間充質干細胞治療急性移植物抗宿主病機制及應用進展

劉茂蘭 史明霞

1 昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科（昆明650032）；2云南省血液病研究中心（昆明650032）

異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是惡性或難治性血液疾病唯一可能治愈的方法，主要通過移植物抗腫瘤效應（graft-versus-leukemia，GVL）發(fā)揮作用。然而，allo-HSCT 后常伴有急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease，aGVHD）的發(fā)生。移植后aGVHD 的發(fā)生是患者非復發(fā)死亡的主要原因，嚴重影響患者的生存質量甚至威脅生命。aGVHD是遺傳上不相同的供體移植的免疫細胞識別HSCT 受體中的同種抗原并且被同種異體抗原激活時導致器官損傷的病理過程［1］。因此，抑制aGVHD 的發(fā)生是移植成功的關鍵。目前，標準的皮質類固醇激素治療的總體有效率為50%，各種免疫抑制劑治療的完全緩解率約為30%。盡管糖皮質激素及免疫抑制劑能部分控制aGVHD 的進展，但治療期間仍可產生嚴重的激素耐藥、繼發(fā)感染以及伴隨著移植物抗腫瘤效應（GVL）的減弱等，最終導致患者治療不耐受或者腫瘤的復發(fā)。因此改良治療方案，尋求新的治療策略迫在眉睫，而間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）作為新的治療aGVHD方法，臨床上已獲得顯著的療效。

MSC 具有支持造血、促進造血重建、低免疫原性及免疫負調節(jié)作用。其獨特的免疫負調控作用具體表現在可通過直接接觸和（或）分泌可溶性細胞因子途徑與幾乎所有免疫細胞，包括樹突狀細胞（dendritic cells，DC）、T 淋巴細胞、自然殺傷細胞（natural killer，NK）、B 淋巴細胞、巨噬細胞等相互作用，有效控制過激的免疫反應，但具體機制目前并不十分清楚。本文就近年來MSC 治療aGVHD 的相關作用機制研究進展及臨床應用作一綜述。

1 MSC 的抗aGVHD 的作用

目前認為aGVHD 發(fā)生的病理過程大致為：移植前預處理或炎癥引起組織損傷，使宿主細胞分泌炎性因子刺激抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APC）的成熟；APC激活供者T 淋巴細胞，促使其增殖和分泌多種細胞因子形成細胞因子風暴；炎癥因子募集并誘導效應細胞增殖，從而攻擊宿主皮膚、肝臟、腸道等靶器官產生aGVHD［2］。MSC 不管單獨靜脈注射或與移植物共同植入宿主體內，將因歸巢特性遷移至受損的靶器官起到修復組織的作用，減少炎性因子的釋放，同時因免疫負調控作用抑制機體過激的免疫反應，共同治療aGVHD。MSC 抗aGVHD 作用的具體機制目前尚未明確。近年的研究證實，移植后輸注MSC 可通過阻斷DC 分化成熟，抑制T 細胞增殖活化并促使T 細胞亞群向抑炎方向分化；誘導NK 細胞遷移而定向發(fā)揮其GVL 作用；促進調節(jié)性B 細胞（regulatory B cells，Breg）產生同時抑制抗體生成；誘導M2 型吞噬細胞的轉化，減弱其抗原呈遞，增加吞噬能力及促進組織修復，從而減輕或延緩aGVHD 的發(fā)生發(fā)展。

2 MSC 對DC 的免疫調節(jié)作用

DC 是專職抗原提呈細胞，可向T 細胞提供活化的協(xié)同刺激信號，誘導初始T 細胞的活化，同時DC 可介導免疫耐受，維持機體的穩(wěn)態(tài)。已知MSC 發(fā)揮其強大的免疫調節(jié)效應需要炎癥環(huán)境，如干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）、IL-1β 或腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等的刺激。此外，有報道提出MSC 來源的外泌體的活化需DC 介導。ZHANG 等［3］證明只有APC 刺激的CD4+T 細胞能成功誘導Treg。并且，這種誘導是外泌體及APC 劑量依賴性的。

DC 的成熟、識別并向T 細胞呈遞抗原的功能是aGVHD 疾病發(fā)展的第一步。有研究表明，MSC 分泌的細胞因子如前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、IL-6、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor，MCSF）和Jagged-2 等起著抑制DC 分化的作用。DENG 等［4］發(fā)現DC 成熟分化受到抑制并朝免疫耐受轉化，同時共培養(yǎng)后的DC 對LPS 刺激的反應降低。共培養(yǎng)體系中高表達IL-6，臍帶MSC 細胞表面高表達細胞因子信號抑制物1（suppressor of cytokine signaling l，SOCS l），通過免疫抑制劑及siRNA 證實MSC 分泌的IL-6 可上調SOCS l 的表達，并通過Janus 激酶/信號轉導子和轉錄激活子（janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）途徑激活SOCS1，從而阻斷DC 中Toll 樣受體（toll-like receptors ，TLR）4 信號通路，抑制DC 成熟分化。LIU 等［5］證實MSC 分泌抗炎蛋白腫瘤壞死因子刺激基因（tumor necrosis factor stimulating gene，TSG）-6 能抑制LPS 促進DC 的成熟。TSG-6 是通過抑制由LPS 誘導的DC 中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factor Κb，NF-κB）的信號傳導，從而抑制DC 的成熟和功能。

MSC 通過抑制DC 分化，同時減少主要組織相容復合物II 類分子（major histocompatibility complex II，MHC II）、CD40、CD80、CD86 的表達，抑制T 細胞的活化。MSC 還促使成熟DC 向不成熟逆轉，表現為降低IL-12、TNF-α 和IFN-γ 促炎因子的分泌，增加抑炎性細胞因子IL-10 的分泌。其中IL-12 的缺失誘導了T 細胞的無能和耐受，同時影響NK 細胞分泌INF-γ。脾臟基質細胞誘導的調節(jié)性DC（regulatory DC，DCreg），通過誘導T 細胞表面高表達凋亡相關因子配體（Fas ligand，FasL）促進其分泌IFN-γ，同時促使DCreg 產生一氧化氮（nitric oxide，NO）而誘導T 淋巴細胞凋亡［6］。此外，還可通過降低DC 中信號傳導及轉錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）的磷酸化而降低DC 中的CC 趨化因子受體7（CC chemokine receptor 7，CCR-7）和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMPs-9）水平，降低向外周淋巴結區(qū)域的遷移能力，減弱免疫排斥反應。MMPs-9 裂解T 細胞表面分子CD25，使得T 細胞對IL-2 的刺激無反應，從而抑制T 細胞的激活［7］。

3 MSC 對T 細胞的免疫調節(jié)作用

aGVHD 為自身免疫性疾病，主要的病理過程由活化的供者T 細胞大量活化、增殖產生炎癥風暴促成。在混合淋巴細胞反應、絲裂原刺激以及抗CD3 或CD28 抗體刺激的淋巴細胞反應體系中，MSC 均可抑制T 淋巴細胞的增殖，使T 細胞的細胞周期停滯于G0/G1 期。MSC 對T 細胞可通過直接接觸或分泌可溶性細胞因子的途徑發(fā)揮其作用，直接接觸途徑包括程序性死亡受體-1/程序性死亡配體-1（programmed cell death-1/programmed cell death ligand-1，PD-1/PD-L1）、Jagged-1、Fas/FasL、粘附分子等。其中，Fas/FasL 系統(tǒng)對于炎性疾病的MSC 治療是至關重要的。Fas 增強T 細胞的遷移，而FasL 激活T 細胞的凋亡途徑。Let-7a 是MSC 中Fas 和FasL 的 負 調 控 分 子，通 過 與 其mRNA 上3′UTR 端結合發(fā)揮作用。YU 等［8］利用RNA 干擾特異性敲低MSC 中Let-7a，從而增加細胞中Fas 和FasL 的表達水平，增強MSC 誘導的T 細胞遷移和凋亡，抑制炎癥反應，減輕實驗性結腸炎和GVHD 小鼠模型的組織損傷。

可溶性細胞因子的作用是被人們廣為研究的MSC 免疫調節(jié)途徑，不僅種類繁多，而且在人體中發(fā)揮重要作用。由MSC 分泌的可溶性因子主要有TGF-β、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、PGE-2、IL-4、IL-6、IL-10、吲哚胺2，3-二氧化酶（Indoleamine2，3-dioxygenase，IDO）、NO、人白細胞抗原-G5（human leucocyte antigen-G5，HLA-G5），以及新發(fā)現的胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、PD-L1 等。MIYAGAWA 等［9］發(fā)現培養(yǎng)的人MSC 的上清液對Treg 的誘導作用可通過添加IGF 增強，添加IGF 抑制劑而減弱。同時，在人MSC 培養(yǎng)上清中可檢測到IGF 的一種抑制劑-IGF 結合蛋白-4（IGFBP-4），由此得知機體可自發(fā)的調節(jié)以維持內環(huán)境的穩(wěn)定。PD-1是T 細胞活化和穩(wěn)態(tài)控制的重要調控因子。MSC 除了已知的細胞表面表達PD-1 的配體外，DAVIES 等［10］發(fā)現在MSC 暴露于IFN-γ和TNF-α介導的促炎環(huán)境時，還可分泌PD-L1、PD-L2。通過相應的阻斷試驗證實分泌的PD-L1 具有抑制CD4+細胞的活化，下調IL-2 分泌，并誘導T 細胞不可逆的低反應性和細胞死亡的功能。PD-1 介導的對T 細胞的抑制作用表現在T308 處蛋白激酶B（protein kinases B，AKT）磷酸化減少和AKT 隨后的轉錄因子Foxo3 的表達增加，這種作用可以通過阻斷PD-L1 而逆轉。

Treg 為CD4+CD25+Foxp3+的一類抑制性的T 細胞亞群，在抑制自身免疫及誘導免疫耐受方面發(fā)揮重要作用。在炎性環(huán)境下，MSC 可調節(jié)T 細胞亞群朝著抑炎方向分化，即調整輔助T 細胞（T helper cell，Th）Th1/Th2 向Th2 分化，促使Th17 通過細胞間接觸抑制激活其凋亡受體，并分泌PGE2、IDO 等可溶性細胞因子誘導Treg 產生。此外，分泌IL-10 的DCreg 可通過Notch 信號通路促進CD4+CD25-T 細胞向CD4+CD25+Treg 轉化以擴增Treg，共同促使機體產生免疫耐受。大量的文獻報道，穩(wěn)定的Foxp3 表達在Treg 的表型和功能穩(wěn)定性中起主要作用，但在特定的炎癥條件下，炎癥性Treg 可能會失去Foxp3 的表達并轉化為效應T 細胞。MSC 可通過細胞間接觸的方式增加Treg 特異性去甲基化區(qū)域的Runt 相關轉錄因子1（runt-related transcription factor 1，RUNX1）、RUNX3 和CBFβ復合物的表達，以增強Foxp3 的穩(wěn)定性；Runx-Foxp3 復合物的基因轉錄后調控，可誘導傳統(tǒng)T 細胞向Treg 轉化以此放大Treg 的免疫抑制功能［11］。IL-35 是IL-12 家族的最新成員，可通過誘導T 細胞無能和凋亡，以及誘導生成Treg 參與維持機體免疫耐受。IL-35 是一種可促進iTr35 細胞（誘導型Treg 的一種，具有抑制T 細胞的功能，但不表達Foxp3 和IL-10）生成的抑制性細胞因子。GUO 等［12］發(fā)現過表達IL-35，可增加Treg 細胞的增殖和抑制效應T 細胞的功能，減少同種異體移植物排斥反應的發(fā)生。WANG 等［13］通過在MSC 中過表達IL-35，發(fā)現MSC 可特異性遷移至損傷的肝臟組織，通過減少單核細胞的FasL 表達來阻止肝細胞凋亡，最重要的是通過JAK1-STAT1/STAT4 信號通路調控，降低肝臟單核細胞INF-γ的分泌，更好的發(fā)揮免疫抑制功能，有效的治療刀豆蛋白A 誘導的暴發(fā)性肝炎。

4 MSC 對NK 細胞的免疫調節(jié)作用

NK 細胞的生物學特性受到一組細胞表面受體（激活或抑制）和不同的促炎細胞因子（IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21）緊密調控。炎性細胞因子一旦激活NK 細胞，NK 細胞通過釋放穿孔素和顆粒酶以及分泌IFN-γ和TNFα介導抗體依賴的細胞毒作用及“自發(fā)的”殺傷作用［14］。同時，NK 表面的抑制性受體和相應的配體結合，可抑制NK 細胞的活化，維持機體的免疫耐受。在MSC 與NK 細胞體外共培養(yǎng)體系中，添加IL-2、IL-15 細胞因子可誘導的NK 細胞的增殖和裂解活性降低，同時分泌的IFN-γ和TNF-α明顯下調。而對于激活的NK 細胞，MSC 不能或只能部分抑制其增殖。由此可知，異基因移植效果與移植前NK 細胞是否激活的狀態(tài)相關［15］。

在HSCT 后早期重建階段，NK 細胞的抗腫瘤特性在GVL 應答中特別重要，尤其對于預防GVHD 進展和白血病復發(fā)。有研究者發(fā)現BM-MSC 觸發(fā)NK 細胞脫顆粒并增加其穿孔素和顆粒酶的釋放，激活的NK 細胞在BM-MSC 內誘導活性氧（reactive oxy gen species ，ROS）產生，導致絲氨酸B9 活性降低和表達減少，從而裂解自身或異體的MSC。由于IL-2 誘 導 的NK 細胞 表 達NKp30，NKG2D 和DNAM-1 天然細胞毒性受體，介導細胞毒活性。由此推測MSC 細胞表達ULBPs、PVR 和Nectin-2 已知天然細胞毒性配體［15］。

5 MSC 對B 細胞的免疫調節(jié)作用

MSC 可以使B 細胞增殖阻滯于細胞周期G0/G1 期，抑制B 細胞的成熟，從而減少IgM、IgG 和IgA 的產生。脂肪來源的MSC 還可抑制B 細胞分泌IgE，抑制機體過敏反應。 ROSADO 等［16］提出MSC 與T 細胞的直接接觸是MSC抑制B 細胞增殖、分化以及抗體產生的關鍵。MSC 還可抑制CCR7、CXCR4、CXCR5 及其配體CXCL13、CXCL12 的表達，從而改變B 細胞的趨化能力。

B 細胞在針對抗原的適應性免疫應答中具有核心作用，效應B 細胞是通過激活自身反應性T 細胞，產生促炎性細胞因子而促進自身免疫疾病的發(fā)展。Breg 是一群特殊的B 細胞亞群，以劑量依賴的方式通過產生IL-10，抑制CD3/CD28 刺激的自體CD4+T 細胞的增殖及干擾素-γ 產生，以維持免疫耐受性和抑制過激炎癥反應。由此看來，調節(jié)效應B 細胞和Breg 兩者之間的平衡是治療自身免疫性疾病的關鍵。

CHO 等［17］發(fā)現T-MSC 對B 細胞亞群的誘導是通過分泌IL-35 介導的，其中IL-35 中的EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）亞基起著至關重要的作用。已知，基質細胞衍生因子-1（stromal cell derived-factor-1，SDF-1）-CXCR7 軸能維持MSC 活性并發(fā)揮旁分泌功能。低劑量的SDF-1α 可促進免疫抑制功能，促進Breg 的生成及IL-10 的分泌。高劑量的SDF-1α 則發(fā)揮抑制作用［18］。

6 MSC 對巨噬細胞的免疫調節(jié)作用

巨噬細胞因局部微環(huán)境的不同表現出不同的功能表型，即促炎性巨噬細胞M1 和抗炎巨噬細胞M2。與MSC 共培養(yǎng)后，巨噬細胞除了表達激活的巨噬細胞標志CD206 和CD163 外，還增加了抑制性分子PD-L1 和PD-L2 的表達，同時增加了抑炎因子IL-6、TGF-β、精氨酸酶-1、CD73 的表達，降低促炎因子IL-12 和TNF-α的表達［19］。MSC 對巨噬細胞調節(jié)的具體的機制尚不清楚。BOUCHLAKA 等［19］發(fā)現與MSC 共培養(yǎng)的巨噬細胞（MEM）具有獨特的基因表達譜，其中IL-6 基因高表達。通過ELISA 證實MEM 比M2 的IL-6 蛋白高4 倍，并能被環(huán)氧化酶抑制劑，精氨酸酶抑制劑，JAK1/STAT1 抑制劑所緩解。由此可知，IL-6 的分泌部分受環(huán)氧化酶（cyclooxygenase2，COX2），精氨酸酶和JAK1/STAT1 三條不重疊的通路共同調控。此外，通過尾靜脈注射MEM 治療皮膚GVHD 小鼠及放射損傷的小鼠時，能顯著提高其生存率［19］。

7 MSC 治療aGVHD 的臨床應用

MSC在GVHD治療中最初的臨床應用是由LE BLANCE等［20］發(fā)起并證實MSC 治療aGVHD 的臨床安全性和可行性。這項研究推動了使用自體、單倍體相合或第三方HLA不相合的MSC 治療類固醇耐藥的難治性aGVHD 的臨床試驗的開展。由JCR 制藥公司將健康無關志愿者骨髓MSC 制備成藥物制劑（JR-O31），經過多中心Ⅰ/Ⅱ期及隨后進行的Ⅱ/Ⅲ期臨床研究表明，MSC 作為激素耐藥的aGVHD 患者的挽救性治療，可以成功改善患者臨床癥狀，延長生存期，且注射MSC 期間未出現遲發(fā)或嚴重的副作用［21］。用于治療全身性疾病的干細胞藥物Prochymal的Ⅲ期隨機雙盲研究表明，在臨床結果方面對照組（未行MSC 治療）和異基因MSC 組并無顯著差異。近期一項評估MSC 對類固醇耐藥的難治性aGvHD 的挽救性治療的研究報道激素耐藥的重度aGVHD 患者臨床癥狀得到改善，僅2 例患者（4.3%）出現急性短暫副作用（惡心/嘔吐和視力模糊）［22］。MSC 再次被推薦為類固醇耐藥難治性aGVHD 的挽救治療方案。

SALMENNIEMI 等［23］的前瞻性單臂研究中，發(fā)現長期的低存活率意味著MSC 治療不會在嚴重的aGVHD 中誘導免疫耐受，而是暫時打破GVH 反應的惡性循環(huán)。此外，大量類似的臨床研究得到類似的評估結果［24-25］。MSC 可以安全的應用于類固醇難治性的GVHD 的治療，輔以延長免疫抑制治療和高效的預防感染可以顯著改善MSC 的療效。

因患者的臨床反應與在aGVHD或組織損傷部位相關的生物標志物水平下降相關，有報道提出聯(lián)合監(jiān)測aGVHD生物標志物，如人再生胰島衍生蛋白3α（腸道GVHD）、細胞角蛋白18（cytokeratin18，CK18）（肝-腸GVHD）、Elafin（皮膚GVHD）等，可用于預測MSC 干預后的療效［26］。近期有研究提出CK18F，即由細胞角蛋白18 凋亡降解產生的細胞碎片，可提高急性肝-腸GVHD的預測效果［27］。此外，腫瘤抑制素2（suppression of tumorigenicity 2，ST2）不僅可用于預測aGVHD 發(fā)生，還可評估患者發(fā)生難治性GVHD 及移植后無復發(fā)死亡的風險，從而指導下一步治療［28］。

8 結語

MSC 因其獨特的生物學及免疫特性，已成為自身免疫疾病細胞治療的重要種子細胞。目前MSC 用于治療aGVHD 臨床試驗方面的應用取得了良好的效果，但涉及具體機制尚未清楚。目前所知的結論僅限于細胞及動物試驗，臨床研究只是冰山一角，太多的未知及尚未解決的問題，如怎樣避免移植后減輕aGVHD 的同時削弱GVL 效應、如何更準確的預判MSC 療效、MSC 的輸注時機等，需要更多的大型多中心隨機、對照、分層的研究才能具有針對性的解決問題，并取得突破性的進展。