飼用植酸酶活性測定關鍵控制點

于洪蓮

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519060）

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和飼料生產水平的提高，植酸酶作為一種綠色環(huán)保型添加劑廣泛應用于單胃動物飼料中，其通過催化將飼料原料中豐富的植酸及植酸鹽分解為能被動物利用的無機磷和肌醇，可有效提高植物性飼料中磷、礦物質元素和蛋白質的可利用率，提高動物生產性能，因此植酸酶在飼料生產中可定量取代或減少無機磷的添加量，在降低畜禽養(yǎng)殖成本的同時還減少了動物糞便中磷的排放量，減輕磷對環(huán)境污染。植酸酶的研究對解決環(huán)境污染和滿足營養(yǎng)需求方面有著重要意義。

飼用酶制劑活性分析與檢測在飼料工業(yè)中具有重要的作用，酶制劑生產企業(yè)通過檢測產品酶活力來監(jiān)控產品穩(wěn)定性，保證酶制劑產品品質，飼料生產企業(yè)需要通過檢測飼料產品中酶制劑的含量來驗證其添加效果（即飼料中酶的活力保存率），以保障飼料品質，因此酶活力的測定是控制酶制劑產品質量的關鍵環(huán)節(jié)，也是使用效果的基本保障。如何準確檢測植酸酶含量是許多飼用酶制劑工作者普遍關心的問題。本文以國標檢測方法為依據(jù)，綜述了植酸酶活力測定方法及檢測中關鍵控制點，以期為植酸酶的檢測提供可行性參考。

1 植酸酶活性測定的方法及原理

1.1 測定方法

《飼用植酸酶活性的測定分光光度法》是現(xiàn)行有效的飼用植酸酶活性測定的國標方法，即GB/T 18634-2009。本文以國標檢測方法為依據(jù)。

1.2 測定原理

依據(jù)國標檢測方法，其原理為：植酸酶在一定溫度和pH條件下，將底物植酸水解，生成正磷酸和肌醇衍生物。在酸性溶液中，能與釩鉬酸銨生成黃色的復合物，可于波長415 nm下進行比色測定[1]。

1.3 植酸酶活性單位

酶活性單位定義為：樣品在37 ℃、pH 5.5 的條件下，每分鐘從濃度為5.0 mmol·L-1植酸鈉溶液中釋放出1 μmol 無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示[1]。

2 植酸酶活性測定的關鍵控制點

影響植酸酶活性測定的因素很多，如標準曲線的繪制、試樣溶液的制備、乙酸緩沖溶液及底物植酸鈉溶液的配制、溫度、pH、反應時間、離心速度和時間的控制等，這些在酶促反應過程中直接影響反應速率。下面具體介紹飼用植酸酶活性測定的關鍵控制點。

2.1 標準曲線的繪制

嚴格按照實國標方法中規(guī)定繪制標準曲線，基準物磷酸二氫鉀需預先在（105±2）℃電熱干燥箱中干燥至恒重，標準品的稱量要使用感量為0.000 1 g的分析天平。標準曲線相關系數(shù)R2＞0.999，否則需重新繪制標準曲線。新配試劑或更換化驗員都需重新繪制標準曲線。

2.2 試樣溶液的制備

試樣溶液濃度對酶反應的影響：如果其他條件都是適宜的話，在一定范圍內隨著試樣溶液的濃度的增加，酶促反應速率隨試樣溶液濃度增加而加快，當試樣溶液達到一定濃度時，受底物數(shù)量限制，酶促反應速率將不再增加，酶活性的測定結果就不準確，因此要從以下幾方面控制試樣溶液濃度。

2.2.1 酶的提取

按國標的建議稱樣量稱取植酸酶試樣（包被植酸酶樣品需要研磨處理）兩份，精確至0.000 1 g，置于100 mL 容量瓶中，加入乙酸緩沖溶液搖勻并定容至刻度，放入一個磁力攪拌子，在磁力攪拌器上高速攪拌30 min。液體樣品無需提取直接稀釋備用。攪拌時間不夠或攪拌速度過低都會使得酶未完全提取引起檢測結果偏差，而提取過程攪拌速度過快會導致液體飛濺使得酶活檢測不準確，因此需要保證提取時間及適宜的攪拌速度。注意乙酸緩沖液含有曲拉通和牛血清白蛋白（BSA）成分，在轉移或振蕩過程中會產生較多的泡沫，所以在稀釋過程中應盡量避免因泡沫的體積誤差造成稀釋倍數(shù)低，導致檢測結果偏差。

2.2.2 試樣溶液稀釋

稀釋倍數(shù)的確定主要依據(jù)主要產品推薦酶活性或標示量、稱樣量和國標方法中要求的試樣溶液濃度確定的。國標方法中規(guī)定最終試樣溶液濃度應保持在約0.4 U·mL-1，試樣溶液稀釋倍數(shù)計算公式為：試樣溶液稀釋倍數(shù)=估計酶活力×稱樣量/0.4。如：植酸酶估計酶活力為5 000 U·g-1，稱樣量為1.0 g，其稀釋倍數(shù)=5 000×1.0/0.4=12 500。試樣酶在提取時已稀釋100倍，提取后的試樣在離心機上以4 000 r·min-1離心10 min，分取不同體積的上清液用緩沖溶液進行逐步進行稀釋至12 500倍，移液過程要求準確無誤，渦旋混合均勻。

2.3 乙酸緩沖溶液配制

乙酸緩沖溶液是確保整個酶促反應體系pH 的關鍵因素，需要準確配制后調節(jié)pH 為5.50。調節(jié)配制溶液pH 使用的酸度計必須校準，所用復合電極必須在使用壽命內。盡管乙酸緩沖溶液在密閉的容器內室溫下可存放2個月有效，但存放期＞1個月，建議重新確認pH，如果有變化，需要重新調節(jié)pH。

2.4 底物植酸鈉溶液的配制

2.4.1 底物植酸鈉的型號選擇

植酸鈉是影響植酸酶活性測定結果的重要因素，李富偉等研究顯示，不同型號的植酸鈉對測定結果的影響是顯著的[2]。因此在酶活性測定中需遵照《飼用植酸酶活性測定分光光度法》（GB/T18634-2009）中規(guī)定植酸鈉（相對分子質量為923.8、純度為95%）來選擇底物。在測定過程中，如果更換底物的生產廠家、型號及批次，必須對新的植酸鈉底物進行反復實驗校正，選擇適宜的植酸鈉底物以便得到正確和統(tǒng)一的酶活性測定結果，這樣才有利于確定植酸酶作為飼料添加劑時的準確添加量。

2.4.2 底物溶液濃度

底物濃度是植酸酶活性測定的關鍵要素。閔兆升等研究表明，底物濃度較低時不能使植酸酶完全催化，但高底物濃度對植酸酶的催化活性也有抑制作用[3]。在底物濃度為0～4.8 mmol·L-1時，酶促反應速率隨著底物濃度的增加而加快，反應速度與底物濃度近乎成正比；底物濃度為4.8～6.6 mmol·L-1時，反應速率變化不顯著，維持一個較平穩(wěn)的狀態(tài)；當?shù)孜餄舛龋?.6 mmol·L-1時，酶促反應速率隨底物濃度的增大而急劇減緩，說明高濃度底物對酶促反應存在抑制作用，因此需要依據(jù)國標要求控制底物植酸鈉溶液濃度，植酸鈉底物配制濃度為7.5 mmol·L-1，實際最終反應濃度為5 mmol·L-1，保證底物濃度是過量的，使得酶促反應充分，得到準確的植酸酶活性測定結果。

2.4.3 底物pH

植酸鈉是一種強堿性弱酸鹽，溶解于水后顯堿性。按國標要求使用乙酸緩沖液（1）配制的，但用已校準過的酸度計檢測配制后溶液的pH 已偏離5.50，實驗室配制完的底物溶液的pH 約為7.50，需用18%的冰乙酸溶液（避免使用低濃度乙酸調節(jié)pH）單向調節(jié)pH 至5.50。植酸鈉溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。另注意酸度計的日常維護，電極需浸泡在電極保護液中，測定過酶液、pH過高、pH過低或者黏度很大的樣品后，電極反應會變得遲鈍，所以一定要仔細沖洗電極，必要時電極需要用強酸浸泡清洗，還要用標準緩沖液校準，才能保證用配制的溶液符合植酸酶活性測定的要求。

2.5 溫度控制

在一定溫度范圍內酶促反應速度隨溫度的升高而加快，但當溫度升高到一定值時，酶促反應速度不再加快反而隨著溫度的升高而下降。植酸酶活性測定過程中溫度是非常關鍵因素，溫度過低或過高都會影響酶促反應速率，因此在檢測過程中溫度應控制在37 ℃。水浴鍋的溫度要用標準溫度計進行測量校準。保證試樣溶液及底物溶液按標準要求預熱。恒溫水浴鍋內水的液面要高于試管內反應液的液面。為了維持水浴的均衡，有條件的實驗室最好采用循環(huán)水流或振蕩水浴。

2.6 反應時間控制

酶活性測定過程中反應時間是一個非常重要的因素，要求各反應管反應時間一致均嚴格控制在30 min。為了確保獲得精確的測定結果，在反應過程中，從反應物混合開始準確計時，向每支試管中加入試劑的時間間隔要一致，且時間間隔要充足，預留出完成下步所需要的時間。

2.7 酶解反應終止及顯色液的配制

終止顯色液混合順序，1份鉬酸銨溶液+1份偏釩酸銨溶液，最后加入2份硝酸溶液混合均勻后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。使用溫水（50～60 ℃）配制偏釩酸銨溶液，易溶解且穩(wěn)定，配制好的溶液棕色試劑瓶避光保存。

2.8 離心速度和時間的控制

國標方法中規(guī)定酶促反應中之后，反應后的試液需在室溫下靜置10 min，如出現(xiàn)渾濁需在離心機上以4 000 r·min-1離心10 min。在日常實驗中發(fā)現(xiàn)室溫靜置或以3 000 r·min-1離心10 min，會導致檢測結果偏差，且標準曲線的吸光度不呈梯度。若以5 000 r·min-1離心10 min時，發(fā)現(xiàn)標準曲線各梯度的吸光度要低于以4 000 r·min-1離心10 min，因此在實驗中應嚴格控制空白管和樣品管離心速度和時間為4 000 r·min-1離心10 min。

2.9 紫外分光光度計測定吸光值

酶促反應結束后，應在1 h 內離心測定吸光度，取上清液以標準曲線的空白調零，在紫外分光光度計415 nm 波長測定試樣空白和試樣溶液的吸光值。注意試樣溶液與式樣空白必須澄清，不得有渾濁，測定前用待測溶液潤洗比色皿1次，減少誤差。吸光度應控制在0.2～0.4，此區(qū)間計算的結果誤差較小。在檢測植酸酶樣品時，酶活性的標示量與實際含量可能會差異很大，會導致吸光值或高或低，吸光值未在范圍內，需要重新調整試樣溶液的稀釋倍數(shù)再進行檢測。

2.10 檢測結果的判定

檢測結果是否準確、可靠、穩(wěn)定主要可通過以下幾方面進行衡量檢驗。

2.10.1 測定結果重復性

測定結果重復性主要是通過平行試樣測定結果間相對偏差大小來考證。標準要求同一試樣兩個平行測定值的相對偏差應≤8%，如超出這個范圍需要重新測定酶活性。

2.10.2 測定結果的再現(xiàn)性

不同工作日或不同分析人員間測定結果的分析比較來評價酶活性測定結果的再現(xiàn)性[4]。

2.10.3 測定結果的準確性

實驗室需要在測定時加1個已知活性的植酸酶參考樣，便于檢驗整個過程是否偏離。如果檢測中發(fā)現(xiàn)已知酶活檢測結果未在誤差范圍內，應查找原因后再安排檢測。在實驗室酶活測定過程中，存在很多隨機因素，每次實驗測定帶參考樣是一項非常有效的實驗室質量控制措施。

參考樣需兩位實驗員5 次平行實驗檢測獲得，取平均酶活力作為參考標準。對照樣要分裝密封置于-25 ℃急凍保存。

2.11 其他關鍵因素

2.11.1 要求無磷污染

測定過程中要使用無磷水。清洗實驗器皿要無磷的清洗劑，反應離心管清洗后需沸水浴5 min，使用1周后應洗液浸泡，避免平行樣偏差較大導致結果偏低。

2.11.2 對化驗員的要求

植酸酶活性的測定要求化驗員注重工作細節(jié)，例如試樣、試劑稱量或配制的精確性，pH 的調節(jié)的準確性，移液和計時的準確性，分析和解決問題的及時性。

3 小 結

植酸酶活性的測定在植酸酶產品的質量控制、產品標簽、酶活力保證及實際應用都有著重要的作用[5]。采用國標法測定植酸酶活性時應注意以上事項，以在檢測植酸酶活性中獲得準確和重復性好的分析結果。