海洋低溫甾醇酯酶菌株的篩選鑒定及其酶學(xué)特性研究

任楠楠，王曉輝，遲乃玉，張慶芳*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

甾醇酯酶（EC 3.1.1.13），又稱為膽固醇酯酶，在生物體（如一些高等動物的臟器官、原生動物和微生物）中廣泛存在[1]。作為一種酯類水解酶，甾醇酯酶可催化甾醇酯水解生成甾醇和脂肪酸，同時，在適宜條件下也可通過酯化或酯交換反應(yīng)催化甾醇酯合成。甾醇酯酶可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工產(chǎn)業(yè)等[2]。在食品領(lǐng)域中，植物甾醇作為新資源，是食品研發(fā)的熱點，但植物甾醇在食品體系中會出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象，穩(wěn)定性也不及甾醇酯，因此考慮用甾醇酯酶將植物甾醇改性轉(zhuǎn)變成植物甾醇酯，制成功能性食品[3-5]；在醫(yī)藥方面，甾醇酯酶可作為工具酶制成試劑盒，測定膽固醇含量，但目前所使用的大多數(shù)試劑盒均來自進(jìn)口，價格昂貴[6]；在化工業(yè)中，甾醇酯酶可與脂肪酶聯(lián)合使用，解決“樹脂障礙”問題[7-9]。目前，國內(nèi)外已有關(guān)于微生物來源的甾醇酯酶的研究[10-11]，但是鮮見從海洋中篩選產(chǎn)甾醇酯酶的低溫菌株的相關(guān)報道，且國內(nèi)幾乎沒有相關(guān)商品化的甾醇酯酶的生產(chǎn)。

本研究擬從海洋環(huán)境中選育出一株能夠高產(chǎn)甾醇酯酶的低溫菌株，對該菌株進(jìn)行系列鑒定，初步探究其產(chǎn)酶特點，為后期海洋低溫甾醇酯酶的實際生產(chǎn)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

試驗菌株篩選自遼寧省大連渤海灣（N：39°7′，S：121°41′）的海泥海水樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌株初篩培養(yǎng)基：植物甾醇酯30.0 g/L，聚乙烯醇10.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl20.1 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，用0.22 μm的濾膜對0.1%羅丹明B過濾滅菌，加入培養(yǎng)基中，pH自然。

菌株復(fù)篩培養(yǎng)基：植物甾醇酯10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，pH自然。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

（Luria-Bertani）LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均在0.1 MPa、121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

植物甾醇酯：江蘇春之谷生物制品有限公司；羅丹明B：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase，COD）：上海源葉生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，POD）：生工生物（上海）股份工程有限公司；膽固醇亞油酸酯、4-氨基安替吡啉（4-aminoantipyrine，4-AA）：大連凱美化工工程配套有限公司；其他主要試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40BI壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HD-1360型超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司；BA410E生物顯微鏡：麥克迪奧實業(yè)集團(tuán)有限公司；雷磁PHS-3E pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HZP-256全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；Thermo K3型酶標(biāo)儀：北京昊諾斯科技有限公司；0.22μm一次性針頭濾器：生工生物（上海）股份工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

菌株初篩：稱取10.0 g樣品加入90 mL無菌水中，搖床振蕩30 min后過夜富集培養(yǎng)。用無菌水梯度稀釋富集菌液，取適宜濃度的菌液100μL均勻涂布于菌株初篩培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28℃倒置培養(yǎng)[12]，觀察培養(yǎng)基中菌株生長情況，挑取陽性菌落進(jìn)行純化并保存。

菌株復(fù)篩：將初篩得到菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)（200 r/min），檢測菌株產(chǎn)甾醇酯酶活性高低，逐步篩選出目的高產(chǎn)菌株[12]，作為本次試驗的出發(fā)菌株。

1.3.2 甾醇酯酶活性測定方法

根據(jù)甾醇酯酶活性的測定原理[13]進(jìn)行酶活性測定，具體操作參考曾誠等[14]的報道：分別配制底物溶液（在0.15 mol/L磷酸緩沖液中先后加入膽固醇亞油酸酯0.61 mmol/L，異丙醇8.0%，0.015 Triton X-100 mol/L，調(diào)節(jié)pH 為7.0）與4-AA-苯酚工作液（0.15 mol/L磷酸緩沖液中分別加入1.48 mmol/L 4-AA，3.0 IU/mL POD，0.5 IU/mL COD，0.01 mmol/L苯酚，pH 7.0），將兩者按照1∶2的比例混合，再加入適量酶液，充分混合后于37℃水浴條件下反應(yīng)15 min，以滅活酶液作為對照，測量波長500 nm處的紫外吸光度值，平行3次，取平均值。

酶活定義：在測定條件下，每分鐘催化1μmol底物水解所消耗的酶量為一個酶活單位（IU）。

1.3.3 菌株鑒定

（1）菌株形態(tài)學(xué)鑒定

將試驗菌株在固體培養(yǎng)基（LB瓊脂平板）上劃線，30℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌株單菌落形態(tài)特征，挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察單個菌株形狀、大小、排列方式等并拍照記錄。

（2）菌株生理生化特征鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]及《微生物實驗技術(shù)》[16]鑒定試驗菌株的生理生化特征。

（3）菌株分子生物學(xué)（16S rDNA）鑒定

提取復(fù)篩得到的試驗菌株的基因組DNA，以它為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），將反應(yīng)產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行電泳分析與雙向測序。在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站上的GenBank數(shù)據(jù)庫中，將測序結(jié)果通過BLAST與已知菌種的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對，確定目的菌株的種屬。選擇若干條同源性較高的已知菌株的序列，在MEGA6.06軟件中利用Neighbor-Joining法（Bootstrap參數(shù)為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。1.3.4酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

（1）甾醇酯酶最適作用溫度

依據(jù)甾醇酯酶活性的測定方法，分別在不同溫度條件下（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）對發(fā)酵得到的粗酶液進(jìn)行酶活測定[12]。將同組實驗中最高酶活的相對值設(shè)為100%，做3組平行實驗。

（2）甾醇酯酶的熱穩(wěn)定性

將發(fā)酵得到的粗酶液在不同的溫度條件下（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）水浴靜置2 h，立即冷卻，依據(jù)甾醇酯酶活性測定方法測定酶活，將同組實驗中最高酶活的相對值設(shè)為100%，做3組平行實驗。

（3）甾醇酯酶最適作用pH

分別向不同pH值（5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0）的緩沖溶液中加入發(fā)酵得到的粗酶液，依據(jù)甾醇酯酶活性測定方法測定酶活，將同組實驗中最高酶活的相對值設(shè)為100%，做3組平行實驗。

（4）甾醇酯酶的pH穩(wěn)定性

在最適作用溫度條件下，向不同pH值（4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0）的緩沖液中加入粗酶液，靜置2 h，依據(jù)甾醇酯酶活性測定方法測定酶活，將同組實驗中最高酶活的相對值設(shè)為100%，做3組平行實驗。

（5）不同化學(xué)物質(zhì)對甾醇酯酶活性的影響

以原始的發(fā)酵粗酶液為對照，設(shè)定其相對酶活為100%，向原始發(fā)酵粗酶液中分別加入一定濃度的各類化學(xué)物質(zhì)，測定甾醇酯酶活性，做3組平行實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

從渤海灣海泥海水樣品中初步篩選分離得到了7株具有甾醇酯酶活性的菌株，從中選取一株長勢良好、產(chǎn)甾醇酯酶活性較高的菌株，命名為Q-06。在-20℃條件下對菌株進(jìn)行甘油保藏，用于后續(xù)實驗。

2.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 菌株Q-06菌落形態(tài)（A）及顯微形態(tài)（B）Fig.1 Colonial morphology(A)and microscopic morphology(B)of strain Q-06

從圖1可以看出，菌株Q-06的單菌落較小，近似圓形，邊緣整齊，呈淡黃色，不透明，菌落濕潤，用接種環(huán)易挑??；在顯微鏡下可觀察到菌株呈桿狀，自由排列，革蘭氏染色結(jié)果呈陰性。

2.3 菌株生理生化特性

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株Q-06進(jìn)行生理生化試驗，結(jié)果見表1。

表1 菌株Q-06的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain Q-06

由表1可知，菌株Q-06生理生化特征如下：氧化酶試驗、接觸酶試驗呈陽性，能夠氧化分解葡萄糖，不能還原硝酸鹽，伏普（VP）試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、甲基紅（methyl-red，MR）試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗均呈陰性，精氨酸雙水解酶試驗、吲哚乙酸試驗呈陽性。根據(jù)菌株菌落形態(tài)特征，顯微觀察及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步鑒定該菌株為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）

2.4 分子生物學(xué)（16S rDNA）鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對菌株Q-06的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。由圖2可知，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)物序列長度為1 489 bp。

圖2 菌株Q-06 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Electrophoregram of 16S rDNA PCR amplification products of strain Q-06

將菌株Q-06的16S rDNA測序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，從中選出同源性高的序列與菌株Q-06的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對，用MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株Q-06與Pseudomonas fragi strain（NR 112077.1）相似系數(shù)接近100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚于同一分支。因此，可以鑒定菌株Q-06為莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）。

圖3 菌株Q-06的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Q-06 based on 16S rDNA sequences

2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 甾醇酯酶最適作用溫度

由圖4可知，當(dāng)作用溫度低于30℃時，該甾醇酯酶活性隨著溫度升高而逐漸增大，30℃為最適反應(yīng)溫度，酶促反應(yīng)溫度達(dá)到40℃后，酶活性急劇下降，在25～40℃的范圍內(nèi)，相對酶活可保持70%以上，溫度高于45℃時，相對酶活在50%以下。由此可以看出該甾醇酯酶對高溫條件比較敏感，并且在低溫條件下的活性相對較高。這一特性可能會有利于該低溫酶在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用[17]。

圖4 甾醇酯酶最適作用溫度曲線Fig.4 Optimal reaction temperature curve of the sterol esterase

2.5.2 甾醇酯酶的熱穩(wěn)定性

對發(fā)酵粗酶液進(jìn)行不同溫度的水浴處理，2 h后測定酶活性，結(jié)果見圖5。由圖5可知，發(fā)酵粗酶液在25～40℃條件下處理2 h后依然能保持高酶活性。但當(dāng)溫度由30℃逐漸升高時，酶活性呈逐漸下降的趨勢，在45℃處理2 h后，相對酶活不足40%。由此判斷，該菌株產(chǎn)酶的熱穩(wěn)定性較低。

圖5 甾醇酯酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermostibility of the sterol esterase

2.5.3 甾醇酯酶的最適作用pH及穩(wěn)定性

由圖6可知，該甾醇酯酶的最適作用pH值為7.0，為中性酶。當(dāng)pH值≤6.0或≥8.0時，酶活性較低；pH在6.5～8.0的范圍內(nèi)，其酶活可保持70%以上；觀察該甾醇酯酶的pH穩(wěn)定性折線可知，在pH 7.0～8.0的范圍內(nèi)，酶活可保持在80%以上，當(dāng)pH≥8.5時，活性迅速下降。由此可以判斷：在中性至弱堿性條件下，甾醇酯酶活性較高，較穩(wěn)定，即該甾醇酯酶有一定的耐弱堿性。

圖6 甾醇酯酶的最適pH及其pH穩(wěn)定性曲線Fig.6 Optimal pH and pH stability curve of the sterol esterase

2.5.4 不同化學(xué)物質(zhì)對酶活性的影響

由表2可知，不同的金屬離子對甾醇酯酶酶活性影響不盡相同。其中，Ag+有較強(qiáng)的抑制作用，Cu2+、Co2+、Mn2+、Fe3+也能不同程度地抑制甾醇酯酶活性，Zn2+、Mg2+、Ca2+對酶活影響比較微弱。金屬螯合劑乙二酸四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、蛋白質(zhì)變性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）均可對甾醇酯酶活性產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。

表2 不同化學(xué)物質(zhì)對甾醇酯酶活性的影響Table 2 Effect of different chemical substances on sterol esterase activity

3 結(jié)論

本研究所使用的出發(fā)菌株篩選自渤海灣的海泥海水樣品，先后通過初篩與復(fù)篩獲得了一株高產(chǎn)甾醇酯酶菌株，命名為Q-06。菌株Q-06經(jīng)過形態(tài)特征、生理生化實驗和16SrDNA序列分析等綜合檢測，被鑒定為莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）。初步探索其產(chǎn)甾醇酯酶的酶學(xué)特性，結(jié)果顯示，該菌株產(chǎn)甾醇酯酶的最適作用溫度和pH值分別為30℃和7.0。該酶屬于低溫酶類，但隨著溫度的變化，酶的穩(wěn)定性變差，并且該酶表現(xiàn)出一定的耐弱堿性；Ag+對酶的抑制性較強(qiáng)，Cu2+、Co2+、Mn2+、Fe3+也能不同程度地對甾醇酯酶活性產(chǎn)生抑制作用，而Zn2+、Mg2+、Ca2+則對酶的作用比較微弱，基本無影響；EDTA及SDS均對甾醇酯酶的活性表現(xiàn)出明顯的抑制性。與國內(nèi)外篩選的其他產(chǎn)甾醇酯酶的菌株相比[18-20]，該酶最適作用溫度低，在低溫下具有高酶活力及高催化效率。因此，菌株Q-06作為一株產(chǎn)甾醇酯酶的新菌源，具有潛在的開發(fā)價值。下一階段將從甾醇酯酶的分離純化及菌株產(chǎn)酶優(yōu)化等方面進(jìn)行深入探究，以期為甾醇酯酶的規(guī)模化發(fā)酵奠定理論基礎(chǔ)。