枯草芽孢桿菌主要作用機制與應(yīng)用研究進展

李怡潔，楊佐忠

(1. 西南大學植物保護學院，重慶 400715; 2. 四川省退耕還林還草中心，成都 610081)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)因其具有綠色無污染、無毒無害、可替代抗生素等眾多優(yōu)異的生物學特性被廣大學者及其研究人員研究，同時也作為一種最早的益生菌類群出現(xiàn)在研究人員的視野里?？莶菅挎邨U菌隸屬于芽孢桿菌屬的單細胞原核生物，無莢膜，周生鞭毛，可以運動，一般存在于菌體中央或近似中央位置，芽孢生長成型后對菌體體積不產(chǎn)生影響，不會造成菌體膨大。其分布廣泛、繁殖迅速、并能自生生成抗逆性孢子，成型的菌落多為淡黃色或黃白色，表面多為粗糙不光滑且不透明?？莶菅挎邨U菌是中國農(nóng)業(yè)部門批準的應(yīng)用廣泛的益生菌，它是一種可厭氧進行生長繁殖的革蘭氏陽性短桿菌[1]。通過對枯草芽孢桿菌的主要作用機制與應(yīng)用現(xiàn)狀進行分析并做出展望，可為后期如何將枯草芽孢桿菌運用到生產(chǎn)實際中提供理論來源及思路，并為推進更加穩(wěn)定、可持續(xù)的生物、農(nóng)業(yè)生態(tài)發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。

1 枯草芽孢桿菌作用機制

1.1 維持腸道微生態(tài)平衡

枯草芽孢桿菌以內(nèi)生孢子形態(tài)進入動物的消化道，在進入消化道后隨即到達動物腸道內(nèi)。由于枯草芽孢桿菌本身屬于好氧菌群，在進入到動物腸道后，內(nèi)生孢子由休眠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S態(tài)的過程中會消耗大量游離態(tài)氧氣，進而創(chuàng)造出一個有利于有益厭氧菌生長而不利于好氧菌生長繁殖的低氧微環(huán)境[2],與此同時，內(nèi)生孢子還產(chǎn)生了對致病菌有明顯拮抗作用的多種抗生類物質(zhì)[3]，進而維持腸道微生態(tài)平衡。Guo等[4]通過以不同劑量的枯草芽孢桿菌去飼喂蛋雞，實驗證明乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌菌群顯著增加，而好氧菌大腸桿菌數(shù)量顯著減少；陳兵等[5]通過研究口服了枯草芽孢桿菌后的大白鼠1周后糞便中厭氧菌和好氧菌落數(shù)量變化，結(jié)果顯示為腸道厭氧菌菌群數(shù)量增多，好氧菌菌群數(shù)量則明顯減少。

1.2 提升機體免疫水平

劉學劍[6]提出，枯草芽孢桿菌具有一定免疫調(diào)節(jié)活性，改善免疫功能，增加T、B淋巴細胞的數(shù)量，增加抗病能力。張愛武等[7]認為這是因為芽孢桿菌改善了動物體免疫器官的發(fā)育。枯草芽孢桿菌還可以通過自身產(chǎn)生的胞外抑菌物質(zhì)與病原菌爭奪附著位點，進而減少細胞免受病原菌的侵害。Inooka等[8]通過使用107CFU·g-1劑量的枯草芽孢桿菌飼喂雛雞，通過實驗結(jié)果表明雞脾臟中的T、B淋巴細胞數(shù)量顯著增加；Ducle等[9]通過將枯草芽孢桿菌的表面抗原加入到小鼠體內(nèi)，實驗結(jié)果表明小鼠的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫球蛋白IgG，同時使巨噬細胞中促炎細胞因子IL-6數(shù)量降低。

1.3 誘導抗性與促生作用

土壤中存在一類定殖于植物根際的有益微生物，我們將其稱為植物根際促生菌(PGPR)，它可以在減少植物病害發(fā)生的同時促進植物的生長[10]。B.subtilis是植物根際促生細菌(PGPR)的主要菌類之一，可產(chǎn)生類似植物生長激素、細胞分裂素等代謝物質(zhì)，促進植物快速發(fā)育，增強植株抗性從而提高抗病力，有效抵抗病原物的侵害。Ryu 等[11]從植物根圍分離出一株枯草芽孢桿菌 HK-CSM-1，經(jīng)過實驗證明 HK-CSM-1對由Colletotrichumpanacicola誘發(fā)的人參炭疽病有很多的拮抗效果，同時對人參接種枯草芽孢桿菌之后，其體內(nèi)的Colletotrichumpanacicola的數(shù)量有明顯降低 ，這種現(xiàn)象與化學殺真菌劑albesilate 殺菌效果相似。B.subtilisTR21菌株能夠拮抗眾多病原真菌，在溫室和大田栽培種植條件下，都能誘導香蕉產(chǎn)生抗性，較好的預防香蕉枯萎病發(fā)生。湯浩等[12～14]等以巴西蕉為材料，運用半定量RT-PCR方法，以香蕉25 S信使基因為內(nèi)標，用TR21菌液灌根接種處理后，檢測香蕉根系PAL、POD、PR-3和PR-1四種與抗病性相關(guān)的基因表達情況。實驗結(jié)果表明，經(jīng)過接種處理后，這四種抗病基因的平均表達量都增加了，但PAL和POD基因的表達增幅明顯高于PR-3和PR-1基因，并且PAL和POD抗病基因在接種培養(yǎng)了12 h之后的表達量達到最高。從而證明B.subtilisTR21菌株是通過系統(tǒng)誘導香蕉抗病性來預防枯萎病的。Walia 等[15]從番茄根際土壤中分離了一株具有促生性能的菌株 N11，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌菌株 CKT1，該菌株顯示出植物生長促進活性，即溶磷，產(chǎn)鐵載體、吲哚乙酸和氫氰酸。盆栽試驗表明，該菌株可導致株高、根長和番茄幼苗的枝條和根的干物質(zhì)產(chǎn)量顯著增加。黃媛媛[16]以枯草芽孢桿菌 SL-44對象，研究發(fā)現(xiàn)在辣椒植物生長發(fā)育中，枯草芽孢桿菌 SL-44對立枯絲核菌具有體外抑制作用，此外，SL-44 具有產(chǎn)嗜鐵素、固氮和分泌 IAA 的能力，IAA產(chǎn)量最高達到 7.5 μg·mL-1。SL-44 具有定殖在植物根圍的能力，并能夠與植物發(fā)生互作。因此，SL-44對辣椒植物具有生防和促生的作用，并可作為生物防治土傳病害的潛在制劑用于促進作物的增產(chǎn)。

2 枯草芽孢桿菌應(yīng)用情況

2.1 枯草芽孢桿菌在生物保鮮中的應(yīng)用

2.1.1 果品保鮮中的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌具有抗逆能力強、易于繁殖，代謝產(chǎn)物豐富，抗菌譜廣，對人畜高度安全等特點，加之收獲后果品貯藏條件的可控性，用于果品生物防腐(病原性腐爛)具有特殊優(yōu)勢。1986年，Charles L.Wilson 、P.Lawrence Pusey和李富新[17]等 用B.subtilisB-3菌株制劑處理桃、李和杏等多種成熟后的新鮮水果，有效地控制了由褐腐病致病菌Moniliniafructicola引起的腐爛病，其效果與市面上的優(yōu)良殺菌劑效果相似。 Vapinder 和Deverall 兩位學者[18]用從柑桔果實上分離到的枯草芽孢桿菌抗生體制劑有效地控制了由鏈格孢霉、地霉屬、指狀青霉等致病菌引起的柑桔果腐病，防效達60%以上。楊佐忠[19]用B. subtilis PRS5菌劑防治收獲后柑橘果實腐爛病，獲得與相關(guān)化學保鮮劑(殺菌劑)相當之效果。劉浩強，李鴻筠等[20]研究了生物源保鮮劑枯草芽孢桿菌對錦橙采后主要病菌的毒性及對錦橙果實的貯藏保鮮效果。結(jié)果表明:枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液對青霉病、綠霉病、炭疽病等總病害均有較好的防治效果,而對果實品質(zhì)的影響和清水對照比較沒有差異性,并且對外觀色澤和口感沒有負面影響。說明枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2 000倍液對錦橙儲藏保鮮效果較好。

2.1.2 鮮切花保鮮中的應(yīng)用

以枯草芽孢桿菌制劑為材料，王澄澈等[21]對月季、高勇[22]等對波斯菊，朱天輝等[23]對除蟲菊等鮮切花卉進行生物保鮮試驗，均可不同程度延長鮮切花的觀賞期。25℃條件下，0.5%～1.0%的B.subtilisPRS5發(fā)酵制劑可有效延長月季和波斯菊鮮切花的保鮮期，濃度高于1.0%時會對鮮切花產(chǎn)生明顯毒害作用。低濃度(<1%的發(fā)酵濃度)的B.subtilisPRS5制劑可明顯延長除蟲菊的花期(10 d)。

2.2 枯草芽孢桿菌在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌菌體生長過程中，一方面通過產(chǎn)生的枯草菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，在動物消化道代謝過程中可合成多種營養(yǎng)素如氨基酸、多肽、促生長因子和多種維生素等，這些養(yǎng)分可直接被機體利用。 在腸道中能夠產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸，降低腸道pH值，抑制病原菌生長，為有益菌的增殖創(chuàng)造有利條件，間接抑制其它致病菌生長[24～26]。

此外，枯草芽孢桿菌菌體自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用，能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動物體內(nèi)干擾素和巨噬細胞的活性。還可分泌其他多種酶類如麥芽糖酶、植酸酶和纖維素酶等，有助于降解植物性飼料中某些抗營養(yǎng)因子，補充動物內(nèi)源酶的不足，通過分泌有益活性代謝物質(zhì)改善腸道形態(tài)和促進消化酶分泌來提高飼糧養(yǎng)分的利用率，基于這些特性，枯草芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖業(yè)[27～30]。比如，納豆枯草芽孢桿菌喂食牛犢后，可在其腸胃中生長，分泌各種維生素、生長激素和各種活性酶，促進牛犢腸胃黏膜細胞的分裂增殖，增強各種消化酶的活性，同時抑制腸胃中各種病菌發(fā)育，增強牛犢的抗逆性[31]。納豆枯草芽孢桿菌被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為可直接飼養(yǎng)喂食動物的12種飼料級微生物添加劑之一。

枯草芽孢桿菌在動物養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮著極其重要的作用?？莶菅挎邨U菌也被運用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用領(lǐng)域[1]。其作用機理是枯草芽孢桿菌被投入到水中之后，快速分裂繁殖，產(chǎn)生的細胞外活性酶可分解水底淤泥及水中的有機物，既可防止水域營養(yǎng)過剩，又能清除一部分淤泥。

2.3 枯草芽孢桿菌在農(nóng)作物病蟲防治中的應(yīng)用

目前，在農(nóng)林病蟲害多種綠色防控措施中，生物防治手段因環(huán)境友好性和可持續(xù)效果好，備受青睞。出于食品安全與環(huán)境保護需要，隨著國家近年來陸續(xù)出臺的化學農(nóng)藥減量或高毒農(nóng)藥限用、禁用等政策加速實施，眾多農(nóng)藥生產(chǎn)廠家以枯草芽孢桿菌拮抗體為主體的生物農(nóng)藥(制劑)登記產(chǎn)品大幅增加。

美國研發(fā)的B．subtilisvar．a(chǎn)myloliquefaciensFZB24，澳大利亞研發(fā)的B.subtilisA213，日本研發(fā)的B．subtilisRB-14和中國研發(fā)的B．subtilisB916、B908、B3、B903、XM16等菌株[32]相繼實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。胡清玉等[33]研究發(fā)現(xiàn)，以枯草芽孢桿菌為主要菌群和鉀肥聯(lián)用可增強蘋果樹的樹勢，顯著降低腐爛病病疤復發(fā)率；翟世玉等[34]研究發(fā)現(xiàn)鉀和枯草芽孢桿菌聯(lián)用對黑腐皮菌的抑菌效果。陳中義于2002年還將兩個含有 CrylAc 基因的穿梭表達質(zhì)粒載體，導入到枯草芽孢桿菌B916菌株，獲得了全新基因工程菌 Bs2249和Bs2014，這兩個基因菌在防病及殺蟲方面都具有良好的效果。商業(yè)化產(chǎn)品“百泰天贊好”的核心菌株B.subtilisY1336，不僅對水稻、小麥、蔬菜等多種農(nóng)作物真菌病害有優(yōu)異防效，在種群的定殖過程中，自身會分泌一定量植物生長素，刺激作物生根、分蘗、出芽等過程，從而改善植物生長狀況，提高品質(zhì)和產(chǎn)量。Zohora 等[35]分離出的枯草芽孢桿菌RB14能定殖在番茄的根表，并在番茄生長發(fā)育過程中發(fā)揮促生作用，可促進番茄種子的發(fā)芽，將其發(fā)芽率提高至99%，同時對番茄植物猝倒病(Rhizoctonia solani K1)有明顯的預防效果，可降低植物病發(fā)率高達80%。楊佐忠[36]通過不同制劑及其處理方法研究枯草芽孢桿菌對杉苗猝倒病的防效，試驗表明，在兩種試驗環(huán)境下杉苗猝倒病均有減輕，枯草芽孢桿菌在室內(nèi)滅菌和田間自然土中的防效均優(yōu)于五氯硝基苯。

3 展望

枯草芽孢桿菌作為一種安全、高效、環(huán)保、功能多樣的細菌，是一種具有極高研究開發(fā)潛力的微生物菌種，日益成為眾多生物科技工作者關(guān)注熱點。目前其已在生物農(nóng)藥和生物肥料領(lǐng)域初步實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，因其代謝產(chǎn)物的多功能性，也在農(nóng)林植物培育與保護、畜牧飼料、食品加工、環(huán)境保護等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。同時對枯草芽孢桿菌及其近緣種中拮抗基因的克隆及其表達調(diào)控等方面的探索及研究取得了突破性的進展，其中有的已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。但是，對枯草芽孢桿菌的研究還需在以下幾個方面開展系統(tǒng)深入的研究：

(1)與國際研究水平相比，我國在對枯草芽孢桿菌基因組和蛋白質(zhì)組學方面的研究還需深入研究。

(2)枯草芽孢桿菌益生作用的機制相對復雜，目前還不能完全闡述清楚; 同時，其是否具有潛在的安全性問題還需深入的研究。

(3)在枯草芽孢桿菌產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)開發(fā)及應(yīng)用方面暴露出很多問題，例如相關(guān)產(chǎn)品容易受外界環(huán)境影響、作用對象單一、有效期短、見效速度慢等缺點，還需進一步深入研究解決。

(4)枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中的研究已經(jīng)獲取很多實驗數(shù)據(jù)，但由于枯草芽孢桿菌種類繁多，發(fā)酵產(chǎn)物的需求不同，發(fā)酵時間存在一定差異，導致生產(chǎn)不穩(wěn)定、成本高等問題而不能廣泛應(yīng)用在飼料中，因此對降低發(fā)酵成本、縮短發(fā)酵周期、穩(wěn)定生產(chǎn)等方面還需進一步深入研究解決。