核桃青皮不同溶劑提取物抗氧化及抑菌活性比較

曹文利，薛雨菲，楊永興，楊 茜，李 芳，孔令明*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830021）

我國核桃種植面積約667萬hm2，產(chǎn)量365萬t，位居世界第一，其種植面積和產(chǎn)量都占世界份額的40%以上[1]。核桃加工后會產(chǎn)生大量的核桃粕、核桃青皮、核桃殼等副產(chǎn)物[2]，其中僅核桃青皮據(jù)相關(guān)統(tǒng)計每年約會產(chǎn)生45萬t，且只有少部分被農(nóng)民作為家畜的青儲飼料或肥料利用[3]，大部分的青皮資源被當(dāng)作垃圾處理，著實是嚴(yán)重的資源浪費[4]。研究者發(fā)現(xiàn)，核桃青皮中含有多酚類、萘醌苷類、多糖類及色素類化合物等活性成分，這些化學(xué)成分具有消除自由基、抗腫瘤、抗癌、鎮(zhèn)痛消炎、特別對果蔬采后致病真菌有較好的抑菌和殺菌作用[5-7]。已有不少研究表明，核桃青皮提取物兼具著色劑、抗氧化劑以及抑菌劑的三重作用[8-9]。

對核桃青皮活性物質(zhì)的提取方法目前主要有超高壓提取[10]、亞臨界水提取[11]、堿提酸沉淀法提取[12]、有機溶劑萃取法[13]等。超高壓與亞臨界水提取設(shè)備投資成本高，操作工藝復(fù)雜，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)；有機溶劑萃取法提取物中常含有微量的有機溶劑殘留，會對人體或環(huán)境產(chǎn)生危害。本研究采用相對傳統(tǒng)的堿提法與有機溶劑殘留極少的醇提法進行方法比較，以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇和0.15 mol/L的NaOH溶液為提取劑對比研究了核桃青皮中抗氧化生物活性物質(zhì)變化和抑菌能力，以期提高核桃青皮的綜合利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7月中旬至8月初的青皮核桃（品種為溫-185）：購買于新疆阿克蘇紅旗坡，50℃烘干（或自然曬干）后進行粉碎，過60目篩，晾干后粉末置于塑料密封袋中低溫避光保存。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）：美國Sigma公司；2,6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：上海源葉生物科技有限公司；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他實驗試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810PC紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-85C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；TDL-5-A低速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；MHP-250智能霉菌培養(yǎng)箱：上海鴻都電子科技有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃青皮色素粗提物的制備

提取方法參考李利華等[14-15]的方法，并做修改。以料液比為1∶40（g∶mL）添加10 g核桃青皮粉末物料分別和體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇、0.15 mol/L濃度的NaOH溶液混合在500 mL三角瓶中，60℃水浴條件浸提1 h。冷卻后4 500 r/min離心20 min，50℃旋蒸過濾液，得到核桃青皮提取物浸膏，置于棕色瓶中冰箱（-4℃）保存。

1.3.2 測定方法

DPPH·清除能力：按照參考文獻[16]的方法測定；ABTS+·清除能力：按照參考文獻[17]的方法測定；·OH清除率：按照參考文獻[18]的方法測定；O2-·清除率：采用鄰苯三酚自氧化法[19-20]；還原力：按照參考文獻[21]的方法測定；總酚含量：核桃青皮提取物中的總酚含量參考文獻[22]的Fohn-Ciocalteu法測定。

1.3.3 抑菌實驗[23]

采用菌絲生長速率法：在無菌環(huán)境中將提前制備好的核桃青皮提取物用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮-無菌水溶液配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的溶液作為實驗原液。待盛放培養(yǎng)基的三角瓶冷卻至50℃左右，分別精確吸取3 mL、5 mL、10 mL的上述原液于97 mL、95 mL、90 mL PDA培養(yǎng)基中充分搖勻，趁熱倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，制成原液濃度為3%、5%、10%的帶藥平板。用已滅菌的打孔器在鏈格孢霉的菌落邊緣制備直徑8 mm、厚度2 mm的菌餅，待平板冷卻凝固后，將菌餅接在含不同體積濃度核桃青皮粗提物的培養(yǎng)皿中央，以無菌水為溶劑對照（CK），平行3次。所有平板在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察并用十字交叉法測量記錄菌落生長情況。按以下公式計算抑菌率。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

運用Minitab16.0進行處理本次實驗的相關(guān)數(shù)據(jù)信息，運用OriginPro 8.5進行本實驗樣本圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH·清除能力的測定

圖1 不同提取物濃度對DPPH·清除能力的影響Fig．1 Effect of different extract concentrations on DPPH·scavenging ability

由圖1可以看出，核桃青皮提取物的DPPH·清除能力隨濃度的升高而呈現(xiàn)出快速升高的趨勢，且這種增長趨勢差異顯著（P＜0.05），醇提法與堿提法均能有效的清除DPPH自由基，質(zhì)量濃度在400～600μg/mL的范圍時堿提法清除能力略弱于BHT，當(dāng)質(zhì)量濃度≥600μg/mL時，對DPPH·清除能力醇提＞堿提＞BHT。其清除率分別達到最大值73.13%、50.11%和42.50%。這說明較堿提法而言，醇提法得到的提取物中含有更多高活性的抗氧化成分，進而使機體內(nèi)抗氧化酶的活性得到提高，阻止并降低自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的形成和損害[24]。

2.2 ABTS+·清除能力的測定

圖2 不同提取物濃度對ABTS+·清除能力的影響Fig．2 Effect of different extract concentrations on ABTS+·scavenging ability

抗氧化劑的存在能夠提供電子或氫原子使ABTS+·的產(chǎn)生受到抑制，使工作液顏色發(fā)生褪色，進而使其在波長734 nm處的吸光度值減小，也表明清除ABTS+·的能力越強[25]。由圖2可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)ABTS+·清除率隨著核桃青皮提取物質(zhì)量濃度增大呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，且這種關(guān)系差異顯著（P＜0.05）。醇提明顯高于堿提清除ABTS+·的能力，但均弱于陽性對照，當(dāng)核桃青皮提取物質(zhì)量濃度為500μg/mL時，兩種提取方法的自由基清除率分別為65.89%和28.76%，醇提法得到的核桃青皮提取物清除ABTS+·的能力是堿提法的近2.3倍。充分表明核桃青皮醇提提取物具有更好的抗氧化能力。

2.3 ·OH清除率的測定

圖3 不同提取物濃度對·OH清除能力的影響Fig.3 Effect of different extract concentrations on OH·scavenging ability

羥基自由基具有不配對電子而成為眾多自由基中最活潑的但也是具有最大毒性的自由基，它可以快速與細(xì)胞中的任意生物分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)造成一定氧化損傷，對生物體危害最大[26]。由圖3可以看出，隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，核桃青皮醇提和堿提提取物對·OH清除率均呈現(xiàn)上升趨勢，且這種上升趨勢差異顯著（P＜0.05），醇提法相較于堿提法和BHT，其·OH消除能力較優(yōu)，相互間差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度在200～800μg/mL時，BHT對·OH的清除能力的上升趨勢略低于堿提提取物。醇提提取物質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，對·OH自由基清除率達到63.5%。表明醇提法得到的核桃青皮提取物具有作為新型抗氧化劑的潛質(zhì)，且原料來源廣泛，既物美價廉。

2.4 O2-·清除率的測定

圖4 不同提取物濃度對O2-·清除能力的影響Fig.4 Effect of different extract concentrations on O 2-·scavenging ability

超氧陰離子自由基可與羥基自由基結(jié)合對生物體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA等造成損傷，使機體功能下降[27-28]。利用鄰苯三酚在弱堿環(huán)境發(fā)生自氧化生成有色產(chǎn)物和超氧陰離子自由基這一特性，檢測物質(zhì)清除超氧陰離子的能力。由圖4可以看出，核桃青皮醇提、堿提提取物以及BHT對超氧陰離子自由基具有一定的清除能力，自由基的清除率隨著核桃青皮提取物濃度的增加逐漸增強，且這種增長趨勢差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度在為200～400μg/mL時，醇提與堿提所得到的核桃青皮提取物清除超氧陰離子的能力增長趨勢較緩，此時無顯著的差異（P＜0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度在為＞400μg/mL時，醇提清除超氧陰離子的能力比堿提清除超氧陰離子的能力稍高，且上升趨勢明顯（P＜0.05）?？傮w上核桃青皮醇提、堿提提取物清除超氧陰離子的能力低于BHT。

2.5 還原力的測定

圖5 不同提取物濃度對還原力的影響Fig.5 Effect of different extract concentrations on reducing power

物質(zhì)的還原力是檢測物質(zhì)抗氧化活性的一個重要指標(biāo)[29]?？寡趸锏拇嬖谀軌?qū)㈣F氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀，可在波長700 nm處檢出體系溶液顏色的吸光度值，反映出體系中氧化還原狀態(tài)的改變[30]。吸光度值越大，抗氧化效果越佳，還原能力越強。由圖5可知，兩種提取方式提取的核桃青皮提取物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)其還原力隨其質(zhì)量濃度的增加而增強，其增勢雖緩慢但與BHT的還原力相比，差異性顯著（P＜0.05）。

2.6 總酚含量測定

如圖6所示，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，測得的吸光度值與沒食子酸的質(zhì)量濃度之間表現(xiàn)出一定的線性關(guān)系，其回歸方程式為：y=0.010 6x-0.003 8（R2=0.995 9），以Fohn-Ciocalteu為顯色劑對醇提法和堿提法得到的核桃青皮提取物中的多酚含量進行測定，實驗測定得出：醇提總酚含量36.77 mg/g，堿提總酚含量23.52 mg/g。結(jié)合本研究醇提與堿提方法得到的核桃青皮色素清除自由基的能力及還原力發(fā)現(xiàn)，醇提的總酚含量高于堿提，且清除自由基的能力以及還原力后者均不及前者。

2.7 抑菌活性測定結(jié)果

圖6 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of gallic acid

由圖7及表1可知，兩種提取方式得到的核桃青皮色素對鏈格孢菌均有明顯的抑制作用，菌落生長的直徑隨著核桃青皮色素體積濃度的減小而增大，當(dāng)核桃青皮色素濃度在5%以上時，兩種方式的提取物對鏈格孢菌的菌絲生長抑制率均能達到差異顯著水平（P＜0.05）。當(dāng)核桃青皮色素含量為10%時，兩種方式提取得到的青皮色素對鏈格孢菌的抑制率分別為（90.89±1.96）%和（50.71±1.94）%，說明醇提法得到的青皮色素對鏈格孢菌的抑制效果明顯高于堿提法?？紤]是醇提法與堿提法得到的提取物因溶劑不同而抑菌成分不同且成分相對復(fù)雜，堿提不能很好的將核桃青皮中的抑菌成分浸提出來。

表1 兩種方法提取的不同濃度核桃青皮色素對鏈格孢菌生長的抑制作用Table 1 Antibacterial effects of different concentrations of walnut green husk pigment extracted by two kinds of methods on the growth of Alternaria

圖7 兩種方法提取的不同濃度核桃青皮色素對鏈格孢菌的抑制作用Fig.7 Antibacterial effects of different concentrations of walnut green husk pigment extracted by two kinds of methods on Alternaria

3 結(jié)論

本實驗比較了醇提與堿提兩種提取溶劑得到的核桃青皮提取物的抗氧化能力和抑菌能力?？寡趸瘜嶒炓訠HT為陽性對照，比較了醇提法和堿提法對DPPH·、ABTS+·、·OH、O2-·的清除能力以及還原能力，證明醇提法得到的核桃青皮色素粗提物清除自由基的能力優(yōu)于后者，且醇提法測得的總酚含量較高，為36.77 mg/g；堿提法測得的總酚含量約是醇提法的64%。抑菌實驗通過菌絲生長速率法證明兩種浸提方法得到的核桃青皮色素粗提物對鏈格孢菌均有較強的抑制效果，醇提法抑菌能力遠高于后者。當(dāng)核桃青皮提取物含量為10%時，兩種溶劑提取得到的青皮提取物對鏈格孢菌的抑制率分別為（90.89±1.96）%和（50.71±1.94）%。