酵母固定化方法的比較及應(yīng)用

祝 英，莊鶴桐，王治業(yè)，周劍平*

（1.甘肅省微生物資源開(kāi)發(fā)利用（聯(lián)合）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省科學(xué)院 生物研究所，甘肅 蘭州 730000；3.浙江省杭州市蕭山中學(xué)，浙江 杭州 311201）

固定化細(xì)胞技術(shù)即用一種合適的材料將具有生物活性的細(xì)胞固定在其中，使微生物活細(xì)胞具有一定的活動(dòng)空間、便于保存、可重復(fù)使用，微生物的生長(zhǎng)代謝和繁殖不受影響的一門綜合高新技術(shù)[1]。固定化細(xì)胞技術(shù)在20多年前已經(jīng)開(kāi)始被廣泛研究和應(yīng)用，根據(jù)被固定的材料（如微生物細(xì)胞或各種酶），可以選擇不同的固定化載體[2-3]。常用的固定化方法包括海藻酸鈣凝膠法[4]、瓊脂凝膠法[5-6]、明膠-戊二醛交聯(lián)法、磁性材料修飾法[7]、微管陣列膜法[8]、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）包埋法[9-10]和多孔殼聚糖[3]等。固定化細(xì)胞旨在將活細(xì)胞限制在特定區(qū)域內(nèi)，以增加細(xì)胞密度、積累次生代謝物、減少機(jī)械剪切對(duì)活細(xì)胞的損傷，在細(xì)胞恢復(fù)和再利用方面發(fā)揮突出的優(yōu)點(diǎn)，因此，在分批和連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮顯著的優(yōu)勢(shì)[2，11-12]。固定化酵母已應(yīng)用于釀酒、蘋果酒、葡萄酒和啤酒等工業(yè)釀造行業(yè)[1]，雖然該技術(shù)在一定程度上降低了釀酒行業(yè)的工藝成本，但是不同固定化材料對(duì)酒的風(fēng)味和有效成分的穩(wěn)定等問(wèn)題還未完全解決，固定化細(xì)胞的工業(yè)應(yīng)用還很有限[1，4，13-16]，因此，尋找適合工業(yè)應(yīng)用的低成本聚合物不但決定固定化細(xì)胞生物催化功能的穩(wěn)定性，而且對(duì)固定化細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用也發(fā)揮關(guān)鍵的作用。

本研究采用海藻酸鈣凝膠法、瓊脂凝膠法、明膠-戊二醛交聯(lián)法和聚乙烯醇包埋法對(duì)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1308進(jìn)行固定，通過(guò)比較4種固定化方法，選擇低成本、性能優(yōu)越的固定方法。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化固定化條件，并將固定化酵母用于分批和連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。通過(guò)對(duì)釀酒酵母最佳固定材料的篩選和應(yīng)用研究，以期為固定化細(xì)胞方法在工業(yè)方面的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1308：甘肅省科學(xué)院生物所的中國(guó)工業(yè)微生物保藏中心甘肅分中心（Gansu center of industrial culture collection，GSICC），保藏編號(hào)為GSICC 51902。

1.1.2 試劑

海藻酸鈣（分析純），瓊脂（生化試劑）：青島水產(chǎn)加工廠；聚乙烯醇（化學(xué)純）：蘭州維尼綸廠；明膠（化學(xué)純）：上海明膠廠；玉米粉（工業(yè)級(jí)）：隴西酒精廠；淀粉酶（2 000 U/g）、糖化酶（50 000 U/g）：無(wú)錫酶制劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米糖化醪）：經(jīng)篩孔直徑2 mm的錘式粉碎機(jī)粉碎后的玉米粉按照料液比1∶3（g∶mL）加入90℃熱水，按總料0.1%的比例加入淀粉酶，保溫1 h，再煮沸1 h，冷卻至60℃加入糖化酶，酶用量為每克醪液300 U，糖化時(shí)間1 h，糖化溫度為30℃。糖含量約為18%～20%，121℃高壓滅菌15 min后備用。

1.2 儀器與設(shè)備

Primo Star普通光學(xué)顯微鏡：德國(guó)蔡司公司；TU-1950八聯(lián)池-紫外分光光度計(jì)：北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；XL-20掃描電鏡：荷蘭Philips公司；柱式生物反應(yīng)器：連續(xù)發(fā)酵柱式生物反應(yīng)器（有機(jī)玻璃加工而成的，單柱有效使用體積約為100 mL（10.5 cm×3.5 cm），高徑比是3∶1，三級(jí)串聯(lián)。每一級(jí)均有夾套，夾套中用流動(dòng)的恒溫水保溫，培養(yǎng)基由蠕動(dòng)泵從底部泵入，從頂部通過(guò)膠皮管泵入下一級(jí)）：自制。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的增殖

將酵母菌1308接種于麥芽汁培養(yǎng)基，于28～30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 固定化方法及比較

海藻酸鈣凝膠法[17]：在90 mL含量為1%、2%、3%、4%、5%的海藻酸鈣溶液中分別加入10 mL酵母菌增殖液（8.0×107CFU/mL），混合均勻，用蠕動(dòng)泵通過(guò)硅橡膠管吸入后擠出，并滴入40 mL 4.0%氯化鈣溶液中，鈣化4～8 h，即成直徑2～3 mm的均勻珠體，用無(wú)菌水洗滌備用。

瓊脂凝膠法[18]：取10 mL酵母菌增殖液加入90 mL 6%的瓊脂溶液中，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿中鋪平板，待凝固后切成約3 mm3的小方塊，用無(wú)菌水沖洗后備用。

明膠-戊二醛交聯(lián)法[18]：取10 mL酵母菌增殖液加入90 mL 10%明膠溶液中，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿中鋪平板，待凝固后切成約3 mm3的小方塊，然后加入90 mL 0.5%戊二醛溶液在室溫條件下交聯(lián)20 min，用無(wú)菌水沖洗后備用。

PVA包埋法[19]：分別取10 mL酵母菌增殖液加入90 mL含量為4%、5%、6%、8%、10%、12%、15%、20%的改良PVA溶液中，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿中鋪平板，然后在-30～-20℃條件下冷凍2～8 h，取出后切成約3 mm3的小方塊備用。

固定化方法的比較：采用4種固定化方法對(duì)酵母1308進(jìn)行固定，并對(duì)固定化酵母進(jìn)行分批發(fā)酵，共發(fā)酵5批次，每批次發(fā)酵36 h，分別在12 h、24 h和36 h取樣測(cè)定發(fā)酵液中的細(xì)胞總數(shù)、乙醇含量并求出乙醇生產(chǎn)能力[10-11]，發(fā)酵5批次后觀察各種凝膠的機(jī)械強(qiáng)度[4，19]。

1.3.3 固定化酵母的穩(wěn)定性

將20 g固定化酵母接種于含200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，每批次于30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，共發(fā)酵82批次（164 d），測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇含量、殘?zhí)呛亢图?xì)胞總數(shù)，并求出乙醇的生產(chǎn)能力[10-11]，以研究固定化酵母的穩(wěn)定性。

1.3.4 固定化酵母的發(fā)酵

分批發(fā)酵：取發(fā)酵82批次的固定化酵母20 g接種于含200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中；同時(shí)，以接種量為10%的未固定化酵母增殖液（8.0×107CFU/mL）作為對(duì)照，分別于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h，分別在0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇含量、細(xì)胞總數(shù)和殘?zhí)呛縼?lái)研究固定化酵母分批發(fā)酵的代謝過(guò)程，每個(gè)處理重復(fù)3次。

連續(xù)發(fā)酵：國(guó)內(nèi)外多采用柱式生物反應(yīng)器進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)[12-13]。第一級(jí)柱中PVA固定化細(xì)胞的填充量為40 g，第二級(jí)柱中填充量為30 g，第三級(jí)柱中填充量為20 g。在試驗(yàn)中連續(xù)供給玉米糖化醪，流速控制在20 mL/h，培養(yǎng)基在柱中的滯留時(shí)間為3 h，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵120 d。每天取樣，測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇含量、殘?zhí)呛?、pH值和細(xì)胞總數(shù)，并求出乙醇生產(chǎn)能力。

1.3.5 分析檢測(cè)方法

殘?zhí)呛浚翰捎?,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定[20]。乙醇含量：采用比重法測(cè)定。細(xì)胞總數(shù)：采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定。固定化細(xì)胞形態(tài)：采用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22軟件的單因素方差分析對(duì)測(cè)量變量統(tǒng)計(jì)分析；采用雙變量相關(guān)性分析方法分析各變量間的相關(guān)性。采用Origin 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化方法的比較

本實(shí)驗(yàn)選擇4種有代表性的固定化方法對(duì)酵母1308進(jìn)行固定，并通過(guò)固定化酵母分批發(fā)酵（24 h）對(duì)4種固定化方法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，不同固定化材料固定酵母，在發(fā)酵24 h后，細(xì)胞數(shù)量均由原來(lái)的8.0×107CFU/g凝膠增加了一個(gè)數(shù)量級(jí)。其中海藻酸鈣凝膠法酵母細(xì)胞總數(shù)最高，細(xì)胞數(shù)為9.1×108CFU/g凝膠；PVA包埋法次之，細(xì)胞總數(shù)為6.5×108CFU/g凝膠。在4種固定化方法中，海藻酸鈣凝膠法固定的酵母1308乙醇生產(chǎn)能力最高[27.6 mg/（g·h）]，PVA包埋法次之[24.0 mg/（g·h）]，但其凝膠塊完整，有彈性，具有理想的機(jī)械強(qiáng)度。因此，從細(xì)胞總數(shù)、乙醇含量、乙醇生產(chǎn)能力和機(jī)械強(qiáng)度綜合考慮，海藻酸鈣凝膠法和PVA包埋法效果較好。進(jìn)一步研究不同海藻酸鈣含量和PVA含量對(duì)固定化酵母乙醇生產(chǎn)能力的影響（24 h），結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 不同固定化方法的比較Table 1 Comparison of different immobilization methods

圖1 不同海藻酸鈣（A）和聚乙烯醇（B）含量對(duì)固定化酵母產(chǎn)乙醇的影響Fig.1 Effects of different sodium alginate(A)and polyvinyl alcohol(B)contents on ethanol production of immobilized yeast

由圖1可知，海藻酸鈣及聚乙烯醇含量對(duì)固定化酵母的乙醇生產(chǎn)能力影響顯著（P＜0.05）。當(dāng)海藻酸鈣含量為3%時(shí)，固定化酵母的乙醇產(chǎn)量最高，為8.5%vol；當(dāng)PVA含量在10%左右，固定化酵母的乙醇產(chǎn)量較高。

綜上所述，海藻酸鈣凝膠法制備的珠體催化活性高，乙醇生產(chǎn)能力也強(qiáng)。但珠體機(jī)械強(qiáng)度差，長(zhǎng)期使用易裂縫、破碎，所以不適合工業(yè)應(yīng)用。而PVA包埋法雖然催化活性略低于海藻酸鈣珠體，但其機(jī)械強(qiáng)度好，且制備方法簡(jiǎn)單、原料豐富、成本低等，是工業(yè)應(yīng)用的一種相對(duì)理想的載體。與HERKOMMEROVA K等[9]的研究結(jié)果一致，PVA材料固定酵母不但使酵母保持好的細(xì)胞活性和生產(chǎn)力，而且還使酵母能夠長(zhǎng)期廉價(jià)地保存，是工業(yè)應(yīng)用極具潛力的一種方法。

進(jìn)一步研究PVA含量對(duì)固定化酵母乙醇生產(chǎn)能力的影響，并對(duì)PVA包埋法固定化酵母（24 h）的乙醇產(chǎn)量、酵母細(xì)胞總數(shù)及其組織狀態(tài)進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 聚乙烯醇含量對(duì)的固定化酵母的影響Table 2 Effect of polyvinyl alcohol contents on immobilized yeast

由表2可知，當(dāng)PVA含量為8%時(shí)，固定化酵母細(xì)胞的乙醇產(chǎn)量（9.9%vol）及細(xì)胞總數(shù)（1.0×109CFU/g凝膠）均最高，凝膠組織狀態(tài)較好。因此，最佳PVA含量為8%。在此最佳固定化條件下，對(duì)PVA固定化酵母與游離酵母的乙醇生產(chǎn)能力進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 8%聚乙烯醇固定化酵母與游離酵母乙醇生產(chǎn)能力的比較Table 3 Comparison of ethanol production capacity between 8%polyvinyl alcohol-immobilized yeast and free yeast

由表3可知，8%PVA固定化酵母的乙醇生產(chǎn)能力高于游離酵母，分析原因可能是因?yàn)楣潭ɑ湍讣?xì)胞濃度高于游離細(xì)胞，所以乙醇生產(chǎn)能力顯著高于游離細(xì)胞（P＜0.05），說(shuō)明高濃度的酵母細(xì)胞也是實(shí)現(xiàn)高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵的重要策略之一[2，21]。

2.2 8%PVA固定化酵母的穩(wěn)定性

由于固定化酵母是一種生物活性載體，其活性盡管能重復(fù)增殖，但也有一定的時(shí)間，為了觀察其反應(yīng)的穩(wěn)定性，將8%PVA固定化酵母在1 L反應(yīng)容器中進(jìn)行分批發(fā)酵82批次，每次發(fā)酵48 h，共計(jì)使用164 d，隨機(jī)抽取7批次的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 8%聚乙烯醇固定化酵母的穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 4 Stability tests of 8%polyvinyl alcohol-immobilized yeast

由表4可知，相同發(fā)酵時(shí)間的各批次8%PVA固定化酵母的乙醇含量、乙醇生產(chǎn)能力重復(fù)性較好；經(jīng)分批發(fā)酵持續(xù)82批次，共計(jì)164 d的長(zhǎng)期使用，8%PVA固定化酵母的活性和機(jī)械強(qiáng)度保持不變，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，說(shuō)明PVA是一種優(yōu)良的固定化載體材料。

2.3 8%PVA固定化酵母的形態(tài)特征

為進(jìn)一步說(shuō)明PVA是比較適合細(xì)胞固定化的材料，對(duì)PVA固定化酵母和PVA材料進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 8%聚乙烯醇固定化酵母在光學(xué)顯微鏡（A）和掃描電鏡（B、C）下的形態(tài)Fig.2 Morphology of 8%polyvinyl alcohol-immobilized yeast by under optical(A)and scanning electron(B and C)

從圖2（A）可以看出，酵母鑲嵌在PVA固定化材料內(nèi)。從圖2（B）可以看出，固定化酵母在PVA材料中的生長(zhǎng)繁殖狀態(tài)，在開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)，一個(gè)酵母細(xì)胞占據(jù)一個(gè)網(wǎng)格，隨著酵母細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，網(wǎng)格擴(kuò)張，最后在網(wǎng)格洞中長(zhǎng)成一團(tuán)酵母細(xì)胞。表明PVA固定化材料有很好的張力，長(zhǎng)時(shí)間使用也不易破裂。從圖2（C）可以看出，PVA材料本身具有網(wǎng)狀、多空的特點(diǎn)，此特點(diǎn)有利于細(xì)胞的固定、有利于培養(yǎng)基的傳遞和通氣。綜上觀察，也證實(shí)了PVA是非常適合細(xì)胞固定化的材料。

2.4 8%PVA固定化酵母分批發(fā)酵

以游離酵母為對(duì)照，取分批發(fā)酵第82批的8%PVA固定化酵母，分別測(cè)定其在發(fā)酵0、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的乙醇含量、殘?zhí)呛亢徒湍讣?xì)胞總數(shù)的變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 8%聚乙烯醇固定化酵母和游離酵母發(fā)酵過(guò)程中乙醇、殘?zhí)呛康淖兓疐ig.3 Changes of ethanol and residual sugar content of 8%polyvinyl alcohol-immobilized yeast and free yeast during fermentation

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，乙醇含量不斷增加，殘?zhí)橇坎粩鄿p少，且乙醇含量越高，殘?zhí)橇吭降汀６?%PVA固定化酵母的乙醇產(chǎn)量顯著高于游離酵母，殘?zhí)橇匡@著低于游離酵母（P＜0.05）。根據(jù)工業(yè)生產(chǎn)對(duì)成熟醪液的要求，以發(fā)酵液乙醇含量達(dá)到7%vol～8%vol為標(biāo)準(zhǔn)，可以確定游離酵母的發(fā)酵周期為48～52 h，而8%PVA固定化酵母的發(fā)酵周期是22～26 h，發(fā)酵周期縮短一半，表明8%PVA固定化酵母的發(fā)酵速度高于游離酵母，與前期研究結(jié)果一致[10，15]。

8%PVA固定化酵母在發(fā)酵開(kāi)始，PVA凝膠中的細(xì)胞總數(shù)達(dá)到108CFU/g凝膠，且在發(fā)酵過(guò)程中仍有少量增殖，細(xì)胞總數(shù)保持在9.1×108CFU/g凝膠水平以上，是游離酵母細(xì)胞濃度的100多倍。研究發(fā)現(xiàn)，8%PVA固定化酵母發(fā)酵液中酵母總數(shù)要低于游離酵母的數(shù)倍，表明在發(fā)酵過(guò)程中起主要作用的是高濃度的固定化酵母，而不是從凝膠中泄露到發(fā)酵液中的少量游離酵母。因此，使得8%PVA固定化酵母具有高速發(fā)酵特性。

2.5 8%PVA固定化酵母連續(xù)發(fā)酵

由圖4可知，在120 d的連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，8%PVA固定化酵母一直保持穩(wěn)定發(fā)酵能力。發(fā)酵流出液中的殘?zhí)橇亢鸵掖籍a(chǎn)量保持平穩(wěn)，乙醇含量達(dá)到10%vol，平均殘?zhí)橇浚?%，平均乙醇生產(chǎn)能力＞20 mg/（mL·h）。PVA固定化酵母連續(xù)發(fā)酵乙醇的生產(chǎn)能力高于國(guó)內(nèi)外傳統(tǒng)發(fā)酵乙醇方法[10，12][2.0 mg/（mL·h）]和先進(jìn)的游離細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵[7 mg/（mL·h）]，因此，PVA固定化酵母不僅具有很高的反應(yīng)活性和很好的反應(yīng)穩(wěn)定性，而且載體具有十分理想的機(jī)械強(qiáng)度，PVA固定化細(xì)胞具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[9]。

圖4 8%聚乙烯醇固定化酵母連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中乙醇產(chǎn)量和殘?zhí)呛康淖兓疐ig.4 Changes of ethanol and residual sugar contents of 8%polyvinyl alcohol-immobilized yeast during continuous fermentation

3 結(jié)論

本研究采用海藻酸鈣凝膠法、瓊脂凝膠法、明膠-戊二醛交聯(lián)法和聚乙烯醇（PVA）包埋法對(duì)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1308進(jìn)行固定，通過(guò)對(duì)4種固定化方法進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，PVA是最佳固定化載體材料。PVA最優(yōu)添加量為8%，8%PVA固定化酵母生物具有較好的穩(wěn)定性。分批發(fā)酵其穩(wěn)定使用期＞164 d，可連續(xù)重復(fù)使用82批次以上。連續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性在4個(gè)月以上。其在分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，乙醇生產(chǎn)能力和穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酵母細(xì)胞。