響應(yīng)面優(yōu)化微波結(jié)合木聚糖酶制備稻殼低聚木糖工藝研究

關(guān)海寧，趙曉偉，刁小琴，黃秀琦，馬 可

（綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061）

稻殼約占稻谷質(zhì)量的20%，含有約40%粗纖維和20%五碳糖聚合物及少量的粗脂肪、蛋白等有機(jī)物[1-2]。稻殼外殼堅(jiān)硬，不易被土壤消化，同時(shí)較低的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值使其不適宜作飼料，因此產(chǎn)量較大的稻殼就會(huì)造成環(huán)境污染，放置時(shí)間較長(zhǎng)還會(huì)容易發(fā)生自燃，如何充分利用稻殼是當(dāng)前急需解決的問題。低聚木糖是由2～7個(gè)木糖分子以β-1,4糖苷鍵聯(lián)結(jié)而成的功能性聚合糖，以木二糖和木三糖為主[3-4]，具有安全、無毒、低熱、耐酸、耐熱等良好的理化特性，還具有促進(jìn)雙歧桿菌增值，保護(hù)肝臟、降血壓、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等重要生理功能[5-8]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、功能性食品、飼料添加劑等方面[9-10]。

目前低聚木糖的提取方法常用酸水解法，利用該法水解不僅要求設(shè)備要防止酸腐蝕，而且需要耐高溫、高壓，需要的成本較高，同時(shí)木聚糖在酸性條件下水解速度較快，在低聚木糖水平上較難控制且還會(huì)產(chǎn)生較多的有害物質(zhì)，使得到的低聚木糖質(zhì)量較低[11]。近些年，微波技術(shù)由于其升溫速度快，熱效率高，能量傳遞迅速且利用充分，細(xì)胞內(nèi)有效成分能快速溶出[12-13]等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取方面，而且微波技術(shù)不需要太多的溶劑，被視為清潔高效的提取技術(shù)[14]。木聚糖酶是能夠降解木聚糖的最主要酶之一，能進(jìn)行定向酶水解生產(chǎn)低聚木糖[15]。李秀婷等[16]報(bào)道，木聚糖酶能使玉米芯中的水不溶性木聚糖產(chǎn)生木二糖、木三糖及木四糖等含量較高的低聚糖，合理利用木聚糖酶，能夠提高玉米芯的利用率。

本試驗(yàn)采用微波預(yù)處理結(jié)合木聚糖酶法制備稻殼中的低聚木糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳工藝條件，為稻殼的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)踐基礎(chǔ)，對(duì)稻殼的利用與處理具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻殼：黑龍江綏化某稻米廠提供，粉碎備用；木聚糖酶（50 000 U/g）：鄭州萬博食品配料有限公司；低聚木糖（純度≥98%）：上海展云化工有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：上海伊卡生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；M1-L202B美的微波爐：佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波-木聚糖酶制備工藝

將剔除雜物的稻殼磨碎，稱取3.0 g，置250 mL的錐形瓶中，加入檸檬酸緩沖液（pH 5.0）9 mL攪拌均勻，于一定的微波功率條件下處理一定的時(shí)間，取出晾涼后加入一定量的木聚糖酶，再加入檸檬酸緩沖液（pH 5.0）使料液比達(dá)到1∶20（g∶mL），在50 ℃水浴鍋中酶解一定的時(shí)間后，沸水浴滅酶，離心得上清液，定容至50 mL容量瓶中，待測(cè)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

按照1.3.1的方法，分別研究微波功率（80 W、240 W、400 W、640 W、800 W），微波時(shí)間（2 min、3 min、4 min、5 min、6 min），酶解溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），酶解時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h），料液比為（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））對(duì)稻殼低聚木糖提取量的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以對(duì)制備低聚木糖含量有顯著影響的微波功率（X1）、酶解溫度（X2）及微波時(shí)間（X3）3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以低聚木糖含量（Y）為響應(yīng)值，確定稻殼低聚木糖制備的最佳工藝條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼見表1。

表1 低聚木糖制備條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for xylooligosaccharide preparation conditions optimization

1.3.4 測(cè)定方法

低聚木糖含量測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[17]的方法，按下列公式計(jì)算：

式中：m′為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得低聚木糖的質(zhì)量，mg；V為樣品提取液總體積，mL；N為樣品提取液稀釋倍數(shù)；Vs為測(cè)定時(shí)所需樣品提取液的體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 微波功率的影響

在不同微波功率條件下微波5 min后取出晾涼，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），50 ℃水浴酶解2 h，考察不同微波功率對(duì)低聚木糖含量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 微波功率對(duì)低聚木糖含量的影響Fig.1 Effect of microwave power on xylooligosaccharide content

由圖1可知，微波功率＜640 W之前，低聚木糖含量隨微波功率的增大而提高；微波功率為640 W時(shí)低聚木糖含量達(dá)到最大，為4.24 mg/g；當(dāng)微波功率＞640 W之后，低聚木糖含量明顯下降。原因可能是微波功率太小時(shí)，不足以提供足夠的熱使細(xì)胞破壁，更多的木聚糖不易暴露，進(jìn)而使后續(xù)水浴酶解得到的低聚木糖含量相對(duì)較低，而較高的微波功率能夠增加微波的輻射能量[18]，有利于細(xì)胞壁的破壞，進(jìn)而使更多的木聚糖暴露。但功率過高時(shí)，瞬間加熱致使過高的溫度對(duì)木聚糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致后續(xù)水浴酶解低聚木糖含量降低。因此，選擇微波功率640 W為宜。

2.1.2 微波時(shí)間的影響

在微波功率640 W條件下，微波一定時(shí)間后取出晾涼，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），50 ℃水浴酶解 2 h，考察不同微波時(shí)間對(duì)低聚木糖含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 微波時(shí)間對(duì)低聚木糖含量的影響Fig.2 Effect of microwave time on xylooligosaccharide content

由圖2可知，微波時(shí)間＜3 min之前，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，低聚木糖含量增大；當(dāng)微波時(shí)間為3 min時(shí)，低聚木糖含量達(dá)到最大，為4.09 mg/g；微波時(shí)間＞3 min之后，低聚木糖含量又迅速下降。這可能是因?yàn)槲⒉訜嵘郎胤浅Ｑ杆?，處理時(shí)間過短，低聚木糖暴露不充分；當(dāng)處理時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，可能導(dǎo)致部分低聚木糖結(jié)構(gòu)破壞，使后續(xù)木聚糖酶水解木聚糖得到的低聚木糖含量降低。因此，微波時(shí)間以3 min為宜。

2.1.3 酶解溫度的影響

在微波功率640 W條件下微波3 min后取出晾涼，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），一定溫度下水浴酶解 2 h，考察不同酶解溫度對(duì)低聚木糖含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)低聚木糖含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on xylooligosaccharide content

由圖3可知，酶解溫度＜60℃之前，隨著溫度的升高，低聚木糖含量增大；當(dāng)酶解溫度為60℃時(shí)，低聚木糖含量達(dá)到最大，為4.52 mg/g；酶解溫度＞60℃之后，低聚木糖含量開始下降。原因可能是酶解溫度過大不僅使酶發(fā)生了變性，而且得到的低聚木糖結(jié)構(gòu)被破壞，低聚木糖的提取量降低，而酶解溫度太低，木聚糖酶活性較低，不能使木聚糖充分酶解。因此，酶解溫度以60℃為宜。張燕青等[15]報(bào)道，不同來源的木聚糖酶的最適溫度為50～60℃，溫度過高，會(huì)使酶的活性降低。

2.1.4 酶解時(shí)間的影響

在微波功率640 W條件下微波3 min后取出晾涼，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），60 ℃水浴酶解一定時(shí)間，考察不同酶解時(shí)間對(duì)低聚木糖含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)低聚木糖含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on xylooligosaccharide content

由圖4可知，酶解時(shí)間＜3 h之前，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，低聚木糖含量增大；酶解時(shí)間為3 h時(shí)，低聚木糖含量達(dá)到最大，為4.24 mg/g；當(dāng)酶解時(shí)間超過3 h之后，低聚木糖含量增加的幅度減少且趨于平緩。原因可能是酶解時(shí)間太短不能使木聚糖充分酶解得到更多的低聚木糖，而當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，可能木聚糖酶解作用完成，低聚木糖基本完全溶出，也可能是得到的產(chǎn)物對(duì)酶的反饋抑制作用增強(qiáng)[19]，酶解時(shí)間繼續(xù)增加對(duì)提取量影響較小。因此，后續(xù)試驗(yàn)酶解時(shí)間以3 h為宜。

2.1.5 料液比的影響

在微波功率640 W條件下微波3 min后取出晾涼，加入4%木聚糖酶，以一定的料液比（g∶mL）在60℃水浴酶解3 h，考察不同料液比對(duì)低聚木糖含量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對(duì)低聚木糖含量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on xylooligosaccharide content

由圖5可知，料液比增加的同時(shí)，低聚木糖含量呈上升趨勢(shì)。當(dāng)料液比1∶5～1∶15（g∶mL）時(shí)，低聚木糖含量增加速度較快，當(dāng)料液比1∶15～1∶25（g∶mL）時(shí)，低聚木糖含量增長(zhǎng)速度趨于平緩。這可能是當(dāng)料液比較小時(shí)，物料黏度過大，酶解得到的低聚木糖不能充分溶出[20]，當(dāng)料液比為1∶15（g∶mL）時(shí)，低聚木糖基本全部溶出，繼續(xù)增加料液比，溶出的低聚木糖變化不明顯。因此，為了節(jié)省能源，提高效率，選擇料液比為1∶15（g∶mL）為最佳。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取微波功率（X1）、酶解溫度（X2）及微波時(shí)間（X3）3個(gè)因素，以稻殼低聚木糖含量（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定3因素3水平，共15個(gè)試驗(yàn)。其中12個(gè)析因點(diǎn)，3個(gè)0點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到的回歸方程為：

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，模型P＜0.000 1，說明該模型高度顯著，失擬項(xiàng)P=0.107 6＞0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著，回歸方程對(duì)數(shù)據(jù)擬合較好，可以通過此模型來預(yù)測(cè)稻殼低聚木糖制備的最優(yōu)條件?；貧w方程中，微波功率、酶解溫度、微波時(shí)間的一次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），說明這3個(gè)因素對(duì)低聚木糖含量的影響線性關(guān)系極顯著，微波功率與微波時(shí)間的交互作用達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其響應(yīng)面及等高線見圖6，其他因素交互作用不顯著。

表2 低聚木糖制備條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for xylooligosaccharide preparation conditions optimization

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of the regression model

由圖6可知，響應(yīng)曲面圖曲線陡峭、等高線形狀為橢圓形，說明微波功率與微波時(shí)間交互作用顯著，這一結(jié)果與表3方差分析結(jié)果一致。

圖6 微波功率與微波時(shí)間交互作用對(duì)低聚木糖含量影響的響應(yīng)面（A）和等高線（B）Fig.6 Response surface plots(A)and contour line(B)of effects of interaction between microwave power and microwave time on xylooligosaccharide content

根據(jù)模型預(yù)測(cè)得到的最優(yōu)制備條件為微波功率637.04 W，酶解溫度58.89℃，微波時(shí)間3.19 min，在此條件下理論低聚木糖含量為5.00 mg/g，為檢測(cè)模型預(yù)測(cè)的可靠性及實(shí)際操作的便利性，制備工藝參數(shù)修正為微波功率640 W，酶解溫度59℃，微波時(shí)間3.2 min，在此優(yōu)化條件下，低聚木糖實(shí)際含量為4.94 mg/g，實(shí)際測(cè)定結(jié)果與理論值的相對(duì)誤差為1.2%，綜上所述，利用響應(yīng)面法優(yōu)化制備稻殼低聚木糖合理可行。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法對(duì)微波預(yù)處理輔助木聚糖酶制備稻殼低聚木糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，結(jié)果表明，微波功率（W）、酶解溫度（℃）、微波時(shí)間（min）對(duì)低聚木糖含量的影響線性關(guān)系極顯著（P＜0.01），微波功率與微波時(shí)間的交互作用對(duì)低聚木糖含量的影響顯著（P＜0.05）。通過響應(yīng)面分析得到了制備的最優(yōu)條件：微波功率640 W，微波時(shí)間3.2 min，酶解溫度59 ℃，酶解時(shí)間3 h，料液比1∶15（g∶mL）。在此優(yōu)化條件下，低聚木糖含量為4.94 mg/g。該研究為稻殼低聚木糖的制備提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)充分利用稻殼資源，將其變廢為寶，不僅能夠解決資源浪費(fèi)問題，也能增加農(nóng)民的收入。