循環(huán)腫瘤細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展

田程 許新華

1 三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（湖北宜昌443003）；2三峽大學(xué)腫瘤研究所/宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤科（湖北宜昌443003）

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）指自發(fā)或因診療操作脫離原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶的具有高活力、高轉(zhuǎn)移潛能，進(jìn)入外周血液循環(huán)的一類腫瘤細(xì)胞［1］。有研究表明［2］，CTCs 是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑，也是腫瘤篩查、診斷、預(yù)后、療效評估的重要標(biāo)志物。此外，也有學(xué)者表明［2-3］，CTCs 可以反映腫瘤細(xì)胞在特定疾病階段的異質(zhì)性，CTCs的基因型和分子特征有助于分析與治療相關(guān)的靶基因，識別具有潛在治療意義的新靶點(diǎn)分子，或發(fā)現(xiàn)潛在治療耐藥機(jī)制［4］。目前非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）仍然是全世界發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤［5］，同時(shí)也是免疫治療及靶向治療靶點(diǎn)基因最多的惡性腫瘤［6］。因此，可將CTCs作為腫瘤組織標(biāo)本之外的實(shí)時(shí)樣本進(jìn)行生物學(xué)特性研究，為NSCLC精準(zhǔn)個(gè)體治療提供指導(dǎo)。

1 CTCs 的捕獲方法研究

CTCs 檢測涉及兩方面的技術(shù)問題［7］，一是如何識別CTCs，二是如何從外周血中分離出來，目前在臨床運(yùn)用的CTCs 捕獲技術(shù)大致有如下幾種。

1.1 Cellsearch 系 統(tǒng) 根 據(jù)HAYES 等［8］、DANILA 等［9］、COHEN 等［10］的試驗(yàn)證實(shí)CTC 計(jì)數(shù)與乳腺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)，揭示CTC 的潛力后，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)CellSearch 系統(tǒng)作為唯一用于臨床檢測CTCs 的技術(shù)。Cellsearch系統(tǒng)是一種基于磁免疫和染色的免疫細(xì)胞化學(xué)法，首先用上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesionmolecule，Ep-CAM）抗體磁珠富集CTCs，并在強(qiáng)力磁場下從血液中提取細(xì)胞，將分離的腫瘤細(xì)胞固定并用熒光抗體染色的角蛋白鑒定，然后用半自動四色熒光顯微鏡細(xì)胞檢測分析儀進(jìn)行分析，最后把CKs 陽性和CD45陰性的有腫瘤細(xì)胞學(xué)特征的上皮細(xì)胞被定義為CTCs［11］。由于起源于上皮細(xì)胞的絕大多數(shù)肺癌都表達(dá)EpCAM，因此可以使用CTC、CXC和Profile試劑盒，利用與鐵水結(jié)合的抗EpCAM 抗體來檢測CTC，這種方法優(yōu)于單純使用EpCAM抗原富集CTC的技術(shù)［12］。

ONSTENK 等［13］將黑素瘤細(xì)胞黏附分子（melanoma cell adhesion molecule，MCAM）聯(lián)合EpCAM 作為細(xì)胞搜索富集標(biāo)記物以提高CTC 檢測率，研究顯示單純使用Ep-CAM 標(biāo)記物的CTC 檢出率為18%，MCAM 聯(lián)合EpCAM 檢測CTC 的檢出率則為25%，證實(shí)在Cellsearch 系統(tǒng)中使用MCAM 聯(lián)合EpCAM 作為富集標(biāo)記提高了CTCs 的檢測水平，但MCAM 陽性CTCs 在局限性或轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤治療過程中的變化是否與臨床結(jié)果相關(guān)，需要進(jìn)一步研究。此外，SOLER 等［14］指出，雖然Cellsearch 系統(tǒng)被認(rèn)為是目前較標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法，但其靈敏性仍有待提高，同時(shí)需要進(jìn)一步開展臨床研究以證實(shí)其在NSCLC 中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1.2 PT-PCR 檢測法 PT-PCR 檢測法通過檢測外周血中特異mRNA 來間接檢測CTCs，因?yàn)镃TCs 中存在某些只表達(dá)或高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞而不表達(dá)于正常外周血細(xì)胞的特異性mRNA，因此可以作為特異性標(biāo)記物識別CTCs［15］。TEWES 等［16］及AKTAS 等［17］等研究證實(shí)利用RT-PCR 技術(shù)可高靈敏檢測出CTCs 并評估轉(zhuǎn)移性乳腺癌和卵巢癌的患者預(yù)后。與CellSearch 系統(tǒng)等利用免疫抗原的檢測方法相比，PT-PCR 檢測CTC 的敏感性相對較高。除了篩查CTCs，PT-PCR 法還能進(jìn)一步將特異性的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后通過PCR 擴(kuò)增，以進(jìn)一步進(jìn)行基因表型分析。因此PTPCR 檢測法具有高特異性、定量的優(yōu)點(diǎn)，而且需要的樣本量較少，但該方法的不足之處是干擾基因過多、假陽性率高及難以保持反應(yīng)的穩(wěn)定性。

1.3 ISET 檢測法 該方法在2000年由VONA 等［18］提 出，其利用CTCs 與正常細(xì)胞大小的差異，用8 μm 孔徑的濾膜篩出預(yù)先固定的外周血后，再將循環(huán)腫瘤細(xì)胞免疫染色后進(jìn)行CTCs 計(jì)數(shù)及觀察分析細(xì)胞的形態(tài)特征［19］。LECHARPENTIER 等［20］采用ISET 富集CTCs，首次在非小細(xì)胞肺癌患者外周血中發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有上皮和間質(zhì)表型的混合CTC，進(jìn)一步揭示EMT 的意義以及轉(zhuǎn)移的機(jī)制。MAZZINI 等［21］通過ISET 對31 例葡萄膜黑色素瘤患者進(jìn)行CTCs 檢測，并在17 例患者中檢測出單個(gè)CTC 或CTC 細(xì)胞簇，證實(shí)CTC 有作為葡萄膜黑色素瘤患者預(yù)后不良標(biāo)志物的作用。ISET優(yōu)點(diǎn)是它能在不破壞細(xì)胞形態(tài)的情況下分離上皮細(xì)胞，這一特性與它的高敏感性有關(guān)。因此ISET廣泛適用于許多人類癌癥循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測。但與其他方法相比，ISET 法或許會漏檢部分體積較小的腫瘤細(xì)胞，需要對更多的細(xì)胞株和各種類型的腫瘤患者進(jìn)一步研究以確定ISET 應(yīng)用的范圍及大小閾值［22］。

1.4 其他檢測方法 CTCs 的數(shù)量在血液中處于極低水平，被數(shù)十億外周血細(xì)胞所掩蓋，因此CTC 檢測技術(shù)需要較高的敏感性，以捕獲稀少的CTC，同時(shí)也需要較高特異性，以排除血液中正常細(xì)胞［23］。檢測方法必須是可重復(fù)、快速、經(jīng)濟(jì)、有效，并且可以進(jìn)一步開展CTC 的單細(xì)胞基因表型的分析。

ZHANG 等［24］通過鐵磁抗體可以篩選高表達(dá)c-MET的循環(huán)腫瘤細(xì)胞原理開發(fā)了一種快速、無創(chuàng)、靈敏、特異的檢測MET 擴(kuò)增型腫瘤細(xì)胞的方法。該方法對c-MET 高表達(dá)細(xì)胞的敏感度40%～80%，對c-MET 陰性細(xì)胞特異度100%。鑒于c-MET CTCs 與MET 擴(kuò)增的相關(guān)性，c-MET CTCs 可能作為高表達(dá)cMET 的胃癌、結(jié)直腸癌和腎癌患者個(gè)體化治療的預(yù)測生物標(biāo)志物，但需要進(jìn)一步研究以確定其臨床可靠性。MURLIDHAR 等［25］報(bào)道了OncoBean 芯片技術(shù)，它利用不同的剪切系數(shù)使CTC 在高流率下通過不同的親和性篩選出來，從乳腺癌、胰腺癌和肺癌患者的血液標(biāo)本中檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)該技術(shù)的檢測CTC 的平均效率＞80%，其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值值得進(jìn)一步研究。

2 CTCs 在NSCLC 中的臨床應(yīng)用價(jià)值

目前臨床應(yīng)用的血清腫瘤學(xué)標(biāo)志物以及高分辨率的影像學(xué)（增強(qiáng)CT、PETCT 或者M(jìn)RI 等）檢查無法準(zhǔn)確的預(yù)判肺癌患者的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)［26］。而CTCs 不僅可以反映NSCLC 患者手術(shù)后亞臨床病灶的情況，還可以通過提取血液中的CTCs 進(jìn)行基因表型分析，為個(gè)體化治療決策提供依據(jù)［27］。

2.1 CTCs 捕獲在診斷中的應(yīng)用 CTCs 檢測對于肺癌的早期診斷有一定優(yōu)勢。有研究表明，當(dāng)影像學(xué)可探測的結(jié)節(jié)性病變癌癥病灶直徑＞1 cm時(shí)［28］，肺癌患者外周血液中已經(jīng)可以檢測到CTCs［29］。肺癌的診斷及分期對治療至關(guān)重要，是提高總體生存率的關(guān)鍵，而精準(zhǔn)診斷則為個(gè)體化治療提供了基礎(chǔ)。目前臨床主要通過組織活檢明確腫瘤的基因突變類型，但有研究顯示，CTCs 有助于明確肺癌原發(fā)病灶的基因表型狀況，有利于提高肺癌診斷的精準(zhǔn)性［4，30］。MARCHETTI 等［31］等對EGFR 基因在晚期肺癌組織及其外周血CTCs 上表達(dá)水平分析比較，發(fā)現(xiàn)EGFR 基因在活檢組織與CTCs 表達(dá)水平具有一致性。因此，隨著近年CTCs 檢測技術(shù)的不斷優(yōu)化，敏感度和特異性不斷提高，其有望成為肺癌早期分子診斷的有益方法及技術(shù)［32］。

2.2 CTCs 檢測在肺癌療效評價(jià)中的應(yīng)用 手術(shù)、化療、靶向治療、免疫治療是目前肺癌主要的治療手段，在疾病進(jìn)展或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)之前能否進(jìn)行有效評價(jià)是至關(guān)重要的。BAYARRI-LARA等［33］等前瞻性地分析了56 例NSCLC患者手術(shù)前和術(shù)后1 個(gè)月的CTCs 計(jì)數(shù)，術(shù)前每10 mL 外周血中平均有3.16 個(gè)CTCs，術(shù)后降低至0.66 個(gè)，且發(fā)現(xiàn)術(shù)后持續(xù)存在的CTCs 提示著腫瘤的早期復(fù)發(fā)（P=0.018）和較短的無進(jìn)展生存期（P=0.008），反映了CTCs 評估肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值。此外，CTCs 在實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤耐藥方向也有一定的作用。有研究發(fā)現(xiàn)［34-36］，當(dāng)EGFR基因20號外顯子（T790M）突變時(shí)，對TKIs治療有效的腫瘤即會發(fā)生耐藥，導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者病情進(jìn)展。因此，CTCs不僅可以評估治療效果，制定個(gè)體化的治療方案，甚至可以動態(tài)監(jiān)測腫瘤的耐藥狀態(tài)，進(jìn)而分析腫瘤耐藥機(jī)制。

2.3 CTCs 檢查在肺癌靶向及免疫治療中的應(yīng)用 迄今為止在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)包括EGFR、BRAF、HER2、PI3K、ALK、ROS1 和MET 等［5，37］。如今，在超過50%的肺癌患者腫瘤組織中都可以檢測到特定的驅(qū)動基因作為治療的靶點(diǎn)，包括KRAS、EGFR 的點(diǎn)突變，F(xiàn)GFR1 高表達(dá)和ALK 重組。NI 等［38］等通過Cellsearch 系統(tǒng)檢測了7 個(gè)肺腺癌患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并進(jìn)行全基因測序，該研究結(jié)果表明，在CTCs 中檢測到的單核酸變異（SNVs）都具有高度特異性，提示EGFR、PIK3CA、TP53 及RB1 等突變基因都可以通過CTCs 分析。因此，CTCs 捕獲聯(lián)合單細(xì)胞測序技術(shù)可以有效的評估患者的治療效果及早期監(jiān)測腫瘤耐藥情況［39］，但CTCs 中的基因突變能否能代表NSCLC 原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶的基因表型尚需要更多數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

MENG 等［40］等結(jié)合熒光原位雜交（Fish）技術(shù)檢測乳腺癌患者CTCs 中Her2 致癌基因的擴(kuò)增情況，他們發(fā)現(xiàn)通過原發(fā)性腫瘤分析確定的Her2 狀態(tài)與他們的檢測的CTCs 之間有不一致性。其他研究［41-42］通 過IF 和RT-PCR 分 析CTCs 及腫瘤組織上Her2 基因同樣證實(shí)了這一現(xiàn)象。這表明最初Her2 陰性的患者可能在進(jìn)展過程中發(fā)展為Her2 陽性的CTCs，同樣也可能證明了腫瘤的轉(zhuǎn)移伴隨者基因型的變化。

目前，采用Cellsearch系統(tǒng)與ISETVR技術(shù)相結(jié)合的CTC分析作為非小細(xì)胞肺癌患者靶向治療的預(yù)測性生物標(biāo)志物的臨床試驗(yàn)（如NCT02372448、NCT02827344、NCT02554448）預(yù)計(jì)在2年內(nèi)可能得出結(jié)論［43］。此外，有WANG 等［44］利用晚期NSCLC 患者中CTCs 表面的PD-L1 狀態(tài)，作為免疫治療的療效預(yù)測指標(biāo)。ILIE 等［43］等利用自動免疫染色法從106 例NSCLC 患者外周血中檢測CTCs，在80 例（75%）患者檢測出CTCs。在71 個(gè)可評價(jià)的樣本中比較腫瘤活檢組織與CTCs，發(fā)現(xiàn)CTCs 的PD-L1 狀態(tài)與腫瘤組織中的PD-L1狀態(tài)一致，提示CTCs 作為一種有效的液體活檢方法有評估晚期NSCLC 免疫治療的價(jià)值。

3 結(jié)論

在過去的20年中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面均取得了不少成果，其異質(zhì)性強(qiáng)、標(biāo)本獲取簡便、無創(chuàng)傷及可重復(fù)性等優(yōu)勢越來越被人們認(rèn)可，且CTCs 對肺癌診斷、預(yù)后評價(jià)、個(gè)體化治療有重要意義。如今基于CTCs 物理及生物特性的檢測技術(shù)呈多樣化發(fā)展，捕獲CTCs 的效率越來越高，從而促進(jìn)了單細(xì)胞基因測序及驅(qū)動基因相關(guān)研究，加快了CTCs 應(yīng)用于臨床的進(jìn)程。但是，目前循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測仍無法取代組織活檢在肺癌中金標(biāo)準(zhǔn)的地位，主要是檢測時(shí)機(jī)及cut off 值的判定、技術(shù)方法的規(guī)范性、CTCs 與原發(fā)腫瘤的生物學(xué)特征的一致性等諸多問題還需要更深入的研究來回答。但作為一種簡便可行的液體活檢技術(shù)在肺癌個(gè)體化治療中有很好的運(yùn)用價(jià)值前景。