補(bǔ)加碳源對采油菌株ZY-1生長及發(fā)酵液表面活性的影響

于亞男，王佳新，孫玉梅*

（1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.中國輕工業(yè)武漢設(shè)計工程有限責(zé)任公司，湖北 武漢 420100）

微生物采油（microbial enhanced oil recovery，MEOR）是通過向油藏注入微生物及營養(yǎng)源，或單獨(dú)注入營養(yǎng)物質(zhì)激活內(nèi)源微生物，使微生物快速生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物來提高石油采收率[1]。期間，微生物及其代謝產(chǎn)物能改變原油組成及其黏度和流動性，增大油層壓力和掃油面積[2]。

碳源對MEOR有重要影響[3]。研究表明，補(bǔ)加糖類碳源可以促進(jìn)采油微生物生長繁殖，降低原油利用率[4]。李清心等[5]以芽孢桿菌L-32利用原油產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物，降低原油黏度，補(bǔ)加葡萄糖會加快菌體生長，提高原油采收率。包木太等[6]利用5%淀粉水解液可以對油藏內(nèi)源有益采油菌烴類氧化菌（hydrocarbon-oxidizing bacteria，HOB）有較好的激活效果，菌體能維持較長的平穩(wěn)期并同時產(chǎn)酸和產(chǎn)表面活性物質(zhì)，從而增加油層壓力，降低原油黏度以及原油/巖石體系界面張力，提高殘油采收率。于海威等[7]在45℃厭氧篩選的驅(qū)油菌株SF67可以利用原油快速生長，降解飽和烷烴，降低含蠟量及界面張力，促進(jìn)原油采收。

深層油藏溫度較高，篩選耐高溫菌種及適宜營養(yǎng)尤為重要[8]。利用微生物產(chǎn)生的表面活性劑提高原油采收率有很好的應(yīng)用前景[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬耐高溫采油菌株ZY-1能產(chǎn)糖脂類陰離子表面活性劑[10]。本實(shí)驗主要研究該菌株利用不同碳源生長、產(chǎn)表面活性物質(zhì)以及對不同碳源的利用進(jìn)行比較分析，為深入研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗菌株

節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）菌株ZY-1：分離自遼河油田原油，在200 g/L甘油中于-80℃冰箱中保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

木糖、葡萄糖、石油醚、環(huán)己烷（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；液體石蠟、淀粉（化學(xué)純）：天津市博迪化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂20 g/L，蒸餾水1 L，pH值為7.0。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，蛋白胨10 g/L，蒸餾水1 L，pH值為7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：Na2HPO41.5 g/L，KH2PO43.4 g/L，NaNO34 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，酵母粉0.2 g/L，石蠟2 g/L，蒸餾水1 L，pH值為7.0。

培養(yǎng)基均在121℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

CR21G高速冰凍離心機(jī)：日本日立公司；WFJ 7200型可見光分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；Jzhy1-180界面張力儀：承德大華試驗機(jī)有限公司；GC-8900氣相色譜儀：山東滕州經(jīng)緯分析儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及種子液的制備

將-80℃儲存的菌種接于斜面培養(yǎng)基，于60℃活化24 h，得活化菌種。在種子培養(yǎng)基中接入2環(huán)/100 mL活化菌種，在60℃培養(yǎng)24 h，得液體種子。

1.3.2 菌株對不同碳源的利用效果

分別在不同碳源（石蠟2 g/L、木糖2 g/L＋石蠟2 g/L、葡萄糖2 g/L＋石蠟2 g/L、淀粉2 g/L＋石蠟2 g/L）的發(fā)酵培養(yǎng)基接入5%液體種子，60℃靜置培養(yǎng)7 d。每天定時取樣測定發(fā)酵液的菌體密度（OD600nm值），上清液的表面張力、乳化活性及石蠟的含量。

1.3.3 測定方法

菌體密度：根據(jù)濁度法測定[11]。

表面張力：以表面張力儀測定[12]。將棄油相發(fā)酵液3 000×g離心20 min，用表面張力儀測上清液表面張力。

乳化活性：在1.5 mL棄油相發(fā)酵液中加入1 mL石蠟，振蕩5 min后靜置24 h，測定乳化層和總液層高度[13-14]。乳化活性=乳化層高度/總液層高度×100%。

石蠟含量：采用氣相色譜法測定[15]。進(jìn)樣室：280℃，火焰離子化檢測器（flame ionization，F(xiàn)ID）：300℃，初始柱溫：80℃，升溫速度：5℃/min升溫至200℃維持2 min；再以8℃/min升溫至280℃維持30 min。進(jìn)樣量：0.2μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對菌株生長的影響

由圖1可知，以石蠟為碳源時，菌株ZY-1在發(fā)酵0～3 d時生長速度快，發(fā)酵3 d時菌體密度OD600nm值為0.60，隨后急降至OD600nm值為0.41，發(fā)酵7 d后菌體密度升至OD600nm值為0.62；以木糖＋石蠟為碳源時，菌株ZY-1在發(fā)酵1 d時菌體生長速度較快，隨后減慢，3 d后平穩(wěn)上升，發(fā)酵7 d時菌體密度升至OD600nm值為0.77；以葡萄糖＋石蠟、淀粉＋石蠟為碳源時，菌株ZY-1在發(fā)酵1 d時菌體生長速度較快，隨后生長緩慢，發(fā)酵7 d后菌體密度分別為OD600nm值0.29、OD600nm值0.31，且菌體生長量始終低于以石蠟為碳源時。因此，以木糖＋石蠟為碳源時有利于菌體生長。

圖1 碳源對菌株生長的影響Fig.1 Effect of carbon sources on the strain growth

2.2 不同碳源對發(fā)酵液表面張力的影響

由圖2可知，以石蠟為碳源時，發(fā)酵液表面張力在發(fā)酵2 d時降55.45 mN/m，發(fā)酵2～3 d時上升至62.6 mN/m，發(fā)酵7 d時發(fā)酵液表面張力降至52.3 mN/m；以木糖＋石蠟為培養(yǎng)基碳源時，發(fā)酵液在發(fā)酵2 d時表面張力快速下降，且整個發(fā)酵過程表面張力較低，在發(fā)酵7 d時發(fā)酵液表面張力降至50.45 mN/m；以葡萄糖＋石蠟、淀粉＋石蠟為碳源時，發(fā)酵液表面張力均在發(fā)酵3 d時降至最低，分別為45.9 mN/m、43.8 mN/m，發(fā)酵7 d時，表面張力分別降至49.5 mN/m、47.9 mN/m。因此，淀粉＋石蠟為碳源時最利于發(fā)酵液表面張力的降低，效果最好。

圖2 碳源對發(fā)酵液表面張力的影響Fig.2 Effect of carbon sources on surface tension of fermentation broth

2.3 不同碳源對發(fā)酵液乳化活性的影響

由圖3可知，以石蠟為碳源時，發(fā)酵液乳化活性在發(fā)酵2 d時升至41.6%，發(fā)酵2～4 d時下降至14%，發(fā)酵7 d時發(fā)酵液乳化活性升至55.7%；以木糖＋石蠟、淀粉＋石蠟為培養(yǎng)基碳源時，發(fā)酵液乳化活性均在發(fā)酵2 d時快速上升，分別達(dá)到61.3%、63.3%，且整個發(fā)酵過程乳化活性較高，在發(fā)酵7 d時發(fā)酵液乳化活性分別達(dá)到50%和60%。以葡萄糖＋石蠟為碳源時，發(fā)酵液乳化活性在發(fā)酵3 d時升至最高為63.3%，發(fā)酵7 d時乳化活性為46.6%。因此，以木糖＋石蠟、淀粉＋石蠟為碳源時更有利于發(fā)酵液乳化活性的升高。

圖3 碳源對發(fā)酵液乳化活性的影響Fig.3 Effect of carbon sources on emulsification of fermentation broth

2.4 不同碳源對發(fā)酵過程中石蠟消耗的影響

由圖4可知，菌株ZY-1以石蠟為碳源時，發(fā)酵0～3 d石蠟快速大量消耗，消耗了55%，發(fā)酵3～7 d消耗減慢，發(fā)酵7 d消耗石蠟72%，與菌體生長密切相關(guān)。在石蠟碳源培養(yǎng)基中外加糖類碳源，可以在發(fā)酵0～3 d明顯減慢對石蠟的消耗，其中木糖＋石蠟碳源消耗石蠟41%，淀粉＋石蠟消耗石蠟43%，葡萄糖＋石蠟碳源消耗石蠟54%，發(fā)酵7 d分別消耗石蠟61%、77%、79%。因此，與葡萄糖和淀粉相比，木糖更有利于減慢石蠟的消耗。

圖4 碳源對發(fā)酵過程中石蠟含量的影響Fig.4 Effect of carbon sources on paraffin content during the fermentation

3 討論

耐高溫采油菌株ZY-1以石蠟為唯一碳源進(jìn)行生長繁殖，產(chǎn)生的表面活性劑很少，加入糖類碳源可以促進(jìn)產(chǎn)物生成，表現(xiàn)在發(fā)酵液表面張力更低，乳化活性更高。同菌屬菌株23-1產(chǎn)脂肽類陰離子表面活性劑，也有相同的實(shí)驗結(jié)果[17]。菌株ZY-1以木糖-石蠟為混合碳源在整個發(fā)酵過程比單獨(dú)石蠟碳源的石蠟消耗慢且少，木糖的存在可以降低石蠟的利用速度和利用量，說明與石蠟相比該菌株更易利用木糖生長。這與菌株Acinetobacter BHSN以木糖為碳源更有利于細(xì)胞生長與合成生物表面活性劑的結(jié)果相似，而與同菌株以葡萄糖為碳源加快細(xì)胞生長速度，但對促進(jìn)生物表面活性劑合成效果不明顯的結(jié)果相反[18]。葡萄糖對提高伊朗油藏采收率作用顯著[19]。本研究石蠟分別與木糖、葡萄糖以及淀粉的混合碳源可不同程度的減慢菌株對石蠟的利用率，促進(jìn)生物表面活性劑合成效果明顯，使發(fā)酵上清液表面張力降至更低，乳化活性更高。在菌株Geobacillus toebii R-32639的采油模型中添加淀粉等營養(yǎng)源，可使原油表面張力降低25.3%，改善原油的流動能力，提高采收率[20]。本研究混合碳源發(fā)酵液的表面張力較之降低幅度更大，減慢發(fā)酵過程對原油的消耗，故有利于石油采收。

4 結(jié)論

補(bǔ)加碳源與單一石蠟作為培養(yǎng)基碳源相比更有利于促進(jìn)菌株代謝環(huán)境的表面張力降低以及乳化活性升高，其中木糖-石蠟碳源有利于促進(jìn)細(xì)胞生長OD600nm值為0.77，減少了11%的石蠟消耗，并且表面張力降至最低49.5 mN/m，乳化活性高達(dá)61.3%。葡萄糖-石蠟以及淀粉-石蠟碳源不能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長，但在發(fā)酵前期能減慢對石蠟的利用，明顯促進(jìn)生物表面活性劑的合成。在菌株ZY-1采油應(yīng)用中，宜利用木糖促進(jìn)合成生物表面活性劑，并減少短鏈烷烴的消耗，從而提高原油的采收率。添加葡萄糖和淀粉雖然不能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長，但由于其可以減慢對石蠟的消耗，并在一定程度上促進(jìn)生物表面活性劑的產(chǎn)生，對微生物采油也具有一定的應(yīng)用價值。