子作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，神經(jīng)科學(xué)很難有實(shí)質(zhì)性推進(jìn)?！逼涯矫髡f(shuō)，這就是神經(jīng)所畢十年之功，全力攻克克隆猴及疾病模型猴這一難關(guān)的原因。

一個(gè)藥物在臨床前，需要在動(dòng)物身上檢驗(yàn)安全性、代謝情況和藥效評(píng)估。通過(guò)近親繁殖20代產(chǎn)生的小鼠，雖然沒(méi)有遺傳背景干擾，但由于和人的差異太大，許多神經(jīng)類、精神類藥物，即使90%在小鼠身上有效果，但到了臨床還是無(wú)效或有副作用。國(guó)際上許多知名藥企，每年用約10萬(wàn)只獼猴來(lái)做藥物安全性和代謝檢測(cè)，但由于沒(méi)有合適的非人靈長(zhǎng)類疾病模型，很難開(kāi)展藥效檢測(cè)。“獼猴5到6年才能有一代，無(wú)法通過(guò)近親繁殖手段得到遺傳背景一致的實(shí)驗(yàn)猴，最好的辦法就是克隆?！?/p>

“現(xiàn)在只是一個(gè)起點(diǎn)?！逼涯矫鹘榻B，接下來(lái)將研制系列疾病模型猴，包括抑郁癥、帕金森癥和阿爾茨海默癥等腦疾病，以及免疫缺陷、代謝紊亂、腫瘤等疾病。這些腦疾病模型克隆猴，未來(lái)將有助于解析腦重大疾病的致病機(jī)理、確立預(yù)警和早期診斷指標(biāo)、進(jìn)行干預(yù)和治療等?！耙荒昵?，我認(rèn)為國(guó)際同行追趕上我們的時(shí)間是一年，但這次論文發(fā)表后，我們?cè)趪?guó)際上的領(lǐng)先優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步擴(kuò)大?！逼涯矫魍嘎?，目前美國(guó)、澳大利亞、以色列和歐洲一些國(guó)家都有科學(xué)家團(tuán)隊(duì)向神經(jīng)所提出合作意向，很快將有多支國(guó)際科研團(tuán)隊(duì)全職入駐松江區(qū)，利用包括疾病克隆猴在內(nèi)的非人靈長(zhǎng)類模型開(kāi)展前沿研究，這將為上海集聚起一批國(guó)際頂尖科學(xué)家。“建立基于疾病模型猴的非人靈長(zhǎng)類平臺(tái)，將成為中國(guó)腦計(jì)劃的一大亮點(diǎn)?！?/p>

1月23日，中科院神經(jīng)所和中科院上海藥物所簽訂了戰(zhàn)略合作框架協(xié)議，后者有20多種藥物將進(jìn)入臨床，雙方將共建非人靈長(zhǎng)類藥物篩選模型。目前，已有多家制藥企業(yè)對(duì)疾病克隆猴表示了濃厚興趣。未來(lái)，G60腦智科創(chuàng)基地將建立相關(guān)產(chǎn)業(yè)平臺(tái)。