殼聚糖復合抑菌保鮮膜的研制及其性能研究

曹麗娟，張曉杰，周文博，孫佳雪，毛迪銳*

（北華大學 林學院，吉林 吉林 132013）

可食用抑菌保鮮膜已成為近年來研究的熱點之一，可食用抑菌保鮮膜是以蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)為基質(zhì)，輔以增塑劑和疏水劑，通過分子間不同種類的作用力而形成的膜。其不僅可以直接食用，還可被生物降解，可有效代替?zhèn)鹘y(tǒng)保鮮材料。目前可食性保鮮膜已在鮮肉及肉制品、水產(chǎn)品、葡萄保鮮技術[1-2]中進行應用研究。殼聚糖是一種類似纖維素結構的天然多糖，由于其具有良好的成膜性、透明度高、抗拉強度好、安全環(huán)保等優(yōu)點，因此以殼聚糖為基質(zhì)制成的保鮮膜（液），被廣泛用于藍莓[3]、圣女果[4]、鮮切茄子[5]、鮮切萵苣[6]等水果、蔬菜[7]保鮮技術中。在我國GB 2760—2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中明確規(guī)定殼聚糖、溶菌酶和納他霉素可用作食品防腐劑。溶菌酶是一種天然縮氨酸蛋白質(zhì)抑菌劑，能夠水解細胞壁所含的糖苷鍵，使細胞壁失去原本的功能；并且溶菌酶能夠與病毒蛋白、細菌和真菌細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生反應，以達到殺菌消毒的目的[8]。納他霉素能有效抑制酵母菌和霉菌，其抑菌作用是山梨酸的50～300倍，廣泛應用于干酪、發(fā)酵香腸、果汁、水果等食品中[9-10]。本試驗將殼聚糖、溶菌酶、納他霉素三種抑菌劑復合，彌補單一抑菌劑的不足，制備殼聚糖復合抑菌保鮮膜，并研究該保鮮膜的性能，為可食性抑菌保鮮膜在食品保鮮中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度≥90）：鄭州雅菲生物科技有限公司；溶菌酶（酶活＞1.8萬U/g）、納他霉素：浦城?？瞪邢薰?；

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、黑根霉（Rhizopus stolonifer）：均由北華大學病理實驗室提供。

純化甘油（分析純）：檀博化工工業(yè)公司；海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）（分析純）：上海申光食用化學品有限公司；蛋白胨、瓊脂、牛肉膏（均為生化試劑）：遼寧泉瑞試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：天津大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

FA2004A型電子分析天平：大連美翼實驗室設備科技有限公司；Universal TA型質(zhì)構儀：上海騰拔儀器科技有限公司；722N型可見分光光度計：合肥塞洛測控科技有限公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市富華儀器有限公司；LDZX-50FB型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-2500S-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；PHS-3C型pH計：北京京海佳業(yè)科貿(mào)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 殼聚糖復合抑菌保鮮膜的制備

分別配制一定濃度的溶菌酶溶液、納他霉素溶液、殼聚糖溶液、海藻酸鈉溶液和CMC-Na溶液，按照比例混合均勻，最后加入甘油攪拌均勻。將（25±1）mL混合溶液傾倒入90 mm玻璃平板中，（25±1.5）℃條件下烘干24 h，成膜后揭膜，形成厚度1 mm左右的復合膜[11]。

1.3.2 影響殼聚糖復合抑菌保鮮膜的單因素試驗

影響殼聚糖復合抑菌保鮮膜性質(zhì)的主要因素有溶菌酶添加量、納他霉素添加量、殼聚糖添加量、海藻酸鈉添加量、CMC-Na添加量和甘油添加量。通過比較抑菌圈的直徑，分別確定溶菌酶及納他霉素的最佳添加量。以殼聚糖添加量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%；海藻酸鈉添加量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%；CMC-Na添加量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%；甘油添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%進行混合，通過烘干、揭膜等工藝，根據(jù)評定標準進行評分，確定殼聚糖復合抑菌保鮮膜的最佳配方。

1.3.3 殼聚糖復合抑菌保鮮膜抑菌作用

殼聚糖復合抑菌保鮮膜采用濾紙圓片法[12]考察其分別對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、黑根霉的抑菌作用。每個菌種做三組平行試驗，空白組選用無菌水。

1.3.4 抑菌保鮮膜評價標準

分別測定復合膜的不同性能，根據(jù)表觀黏性（20分）、抗拉強度（tensile strength，TS）（20分）、斷裂延伸率（elongation at break，EAB）（20分）、水蒸氣透過率（water vapor permeability，WVP）（20分）和透光率（20分）進行評分，綜合評分滿分100分，評分標準見表1。

表觀黏性的測定：將復合膜固定在測試平臺上，使用柱型探頭，探頭到平臺的距離設定為20 mm，測定膜的黏性。每個樣品做5個平行試驗。

抗拉強度和斷裂延伸率的測定：按照ARVENITOY ANNIS I等[13]的方法，采用質(zhì)構儀測定膜的抗拉伸強度和斷裂拉伸率。每個樣品做5個平行實驗，每個樣品大小為30 mm×50 mm?？估瓘姸戎翟酱螅硎卷g性越大，評分越高；斷裂延伸率值越大，評分越高?？估瓘姸群蛿嗔蜒由炻史謩e按照公式（1）和公式（2）計算。

表1 殼聚糖復合抑菌保鮮膜綜合評價指標及標準Table 1 Comprehensive evaluation indexes and standards of chitosan compound antibacterial fresh-keeping film

式中：TS為抗拉強度，MPa；Fm為膜斷裂時承受的最大拉力，N；L為膜的厚度，m；W為膜的寬度，m。測試方式設為拉伸，測試前速度1 mm/s。

式中：EAB為斷裂延伸率，%；lmax為膜斷裂時抵達的最大長度，m；l0為膜的初始長度，m。

水蒸氣透過率的測定：參考美國材料與試驗協(xié)會制定的E 96-93標準[14]方法測定，每個樣品做5個平行實驗。水蒸氣透過率值越大，評分越低。水蒸氣透過率計算公式如下：

式中：WVP為試樣的水蒸氣透過率[（g·mm）/（h·m2·kPa）]；q/t為單位時間內(nèi)透濕杯增加質(zhì)量的算術平均值，g/h；d樣品膜厚度，mm；S樣品膜實驗面積（m2），ΔP試樣兩側的蒸汽壓（kPa），由于膜兩側的梯度為50%，測定溫度為25℃，ΔP為1.583 KPa。

透光率的測定：將復合膜剪成30 mm×50 mm的長條，貼在比色皿內(nèi)側，參考美國材料與試驗協(xié)會制定的D1003-07標準[15]的方法在波長800 nm條件下測定其透光率（T），以空白為對照。透光率間接表示膜的透明度；透光率值越大，表示透明度越高，評分越高。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖復合抑菌保鮮膜配方的試驗結果

2.1.1 溶菌酶最佳抑菌添加量的確定

培養(yǎng)基在37℃條件下培養(yǎng)24 h后，比較不同溶菌酶添加量對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈的大小，確定溶菌酶的最佳抑菌添加量，試驗結果見表2。

表2 不同溶菌酶添加量對抑菌圈直徑的影響Table 2 Effect of different lysozyme addition on the inhibitory zone diameter mm

由表2可知，通過比較抑菌圈直徑，當溶菌酶添加量＞0.06%時，溶菌酶的抑菌圈直徑略微增大，而且溶菌酶會降低膜的透光率。因此確定溶菌酶最佳抑菌添加量為0.06%。

2.1.2 納他霉素最佳抑菌添加量的確定

培養(yǎng)基在28℃條件下培養(yǎng)48 h后，比較不同納他霉素添加量對酵母菌和黑根霉的抑菌圈的大小，確定納他霉素的最佳抑菌添加量，試驗結果見表3。

表3 不同納他霉素添加量對抑菌圈直徑的影響Table 3 Effect of different natamycin addition on the inhibitory zone diameter mm

由表3可知，納他霉素添加量＞0.03%時，酵母菌的抑菌圈沒有明顯變化，而黑根霉的抑菌圈雖增大但不明顯。因此選擇0.03%作為納他霉素最佳抑菌添加量。

2.1.3 殼聚糖添加量對復合膜綜合評分的影響

圖1 殼聚糖添加量對復合膜綜合評分的影響Fig.1 Effect of chitosan addition on comprehensive evaluation score of compound film

由圖1可知，膜的綜合評分隨殼聚糖添加量的增加先增加后降低，主要是由于殼聚糖分子與海藻酸鈉等成分通過分子間的靜電、氫鍵相互作用，使得膜的抗拉強度有所增加，水蒸氣透過率降低，但當殼聚糖添加量＞2.0%時，膜的抗拉強度基本沒有變化；且膜的透光率有所下降。故綜合考慮，殼聚糖添加量為2.0%。

2.1.4 海藻酸鈉添加量對復合膜綜合評分的影響[16]

圖2 海藻酸鈉添加量對復合膜綜合評分的影響Fig.2 Effect of sodium alginate addition on comprehensive evaluation score of compound film

由圖2可知，隨著海藻酸鈉添加量增加，海藻酸鈉與殼聚糖發(fā)生的靜電相互作用也增強，因此膜的抗拉強度和斷裂延伸率得到顯著改善。但由于海藻酸鈉親水性較強，隨著添加量的繼續(xù)增加，膜的水蒸氣透過率也相應增加[17]。根據(jù)綜合評分，確定海藻酸鈉添加量為0.15%。

2.1.5 CMC-Na添加量對復合膜綜合評分的影響

圖3 CMC-Na添加量對復合膜綜合評分的影響Fig.3 Effect of CMC-Na addition on comprehensive evaluation score of compound film

由圖3可知，CMC-Na鈉添加量在0.05%～0.15%時，膜的抗拉強度顯著增加，在CMC-Na鈉添加量為0.15%～0.25%時，膜的黏性過高，不易揭膜，而且透光率降低，使得膜綜合評分降低。故根據(jù)綜合評分，確定CMC-Na添加量為0.15%。

2.1.6 甘油添加量對復合膜綜合評分的影響[18-20]

圖4 甘油添加量對復合膜綜合評分的影響Fig.4 Effect of glycerin addition on comprehensive evaluation score of compound film

由圖3可知，當甘油添加量＞1.5%時，甘油可以使基質(zhì)分子內(nèi)部氫鍵減弱，增加膜內(nèi)部分子間的空隙，使得膜的水蒸氣透過率增加，降低了膜的綜合評分。故根據(jù)綜合評分，確定甘油的添加量為1.5%。

2.1.7 殼聚糖復合抑菌保鮮膜最佳配方的確定

在單因素試驗基礎上，以殼聚糖添加量（A）、甘油添加量（B）、海藻酸鈉添加量（C）、CMC-Na添加量（D）為評價因素，運用L9（34）正交試驗進行優(yōu)化確定最佳配方。采用模糊數(shù)學評價法對保鮮膜進行性能評定，從表觀黏性、抗拉強度、斷裂延伸率、水蒸氣透過率、透光率五個方面進行綜合評價，滿分100分。試驗結果見表4。

表4 復合膜配方優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for compound film formula optimization

由表4可知，保鮮膜最佳配方組合為A2B2C2D2，將表4中第2組A1B2C2D2做對比試驗，A2B2C2D2綜合評分97分高于A1B2C2D2綜合評分96分，因此殼聚糖復合抑菌保鮮膜的最佳配方為A2B2C2D2，即殼聚糖添加量2.0%、甘油添加量1.5%、海藻酸鈉添加量0.15%、CMC-Na添加量0.15%。按照此配方制得的殼聚糖復合抑菌保鮮膜表觀黏性為0.54 gf；抗拉強度為29.37 MPa；斷裂延伸率為116.9%，透光率91.17%，水蒸氣透過率0.221[（g·mm）/（h·m2·kPa）]。在此最佳配方條件下，保鮮膜綜合評分為97分。

2.2 殼聚糖復合抑菌保鮮膜的抑菌試驗結果

復合膜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌和黑根霉的抑菌效果，結果見表5。

表5 復合膜對各菌種的抑菌圈直徑的影響Table 5 Effect of compound film on inhibitory zone diameter of various strains

由表5可知，殼聚糖復合抑菌保鮮膜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、黑根霉均具有抑菌作用，且高于溶菌酶和納他霉素單獨對菌株的抑菌效果，各試驗組的空白抑菌圈直徑均為0。試驗結果可以為殼聚糖復合抑菌保鮮膜在不同食品保鮮中的應用提供理論基礎。

3 結論

通過綜合評價，確定殼聚糖復合抑菌保鮮膜最佳配方為溶菌酶添加量0.06%，納他霉素添加量0.03%，殼聚糖添加量2.0%，海藻酸鈉添加量0.15%，CMC-Na添加量0.15%，甘油添加量1.5%。在此最佳配方條件下，保鮮膜綜合評分為97分。殼聚糖復合抑菌保鮮膜無黏性，抗拉強度和斷裂延伸率、透光率較高，水蒸氣透過率較小，能夠有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、黑根霉。